专利名称：一种含持家基因的双重反转录聚合酶链式反应方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学技术，特别是涉及定量比较基因表达的反转录聚合酶链式反应方法。
背景技术：
基因表达的定量比较研究例如检测细胞或组织在药物处理、放射线照射或化学试剂处理后某一特定基因在mRNA水平上的变化，是新世纪分子生物学和临床诊断的重要课题。为进行比较需要从被比较的样品中提取总RNA或mRNA，测定RNA的含量并调节各个样品的RNA浓度至相同，然后反转录得到cDNA再进行PCR扩增，最后比较不同样品的扩增产物数量的多少。由于RNA分离纯化过程中难免有不同程度的RNA部分降解和少量的蛋白质污染，加之反转录合成cDNA和PCR合成扩增产物时往往存在管与管之间的差异，往往不同的样品即使由同一个人、按同一个方法并同批操作，也会因管与管之间存在的差异而使结果不可靠。由于持家基因的表达量不因药物处理等而改变，在基因表达的定量比较研究时通常以持家基因的扩增产物量来校正被测基因的表达量。被广泛应用的持家基因至今仅限于beta-肌动球蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)和核糖体RNA(如16s-rRNA)等。前二种持家基因在各种细胞中转录中等丰度的mRNA，其表达量比占基因总数90％以上的低丰度mRNA高一至几个数量级，而细胞中核糖体RNA的含量则更远远高于各种被测基因的表达量。由于凝胶上DNA荧光检测的灵敏度低而PCR扩增又普遍有平台现象，使得持家基因的应用受到严重限制或流于形式。如果PCR采用较少的循环数则目标基因的扩增量不能被检出，反之采用较多的循环数因持家基因扩增早已进入平臺而失去了校正的价值。本发明提出了一种简单有效的办法克服了大多数目标基因和持家基因表达量相差太大、实际上无法应用持家基因方法来校正的问题。實時熒光定量PCR根據到達閥值的循環數來比較定量，但原始模板數量相差太遠導致熒光曲線在高于閥值後的斜率顯著不同而影響測定可靠性，本發明則可克服這種缺陷。
发明内容
本发明所要解决的技术问题由于持家基因的表达量往往比目标基因的表达量高一或几个数量级，影响了持家基因在基于反轉錄PCR的基因表达比较研究中的校正功能。本发明提供了一种简单有效的解决办法，提高和扩展了持家基因的实际应用价值。
发明构思PCR扩增包括变性，退火和延伸步骤，控制变性温度低于原始模板和扩增产物解链所必须的温度，或者控制退火温度高于引物退火的最高允许温度扩增就會流产。对于有目标基因引物和持家基因引物并存的双重扩增，如果设计引物使目标基因扩增产物的解链温度比持家基因擴增產物的解鏈温度低，通过调节PCR反应的变性温度可以控制目标基因和持家基因进行双重扩增或只进行目标基因的扩增。换言之可以在PCR反应的起始或中间阶段通过控制变性温度使目标基因被富集使之达到与持家基因表達量相近、持平或略高的水平，从而使最終的目標基因與持家基因的擴增產物物量相近。同样，设计持家基因引物比目标基因解鏈溫度低，就能通过控制退火温度来达到相同的目的。
技术方案本发明PCR反应液成份包括4种脱氧核糖核苷酸，鎂离子，缓冲液，DNA聚合酶及目标基因引物和持家基因引物各一对。反转录聚合酶链式反应依次包括如下步骤(1)反转录合成cDNA(2)PCR反应液中的DNA模板变性解链；(3)引物与模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；(5)按步骤(2)-(4)循环进行扩增反应；其特征在于在PCR反应的前1-20循环，有3-15个循环中只有目标基因的扩增而没有持家基因的扩增。
技术方案之一设计持家基因扩增产物的解链温度比目标基因扩增产物的解链温度高1-20℃，优选值爲2-8℃，反应开始时控制循环变性温度介于目标基因扩增产物解链温度和持家基因扩增产物解链温度之间。持家基因扩增因不能完成变性步骤而流产。此阶段目标基因扩增几至几百倍使模板数量达到与持家基因模板数量相当的水平。PCR其余循环的变性温度高于持家基因扩增产物的解链温度，在PCR擴增進入平臺前停止反应按常规进行检测。
技术方案之二设计持家基因引物的解链温度比目标基因引物解链温度低3-25℃，优选值爲5-15℃。反应开始时控制循环退火温度高于持家基因引物的最高允许退火温度。持家基因扩增因不能完成退火步骤而流产。此阶段目标基因扩增几至几百倍使模板数量达到与持家基因模板数量相当的水平。PCR其余循环的退火温度低于持家基因引物的最高允许退火温度。在PCR擴增進入飽和前停止反应按常规进行检测。
