专利名称：植物营养成分含量的快速提取检测法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植物营养成分、尤其是大豆的功能性营养成分含量的快速提取检 测方法，特别涉及一种能同步快速地提取大豆多基因聚合育种杂交后代的功能性营养成 分，并借助HPLC所具有的检测功能，对其进行定性、定量的方法，由此可快速对其杂交后代 进行筛选。
背景技术：
许多植物种子，尤其大豆种子不仅富含优质的植物性蛋白质和脂肪酸，而且也含 有异黄酮、维生素E等多种功能性营养成分。尤其是近年来，随着生活水平的提高，消费者 对大豆异黄酮、维生素E等功能性营养成分的需求急剧上涨。但是，在现有的已育成推广 的大豆品种中，尚没有综合农艺性状好，异黄酮、维生素E等功能性营养成分含量均高的品 种，极大地影响了大豆本身的加工利用价值，降低了深加工企业的经济效益。利用大豆基因聚合杂交育种手段，将控制异黄酮、维生素E、叶黄素等功能性营养 成分含量的基因，聚合到同一个基因组中，从而培育出异黄酮、维生素E及叶黄素含量都高 的大豆新品种，提高大豆综合利用价值。现有的维生素E (Tocopherol)提取分析技术有多 种，过去常用Emmerie-Engel法(EE法)、荧光法、薄层层析法(TLC法)等。近年来，随着高效 液相色谱(HPLC)技术的不断改良，利用液相色谱分析技术基本可以对维生素E的四个同分 异构体 a -Tocopherol ( a -生育酚)、^ -Tocopherol ( 3 -生育酚)、y -Tocopherol ( Y -生 育酚)和S-Tocopherol(S-生育酚)进行简单的定性定量分析(DellaPenna，2005， Ujiieet al.，2005)。同样做为类胡萝卜素一种的叶黄素(Lutein —种强抗氧化物质，白内 障、老年型黄斑变性症的预防)(Monma et al.，1994，Kanamaru et al.，2006)，以及女性荷 尔蒙样物质的异黄酮(Isoflavone)提取分析技术，近年来常用高效液相色谱法(HPLC)进 行定性及定量分析(王春娥等，1998，Wang 1994)。这些现有的维生素E、叶黄素以及异黄酮分析技术，在受检样品数、质量不受限的 前提下，均可对大豆种子进行种子维生素E、叶黄素以及异黄酮进行定性定量分析。但是，传 统方法需要样品的数量或质量多，提取步骤繁琐，费时费力费试剂，对环境污染大。问题是 在基因聚合后的杂交后代每粒种子的功能性营养成分含量检测选拔方面，由于这些现有的 异黄酮、维生素E和叶黄素的分析检测技术，都是各自独立的分析系统，1次取样只能支持 上述1种营养成分的选拔。要想知道每一粒珍贵的杂交后代种子的上述两种或三种成分的 含量，必须分两次或三次分别取样(每次>20mg)，分别进行HPLC的定性定量分析。而杂种 后代每粒种子的质量较小，而且一粒种子具有的性状都各不相同，若利用现有技术对其多 次取样分析后，即便从中选出符合育种目标的杂交后代种子，由于种子被多次取样切除，将 剩余部分种子播种后，终因不能正常出苗而无法完成下个世代增殖繁育，进而无法实现预 期的育种目标。以维生素E和叶黄素杂交聚合育种后代为例，因具有高维生素E(母本14_16g/100 粒)和高叶黄素(6-8g/100粒)含量的亲本百粒重均较小，杂交前期世代的单粒种子质量，
