专利名称：一种含耐热限制性内切酶的聚合酶链式反应方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术，特别是涉及对基因组DNA的聚合酶链式反应的方法和试剂盒。
背景技术：
聚合酶链式反应(PCR)是一种简单，快速，灵敏和专一的扩增特定DNA的方法。但是，标准PCR方法在扩增目标基因产物的同时往往伴随形成非专一产物，有时严重到比目标产物更强甚至抑制了目标产物的形成。所以，从扩增产物的单一性角度而言，标准PCR方法在专一性方面还存在着严峻的问题。正因为非专一扩增产物相当普遍地存在，就使得在PCR后用电泳分离或探针杂交等方法来鉴别和检测目标扩增产物成为常规和必要。这种复杂地PCR后检测步骤往往比PCR本身耗费更多的时间和劳力，极大影响了PCR在医学核酸检测上的广泛应用。
为了避免和减少非专一扩增产物的形成已建立了一套引物设计原则和顺序，应用引物设计软件从目标顺序中找出那些3’端碱基内部稳定性合适，与模板顺序假性结合率低于一定数值的引物，然后用BLAST等对初选的引物针对基因库顺序进行同源性分析。但是任何一个引物设计软件所能输入的顺序大小相当有限，而对于20个碱基左右的寡核苷酸顺序，BLAST也只能指出存在高度同源的非目标基因顺序。但实际上引物也可与并非高度同源的模板退火。所以，引物设计软件和BLAST固然有用，但往往仍不能预测和解决PCR的非专一扩增弊端。
近年来发展的各种热启动PCR技术能有效防止那些在室温下引物与非目标顺序结合引发反应而导至的非专一产物，但不能克服在通常PCR反应退火温度下仍
近年來發展的各种热启动PCR技术能有效防止那些在室温下引物与非目标顺序结合引发反应而导至的非专一产物，但不能克服在通常PCR反应退火温度下仍与引物结合的非目标顺序的干扰。本发明在反應液中加入一種或幾種不切割目標擴增產物順序同時又耐熱的限制性核酸内切酶，既不需要增加反應步驟又能完全消除或顯著减少非专一扩增产物形成。
发明构思
根據PCR的基本原理目標擴增產物和非專一擴增產物的形成必須滿足如下條件1.正、反引物能與模板退火。2DNA聚合酶能進入正、反引物退火部位。3正、反引物退火部位之間的模板順序是連續而不是斷開的。4.正、反引物退火部位之間距離不能大于DNA聚合酶在规定条件下的最大延伸长度，通常延伸步驟時間爲一分鐘在该时间内最多能延伸2000个碱基左右。如果将原始模板用不切割目標擴增片段的限制性核酸内切酶切割成較的小片段，則能促進DNA聚合酶進入引物退火部位有利目標產物的擴增，同時使非专一产物的擴增机会大大减小或完全消除。另一方面，耐熱限制性核酸内切酶能在50-75℃溫度下顯示活力，並能耐受75-95℃的高溫，這就使耐熱限制性核酸内切酶在反應的每一循環發生作用，而不必在反應之前增設保溫步驟。多種商品化耐熱限制性核酸内切酶的識別順序爲4至5個鹼基，試驗表明這些酶能在PCR反應溶液中保持功能，控制變性溫度爲75-95℃，在20-40個PCR反應循環後仍保持活力。理論計算和限制性核酸内切酶圖譜軟件分析均表明在幾百上千的目標基因中很容易找到一個幾十至幾百鹼基長的目標擴增產物，不被某一種或幾種耐熱限制性核酸内切酶所切割。
发明内容
发明所要解决的技术问题
本发明提供一種在反應液中添加耐熱限制性核酸内切酶的聚合酶链式反应方法和試劑盒，從而在不增加反應步驟的條件下，克服标准PCR方法往往形成非专一产物的缺陷，為在PCR后免除电泳分离或探针杂交等步驟来鉴别和检测目标扩增產物創造了條件。
技术方案
