专利名称：活体分枝杆菌快速鉴定试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生物医学检测技术领域，具体涉及一种快速鉴定活体分枝杆菌的试剂盒。
背景技术：
分枝杆菌是一类广泛分布于自然界的细菌，多数为腐生菌，少数可使人和动物致病。近年来，国内外普遍报道分支杆菌的感染日益严重，特别是免疫功能低下患者继发感染、以及医院内感染的暴发流行显著增加。通常能引起人类感染的分枝杆菌主要有耻垢、堪萨斯、鸟、胞内、偶然、结核、龟、脓肿、海、溃疡、瘰疬等，它们可以引起人体各个器官及全身各部位的严重感染，给人体健康带来极大危害。由于细菌学检查是诊断分枝杆菌所致疾病的确诊依据，因此快速准确的分枝杆菌活体检查极为重要。
目前，传统的分支杆菌活体检查方法就是细菌培养。通常是将待检标本接种至改良罗氏培养基进行培养，待菌落生长后再依据生物学特征及生化反应多项指标综合判断。这种鉴定方法通常需时1-4周，而且操作烦琐、准确性差，因此远不能满足临床诊治的需要。急需建立快速、简便、准确的分支杆菌活体鉴定方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能快速、简便、准确地鉴定分枝杆菌活体的试剂盒。
本发明提出的鉴定分枝杆菌活体的试剂盒，由下述组份组成(1)前处理液为一种含有氯化钙、氯化镁和广谱抗生素的分枝杆菌液体培养基；(2)分枝杆菌病毒体为一种从污水中分离的能感染高浓度活体分枝杆菌的病毒，能被感染的分枝杆菌有丁酸、偶然、胞内、金色、耻垢、脓肿、结核、龟、草分枝杆菌等；(3)稀释剂为1-3％的硫酸溶液；(4)指示平皿为含有快速生长菌的琼脂平皿。
本发明中，前处理液的分枝杆菌液体培养基可采用市售的米氏7H9培养基，其中氯化钙、氯化镁和广谱抗生素的配比关系为在1000ml米氏7H9培养基中，氯化钙1-2克，氯化镁1-2克，广谱抗生素75-150克(例如氨苄青霉素25-50克，二性霉素B25-50克，阿洛西林25-50克等)。
本发明中，指示平皿中所含的快速生长菌可以是草分枝杆菌或金色分枝杆菌液。
本发明提出快速鉴定分枝杆菌活体的试剂盒的使用方法如下(1)将待检分枝杆菌处于感染态状态，并被分枝杆菌病毒体感染；
(2)将感染物经离心、洗涤，沉淀移至指示平皿上温育；(3)根据指示平皿细菌裂解情况判定结果。
本发明采用污水中分离的分枝杆菌病毒体，并与前处理液、稀释液和指示平皿一起组成活体分枝杆菌快速鉴定试剂盒。该发明的原理是通过制备感受态细胞方式，将待检菌株处于易感状态，并被分枝杆菌病毒体感染，病毒体在感染菌中增殖、并将感染菌裂解，释放出的病毒体立即感染指示平皿中的指示菌、并使其裂解，在指示平皿上出现肉眼可见的透亮圈。如待检样品不含活体分枝杆菌，则分枝杆菌病毒体随上清液的丢弃和硫酸作用而失活，指示菌未受病毒体感染，因此指示平皿不会出现透明圈。
由于处于感受态的活体分枝杆菌易被相应的病毒体感染，而且指示菌生长快速、结果容易观察，因此本法快速、简便，非常适用于基层卫生部门。同时只有活菌才能被病毒体感染，而且感染结果是将活菌裂解，因此本法既可鉴定活体分枝杆菌，又可保护实验人员免受感染。
具体实施例方式
1.前处理液的配制在1000毫升市售的米氏7H9培养基中，分别加入氯化钙1～2克、氯化镁1～2克、氨苄青霉素25～50克、二性霉素B 25～50克、阿洛西林25～50克，无菌滤膜过滤后即为前处理液。
2.指示平皿的制备取1.5～3％浓度的熔化琼脂6～8毫升，加入到市售的一次性无菌平皿中，再加入6～8毫升的液体培养基和1～2毫升的快速生长的草分枝杆菌或金色分枝杆菌菌液，混匀、凝集成型后即为指示平皿。
3.活体分枝杆菌的快速鉴定方法(1)在待检样品(污水、药液、食物、工作人员的手、珍疗器械等的浸泡液或可疑患者的脓、血、便、尿、痰、穿刺液、分泌物等)中加入10～20毫升的前处理液，在每分钟8000～10000转的条件下离心5～10分钟；(2)取出待检样品管，弃去上清，沉淀中再次加入10～20毫升的前处理液，在每分钟8000～10000转的条件下离心5～10分钟；(3)取出待检样品管，弃去上清，吸取沉淀0.1～0.2毫升加入到含有分枝杆菌病毒体的1毫升反应管中，35-38℃温育50-70分钟；(4)吸取1毫升稀释剂加入到上述反应管中，混匀，在每分钟5000-6000转的条件下离心5-10分钟，弃去上清；(5)吸取沉淀30～50微升，滴于指示平皿上的某一区域，35～38℃培养15～20小时观察结果；
(6)结果判断在指示平皿上的滴样区域出现全透或半透明圈，表明待检样品中存在活体分枝杆菌，反之为不存在活体分枝杆菌。
权利要求
1.一种快速鉴定活体分枝杆菌的试剂盒，其特征在于由下列成份组成(1)前处理液为一种含有氯化钙、氯化镁和广谱抗生素的分枝杆菌液体培养基；(2)分枝杆菌病毒体为一种从污水中分离的能感染高浓度活体分枝杆菌的病毒；(3)稀释剂为1-3％的硫酸溶液；(4)指示平皿为含有快速生长菌的琼脂平皿。
2.根据权利要求1所述的快速鉴定活体分枝杆菌的试剂盒，其特征在于所述前处理液的分枝杆菌液体培养基采用市售的米氏7H9培养基，其中氯化钙、氯化镁和广谱抗生素的配比关系为在1000ml米氏7H9培养基中，氯化钙1-2克，氯化镁1-2克，广谱抗生素75-150克。
3.根据权利要求1所述的快速鉴定活体分枝杆菌的试剂盒，其特征在于所述指示平皿中的生长菌为草分枝杆菌或金色分枝杆菌。
4.一种权利要求1所述的快速鉴定活体分枝杆菌试剂盒的使用方法，其特征在于具体步骤如下(1)将待检分枝杆菌处于感染态状态，并被分枝杆菌病毒体感染；(2)将感染物经离心、洗涤，沉淀移至指示平皿上温育；(3)根据指示平皿细菌裂解情况判定结果。
全文摘要
本发明属生物医学检测技术领域，具体分析为一种快速鉴定活体分枝杆菌的试剂盒。该试剂盒由前处理液、分枝杆菌病毒体、稀释剂和指示平皿所组成。可在24小时内即可鉴定待检样品中是否存在活体分枝杆菌。可用于各种待检样品中的活体分枝杆菌检测。本试剂盒操作简便、不需特殊仪器设备，结果观察容易，非常适合基层卫生单位应用。
文档编号C12Q1/04GK1699591SQ20051002561
公开日2005年11月23日 申请日期2005年4月29日 优先权日2005年4月29日
发明者胡忠义, 倪莲娣, 靳安佳, 崔振玲, 王洁 申请人:上海市肺科医院