3只有60-100mg左右，经过两次取样分析筛选后，即便获得维生素E和叶黄素含量双高的 后代，也会因种子自身被过多的切除而失去后代繁育能力，进而无法实现预期的育种目标 (Wang et al.，2007)。而且，检测未成熟大豆子叶中维生素E等的含量时，因种子中很多成分正处于形 成期或处于欲检测成分的前驱体状态，用传统的方法检测时，会检出很多的未知的相互粘 连的峰，根本无法定性目标峰，更无法准确定量目标成分的含量。限制了未成熟大豆子叶中 很多酶基因的表达解析，及关联基因标记的开发。因此，在大豆(植物)多基因聚合杂交育种后代选拔过程中，迫切需要一种只进行 “一次取样，多种功能性营养成分可同步提取、检测的技术”。该问题一旦解决，不仅为大豆 品质改良育种工作者解决了“育种瓶颈”，也为谷物、食品检测等领域，提供了便利的检测方 法，降低了检测成本，减少了人财物的浪费及环境污染。
发明内容
为了解决大豆功能性营养成分基因聚合育种杂交后代个体选拔过程中，存在的在 同一世代的同一粒种子，含有的多种目标成分，无法同时进行定量检测分析的难题，本发明 的目的在于提供一种提取检测方法，以实现“一次取样，多种功能性营养成分可同步提取、 检测”，进而加快育种后代选拔进程，培育高附加值大豆新品种；同时也为了缩短检测时间， 降低人力、物力、财力的投入，减少检测废弃物的对环境的污染。本发明通过对现有的维生素E、叶黄素以及异黄酮提取技术以及HPLC分析技术的 改进，实现了上述目的，采用的技术方案如下本发明提供一种植物，具体如大豆的营养成分含量的快速提取和检测法，该方法 特别适用于大豆多基因聚合杂交育种后代营养成分含量的快速提取和检测，也可用于测定 食品中的维生素E、异黄酮、叶黄素、胡萝卜素、叶绿素a，b等成分含量，该方法包括如下步 骤1、水溶性物质异黄酮和脂溶性物质维生素E、叶黄素等类胡萝卜素物质的一次取 样同时提取，制备样品；2、HPLC两步分析法。其中所述的提取是用低温冷藏条件下的正己烷试剂将欲检测的植物种子微量样 品中的维生素E、叶黄素等类胡萝卜素物质溶出后，剩余物再用乙醇试剂溶出异黄酮。优选的，所述植物是杂交大豆，特别是大豆多基因聚合杂交育种后代，所述低温是 0-4°C ；所述正己烷是化学纯试剂，其用量为250-500 yl ；所述种子微量样品是5_10mg，优 选种子碎末；所述乙醇是70-80%乙醇，其用量为250-500 ill。优选的，所述正己烷试剂中含有0. 25 u g/ml的3 -阿朴胡萝卜素醛和3 u g/ml母 育酚作为内部标准物。优选的，所述提取是将欲检测的种子逐粒用裁纸刀片，在种脐的正相反侧的子叶 部位切取碎末加入离心管，同时加入含有阿朴胡萝卜素醛和母育酚内部标准的所述正 己烷试剂，振荡器振荡10-20秒后，4°C下超声波超声8-10分钟，之后遮光冷藏静置15-30 分钟后，离心10分钟，取上清液300-400 u 1得到维生素E、叶黄素等类胡萝卜素HPLC分析 样品；再取沉淀加入70-80%乙醇试剂，振荡器振荡10-20秒，超声波超声8-10分钟，之后室温静置15-30分钟后，离心10分钟，取上清液300-400 u 1得到异黄酮HPLC分析样品。其中所述HPLC两步分析法包括1)维生素E及叶黄素等类胡萝卜素的HPLC检测 和2)异黄酮的HPLC检测。1)维生素E及叶黄素等类胡萝卜素的HPLC(Hitachi LaChrom Elite, HitachiHigh-Technologies Crop.，Japan)检测条件为使用 0DS-3 逆向柱，柱温为 40°C, UV检测器波长在200-900nm之间可用，进样量为25-30 yl，移动相A为75%的甲醇溶液， 移动相B为乙酸乙酯，移动相A与移动相B的体积比为50-60 50-40 ；采用线性梯度法检 测，流速设定为0. 8ml/min。其中检测维生素E用UV波长为292-295nm，检测叶黄素用UV波长为445_450歷， 检测叶绿素及胡萝卜素用430nm波长，所述移动相所用试剂均为液相色谱专用，并用超 声波脱气。2)异黄酮的 HPLC (Hitachi LaChrom Elite, Hitachi High-TechnologiesCrop.