用引物設計軟件(如Oligo 6.0)和限制性核酸内切酶圖譜軟件(New EnglandBiolabs公司的NEBcutter，綱址www.neb.com)選擇引物。使擴增產物不含某一種或幾種耐熱限制性核酸内切酶的識别順序，優選考慮使擴增產物不含某二種或三種耐熱限制性核酸内切酶的識别順序；優選考慮耐熱性最強的酶如Pho I和PspG I；優選考慮識别順序短的耐熱限制性核酸内切酶如Mow I和Tsp509 I；優選考慮最適反應溫度在60-75℃的耐熱限制性核酸内切酶如BstN I和Tfi I；優選考慮擴增產物解鏈溫度低于85℃的引物對。反應液含有DNA聚合酶、緩沖液，dNTPs、引物、作為模板的基因組DNA或c-DNA。和上述所說的耐熱性限制性核酸内切酶。反應依次包括如下步驟
(1)模板变性；
(2)引物退火；
(3)DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；
(4)步骤(1)-(3)循环进行扩增反应；
反應完成後按常規電泳分離染色方法檢測擴增產物，也可採用各種非電泳染色的方法。
本發明可用于消除基因組DNA對RT-PCR的干擾，設計引物必須跨越至少一個内涵子，比較c-DNA擴增產物順序和基因組DNA擴增產物順序，找出切割基因組DNA擴增產物而不切割c-DNA擴增產物順序的耐熱限制性核酸内切酶。
本發明可用于崁套式PCR。設計外套引物和内套引物各一對，比較内套和外套擴增產物的順序，找出找出切割外套擴增產物而不切割内套擴增產物順序的耐熱限制性核酸内切酶。耐熱酶可在反應中途添加，或預先加在反應管内但不與反應液接觸。在内套反應開始時用物理方法使之進入反應液。
有益效果
1.PCR反應液含有耐熱限制性核酸内切酶可将基因組DNA切割成較小分子，從而克服由於空間位阻對形成最初目標擴增產物的影響，充分发挥引物与目標順序完全匹配，其結合強于各種非專一退火的優勢。
2.本發明不需要增加任何反應步驟，但能有效减少或消除标准PCR方法通常会形成的非专一产物。
3.可用于PCR和以RNA爲原始模板的一步或二步法RT-PCR。
4.本发明是基于随机性的原则來降低非專一擴增，除需要知道目标扩增产物的顺序外，不需要考虑其他各种背景、順序和数据。
5.与其他各种改善PCR专一性的技术如热启动，嵌套式PGR等完全兼容。
6.可用于反轉錄PCR消除基因組DNA干擾，也可用于崁套式PCR消除反應後期外套引物擴增的干擾。
具体实施例方式
实施例1.
实施例1以人beta-2-腎上腺素受體蛋白基因(3451碱基对，基因库编号m15169)爲目標基因。正反引順序和特性示于表1和表2
表1.实施例1引物順序
表2.实施例1引物特性
扩增产物长267碱基，解链温度92.5℃。限制性内切酶圖譜分析表明擴增產物内有二個BstNI切點(17和240)，二個MwoI切點(39和74)，二個PhoI切點(33和243)和二個PspGI切點(15和238)。PCR和RT-PCR反應所需的人基因组DNA(每微升0.1微克)，人組織总RNA(每微产品升1.0微克)，Advantage2-PCR试剂盒及反转录试剂盒合均爲为BD ClonTech公司產品。每100微升反应液加基因组DNA或c-DNA5微升，c-DNA用試劑盒提供的Oligo(dT)引物合成。反應液引物终浓度为0.4uM。每管反應體積5微升。PCR反应首次变性95℃1分钟，循环变性95℃10秒，退火和延伸溫度64-75℃時間均爲一分鐘，反應共40個循環。對照管不加任何限制性核酸内切酶，試驗管分別加耐熱限制性核酸内切酶PspG1或PhoI 2微升/50微升反應液内切酶均爲New England Biolabs產品。试验结果列于表3。
表3.实施例1试验结果