有益效果通過引物設計和调節變性或退火溫度控制目標基因和持家基因的擴增，改進了mRNA表達的定量比較研究中應用持家基因進行校準的效果，将持家基因校準方法擴展至非常低度mRNA的表達研究。
具体实施实施例1实施例1以人腺苷酸环化酶的一个亚型为目标基因(美国国家生物信息中心基因库编号AB007882)，人甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因为持家基因(美国国家生物信息中心基因库编号XM_006959)。目标基因引物和持家基因引物的顺序和特性示于表1和2表1，实施例1引物顺序
表2，实施例1引物特性
PCR反应采用BDClonTech公司的Advantage2-PCR试剂盒，每管体积10ul，反應液引物浓度0.4uM，每100ul反应液加cDNA10ul，cDNA由人组织总RNA用BDColnTech公司反转录试剂盒以Oligo(dT)为引物合成，每20ul加RNAlug。对照组按常规方法首次变性94℃1分钟，循环变性94℃15秒，退火和延伸68℃1分钟。试验组首次变性94℃1分钟，前6个循环变性89℃15秒，其余循环变性94℃15秒，循环退火温度均为68℃1分钟。反应结束后用聚丙烯酰胺凝胶电泳用SYBR錄I染色。试验结果示于表3。
表3，控制变性温度使目标与持家基因扩增量同步
结果说明按常规方法当目标基因产物出现条带时持家基因已进入平臺期，试验組通過控制变性温度使持家基因晚于目標基因6个循环才開始扩增，而使目标基因和持家基因的扩增量趋于同步实施例2实施例2目标基因与实施例1相同，以人beta肌动球蛋白基因为持家基因(美国国家生物信息中心基因库编号BC016045)。目标基因引物和持家基因引物的顺序和特性示于表4和5
表1、抗紫外环氧组合物的组成和含量(均以重量份计)
实施例11、将实施例1～10及比较例1#制备的抗紫外环氧组合物I～X和I#于真空脱泡后，在烘箱内130℃固化2h，随炉冷却后取出样品。然后再次加热到130℃保持2h，以去除残余应力和易挥发性组份。然后对样品分别进行光老化性能、力学性能、热性能测试，得到的数据列于表2。
结果说明按常规方法当目标基因产物出现条带时持家基因已进入平台期，试验组通過控制退火温度使持家基因晚于目標基因5个循环才開始扩增，而使目标基因和持家基因的扩增量趋于同步。
权利要求
1，一种含持家基因的双重反轉錄聚合酶链式反应方法，反应液含一对擴增持家基因的引物和一對擴增目標基因的引物。該雙重反轉錄PCR反应依次包括如下步骤(1)反转录合成cDNA(2)DNA模板变性解链；(3)引物与模板退火；(4)在DNA聚合酶催化下延伸合成互补DNA链；(5)按步骤(2)-(4)循环进行扩增反应；其特徵在于反應1至20循環内部份循環只有目標基因的擴增而無持家基因的擴增。
2，根據權利1所述的含持家基因的雙重反轉錄聚合酶链式反应方法，所述的目標基因引物擴增產物的解鏈温度比所述的持家基因引物擴增產物的解鏈温度低2℃以上。
3，根據權利1所述的含持家基因的雙重反轉錄聚合酶链式反应方法，所述的目標基因引物的最高允許退火温度比所説的持家基因引物的最高允許退火温度高3℃以上。
4，根據權利1至3所述的含持家基因的雙重反轉錄聚合酶链式反应方法，所述的只擴增目標基因的循環數為3至20個。
5，根據權利1至4所述的含持家基因的雙重反轉錄聚合酶链式反应方法，所述的只擴增目標基因的循環數為5至10個。
6，根據權利1至5所述的含持家基因的雙重反轉錄聚合酶链式反应方法，應用于實時熒光定量PCR。
7，根據權利1至6所述的含持家基因的雙重反轉錄聚合酶链式反应方法，目标基因有二个以上。
全文摘要
一种含持家基因的双重反转录聚合酶链式反应方法。设计引物使目标基因扩增产物比持家基因扩增产物解链温度低，或目标基因引物比持家基因引物解链温度高，通过控制前期循环的变性温度或退火温度，使持家基因扩增流产而目标基因经扩增得到富集。当目标基因模板数量与持家基因相当时控制变性或退火温度使持家基因也开始扩增，最终目标扩增产物量与持家基因扩增产物量趋于接近。
文档编号C12Q1/68GK1858220SQ20051002563
公开日2006年11月8日 申请日期2005年4月30日 优先权日2005年4月30日
发明者徐定邦, 谢文凯, 府雷宇 申请人:徐定邦, 徐文慧