， Japan)检测条件为使用0DS-3逆向柱，柱温40°C，UV检测器波长在200-400nm可用，进 样量5 iU，移动相A为乙腈(内添加终浓度为0. 的乙酸)，移动相B为脱离子水(内添 加终浓度为0.1%的乙酸)，移动相A与移动相B的体积比为20-50 80-50;采用线性梯 度法检测，流速0. 8ml/min。其中检测异黄酮用UV波长为254nm，所述移动相所用试剂和水均为液相色谱专 用，并用超声波脱气。本发明提供的检测方法具有如下的技术效果1、仅一次微量取样(5-10mg)，就可以同时进行多种成分的检测。2、不影响取样后的杂种后代的正常生长发育。3、改良后的快速定量法与现有方法相比，分析结果没有显著的差异，即在基因聚 合育种后代选拔过程中，本发明方法可替代现有方法解决其无法完成的“一次取样即可检 测多种目标成分”的难题。4、前处理及HPLC分析快速、简便、易行，省时、省力、省成本。5、可以较好地对未成熟大豆子叶中维生素E诸成分进行定性、定量解析。6、由于提取维生素E、叶黄素及异黄酮所用试剂，由原来提取3种成分需要4种试 剂合计5份用量，减少为现在的提取3种成分仅需要2种试剂，从种类上就减少了 60%，从 数量上减少的就更多了，现有的方法需要称取样品的质量至少要高出本方法2倍以上，废 液排出量的减少仅在提取阶段就可减少60%，在HPLC分析阶段有原来的3次分析减少为2 次，就可减少30%，既极大地降低了分析成本又极大地减少环境的污染。
图1为采用本发明方法进行维生素E、叶黄素、异黄酮等成分的同步提取分析流程 图。图2为采用本发明方法进行杂种后代(或未成熟大豆)子叶的维生素E、叶黄素、 叶绿素等类胡萝卜素HPLC同步分析锋面图。图3为现有方法的维生素E的HPLC分析锋面图。图4为现有方法的叶黄素等类胡萝卜素HPLC分析锋面图。
图5为本发明方法的异黄酮各组分HPLC分析锋面图。图6为现有方法的异黄酮各组分HPLC分析锋面图。其中1-叶黄素，2-母育酚，3-S-生育酚，4-阿朴胡萝卜素醛，5-生育酚， 6-叶绿素b，7- a -生育酚，8-叶绿素a，9- 0 -胡萝卜素，10-大豆苷，11-染料木苷，12-丙 二酰大豆苷，13-丙二酰染料木苷。
具体实施例方式本发明提供一种植物，尤指大豆多基因聚合育种杂交后代的营养成分含量检测方 法，包括如下步骤首先，水溶性物质异黄酮和脂溶性物质维生素E、叶黄素等类胡萝卜素物质的一次 取样同时提取，制备样品。是用低温冷藏条件下的正己烷试剂将欲检测的植物种子微量样 品中的维生素E、叶黄素等类胡萝卜素物质溶出后，剩余物再用乙醇试剂溶出异黄酮。然后采用HPLC两步分析法，包括1)维生素E及叶黄素等类胡萝卜素的HPLC检测 和2)异黄酮的HPLC检测。以下为本发明名词解释和省略语维生素E 学名，生育酚，英文名，Tocopherol。在大豆子叶中有4种同分异构体 a-生育酚(a-Tocopherol，略a-Toc，生物活性最强)，3 -生育酚(^-Tocopherol, 略0 -Toe)，y -生育酚(Y -Tocopherol,略、-Toe)，8 -生育酚(5 -Tocopherol,略 6 -Toe)。作为抗氧化剂的一种，具有软化血管，预防癌症、心脑血管疾病，及增强人体免疫 机能等功效，大豆是提取维生素E的主要的原料。母育酚(Tocol)做为内部标准，用于维生素E定量。反式3 -阿朴-胡萝卜素醛(3 -Apo-8' -carotenal) (trans)，用于类胡萝卜素 定量的内部标准。异黄酮的定量，因没有合适的内部标准品，一般采用外部标准法。内部标准法(内标法)在测定某成分含量时，将找到的适于将其溶解于样品提取 液中，随同检测样品同步被检测，且HPLC检测时，其出峰时间最好不要与欲检测成分重叠， 即重叠面积越大，定量误差也越大。