結果說明限制性核酸内切酶PspG1和PhoI在PCR反應液中及至少在64-75℃的溫度範圍内具有活力，並能耐受40個循環的95℃高溫變性。
实施例2
实施例2的目標基因，所用核酸和反應試劑盒等均與實施例1相同。正反引順序和特性示于表4和表5。
表4.实施例2引物順序
表5.实施例2引物特性
扩增产物长172碱基，解链温度79.9℃。限制性内切酶圖譜分析表明擴增產物内有二個BstNI切點(37和87)。PCR反应首次变性78-94℃一分鐘，循環變性78-94℃10秒鐘，退火60℃一分鐘，延伸68℃30秒鐘。對照組不加酶，試驗組每100微升反應液加酶2微升。
试验结果列于表3。
表6.实施例2试验结果
結果說明變性溫度太低擴增產物不能完成變性，對照組和試驗組均無擴增產物形成。變性溫度太高限制性核酸内切酶BstNI失活，對照組和試驗組均形成擴增產物，控制適當的變性溫度對照組形成苦增產物而試驗組沒有擴增產物形成。
实施例3
实施例3以人bRAF基因(2513碱基对，基因库编号NM_004333)爲目標基因。RT-PCR所用反應試劑盒等均與實施例1相同。正反引順序和特性示于表7和表8
表7.实施例3引物順序
表8.实施例3引物特性
扩增产物长142碱基，解链温度82.3℃。限制性内切酶圖譜分析表明擴增產物内有二個MwoI切點(105和114)。PCR反应首次变性81-94℃一分鐘，循環變性81-94℃10秒鐘，退火60℃一分鐘，延伸70℃30秒鐘。對照組不加酶，試驗組每100微升反應液加酶2微升。
试验结果列于表9。
表9.实施例3试验结果
結果說明變性溫度太低擴增產物不能完成變性，對照組和試驗組均無擴增產物形成。變性溫度太高限制性核酸内切酶MowI失活，對照組和試驗組均形成擴增產物，控制適當的變性溫度對照組形成苦增產物而試驗組沒有擴增產物形成。
实施例4
实施例4的目標基因爲人beta肌動球蛋白基因(1841碱基对，基因库编号BC016045)。所用核酸和反應試劑盒等均實施例1相同。正反引順序和特性示于表10和表11
表10.实施例4引物順序
表11.实施例4引物特性
扩增产物长179碱基，解链温度79.4℃。限制性内切酶圖譜分析表明擴增產物内沒有MwoI，BstNI，PhoI和PspGI切點。PCR反应首次变性85℃一分鐘，循環變性85℃10秒鐘，退火55℃一分鐘，延伸68℃30秒鐘。試驗組加任何二種或三種上述酶的組合擴增後結果均顯示專一目標擴增條帶。
实施例5
实施例5的目標基因爲人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(1283碱基对，基因库编号XM_006959)。RT-PCR所用反應試劑盒等均實施例1相同。正反引順序和特性示于表12和表13
表12.实施例5引物順序
表13.实施例5引物特性
扩增产物长166碱基，解链温度87.1℃。限制性内切酶圖譜分析表明擴增產物内沒有PhoI和PspGI切點。PCR反应首次变性90℃一分鐘，循環變性90℃10秒鐘，退火60℃30秒鐘，延伸72℃一分鐘。反應液加PhoI和PspGI每100微升反應液各2微升，反應後電泳染色顯示專一擴增條帶。
实施6爲嵌套PCR其目標基因也爲人beta肌動球蛋白基因，RT-PCR反應試劑等均與實施例1相同。内套引物和外套引順序和特性示于表14和表15
表14.实施例6引物順序
表15.实施例6引物特性内套和外套引物的擴增產物长分別爲173和652碱基，解链温度分別爲79.4和85.0℃。限制性内切酶圖譜分析表明内套擴增產物沒有PhoI識別順序，而外套擴增產物有4個PhoI切割位點(44，102，341和460)。PCR反应首次变性90℃一分鐘，循環變性90℃10秒鐘，最初20循環退火和延伸72℃一分鐘。後20循環退火62℃一分鐘，延伸72℃一分鐘。在反應進行20循環後加PhoI，或在反應管内預加酶但不與反應液接觸反應進行20循環後在閉管條件下用物理方法使之進入反應液。結果得到專一内套擴增產物，不加酶對照組同時有外套擴增產物。
权利要求
1.一种含耐熱限制性核酸内切酶的聚合酶链式反应方法和試劑盒，反應液模板為基因組DNA或cDNA，反應依次包括如下步骤
(1)模板变性；
(2)引物退火；
(3)DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；
(4)按步骤(2)-(4)循环进行扩增反应。
其特徵在于反應之初或反應中間在反應液中加至少一種耐熱限制性核酸内切酶，所加入的酶在目標擴增產物内没有識别順序
2.根据权利要求1所述的含耐熱限制性核酸内切酶的聚合酶链式反应方法和試劑盒，用于RNA為原始模板的反轉錄聚合酶链式反应，相應地在1所述反應之初增加反轉錄步驟。
3.根据权利要求1和2所述的含耐熱限制性核酸内切酶的聚合酶链式反应方法和試劑盒，含有二種以上的耐熱限制性核酸内切酶。
4.根据权利要求1至3所述的含耐熱限制性核酸内切酶的聚合酶链式反应方法和試劑盒，所述的耐熱限制性核酸内切酶是最適作用温度在75-85℃，并能在95℃高温下存活的酶，包括但不限於ApeK I、Pho I和PspG I。
5.根据权利要求1至3所述的含耐熱限制性核酸内切酶的聚合酶链式反应方法和試劑盒，所的耐熱限制性核酸内切酶是最適作用温度為50-65℃，能耐80℃以上高温的酶，包括但不限於BstN I、BstU I、Mwo I、Tfi I、TseI、Tsp45 I、Tsp509 I和TspR I。
6.根据权利要求1至5所述的含耐熱限制性核酸内切酶的聚合酶链式反应方法和試劑盒，所説的試劑盒含有完成PCR反應必要的試劑和至少任意一種以上所述的耐熱限制性核酸内切酶。
7.根据权利要求1至6所述的含耐熱限制性核酸内切酶的聚合酶链式反应方法和試劑盒，用于反轉錄聚合酶链式反应，所述的引物至少跨越一個内含子，而所述的酶切割内含子順序。
8.根据权利要求1至7所述的含耐熱限制性核酸内切酶的聚合酶链式反应方法和試劑盒，用于崁套式聚合酶链式反应，所述的酶切割内套與外套擴增產物之間的順序。
9.根据权利要求1至8所述的含耐熱限制性核酸内切酶的聚合酶链式反应方法和試劑盒，所述的試劑盒含有完成PCR反應必要的試劑，所述的耐熱限制性内切酶由任意二種或任意三種上述酶組合而成。
10.根据权利要求1至9所述的含耐熱限制性核酸内切酶的聚合酶链式反应方法和試劑盒，可用于各種實時熒光PCR。
全文摘要
一种含耐热限制性核酸内切酶的聚合酶链式反应方法和相应的试剂盒。选择引物对的位置使扩增产物不含有所述的耐热限制性核酸内切酶识别顺序，或根据既定的扩增产物的限制性内切酶图谱选择含不同内切酶组合的试剂盒。本发明可在不增加保温或其他步骤的情況下完全消除或显著降低非专一扩增产物的形成。根据所用限制性核酸内切酶的耐热程度选择引物，使扩增产物的Tm比内切酶的最高耐热温度稍低并控制循环变性温度与之相适应。发明可用于反转录聚合酶链式反应降低非专一产物或消除基因组DNA对扩增的干扰，也可用于崁套式PCR在后期阻断外套引物的扩增。
文档编号C12Q1/68GK1858218SQ20051002563
公开日2006年11月8日 申请日期2005年4月30日 优先权日2005年4月30日
发明者徐定邦, 谢文凯, 府雷宇 申请人:徐定邦, 徐文慧