外部标准法(外标法)在测定某成分含量时，由于找不到适于做内部标准的试 剂，多采用外标法，不将其溶于到样品提取液中，在样品检测时，作为一个独立的试样进行 检测，根据配制的标准样品的浓度及峰的面积(或峰高)和检测样品的峰的面积(或峰 高)，计算未知样品的含量。叶黄素，英文名称lutein。是类胡萝卜素的一种，与玉米黄素共同构成眼睛视网 膜黄斑的两大色素之一。主要存在于黄绿色的蔬菜中，如菠菜，紫叶生菜，南瓜等。近年来， 作为一种新规的强抗氧化剂，用于预防老年性黄斑变性症(ADM)，白内障，心脑血管疾病，保 护皮肤等功能。它在栽培大豆中虽然含量较低，经我们调查研究，它在某些野生大豆子叶中 的含量不亚于蔬菜含量，将这个优良性状导入到栽培大豆中，将极大地提高大豆附加值，增 强其生理保健功能。但由于野生大豆的种子很小，与栽培大豆杂交后早期世代的种子也很 小，现有检测方法无法适用于品质改良育种实践。异黄酮，英文名称ISOflaVOne(以下略作Iso)，在大豆中主要九种异黄酮糖苷，其中大豆苷(Daidzin)，染料木苷(Genistin)，丙二酰大豆苷(Malonyl-daidzin)和丙二酰染 料木苷(Malonyl-genistin)的含量最多。具有调节雌激素、抑制与癌相关的酶的活性，消 除活性氧基，具有抗氧化作用及防治骨质疏松症等功效。杂交后代，遗传背景不同的两个或多个亲本(父母亲)交配后产生的子孙，兼具双 亲的特征。多基因聚合育种多基因聚合简言之就是通过杂交或生物技术手段，将分散在不 同的个体、品种或品系中的理想基因聚合到同一个基因组中。高效液相色谱仪英文名称High-performance liquid chromatography,缩写 HPLC。由于它具有高分辨率、高灵敏度、速度快、色谱柱可反复利用，流出组分易收集等优 点，因而被广泛应用到生物化学、食品分析、医药研究、环境分析、无机分析等。其他缩写注释C_浓度content的缩写，A-面积area的缩写，s_标准样品 standard的缩写，t_生育酚tocopherol的缩写，叶黄素lutein的缩写，i_异黄酮 isoflavone 的缩写。下面结合实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证 的目的，决不限制本发明的保护范围。实施例1提取功能性营养成分如图1所示，将欲检测的成熟的大豆杂交种子逐粒用裁纸刀片，在种脐的正 相反侧切取碎末(以丝毫不伤害胚芽、胚根、胚轴为准)(检测未成熟大豆子叶的情况 下，将未成熟大豆子叶经常规的冷冻干燥机冷冻干燥24小时后，研磨粉碎成粉末)10mg 加入1.5ml的印pendorf离心管，同时加入含有0. 25 y g/ml的阿朴胡萝卜素醛 (3-Apo-8，-carotenal (trans))和3 y g/ml母育酚(Tocol)内部标准的冰冷正己烷试剂 500 iU，振荡器振荡10-20秒后，4°C下超声波超声8-10分钟，之后遮光冷藏静置15-30分 钟后，13，000转/分钟离心10分钟，取上清液300-400 u 1进行HPLC分析维生素E、叶黄素 等类胡萝卜素；取沉淀加入75%乙醇试剂500 yl，振荡器振荡10-20秒，超声波超声8-10 分钟，之后室温静置15-30分钟后，13，000转/分钟离心10分钟，取上清液300-400 u 1进 行HPLC分析异黄酮。HPLC 分析法在HPLC定量分析时，因分析异黄酮所用流动相与前者不同，HPLC分析时需要两次 完成即第一次脂溶性物质维生素E和叶黄素(类胡萝卜素类均可)的同步定量分析，第 二次水溶性物质异黄酮定量分析。1)维生素E及叶黄素等类胡萝卜素的HPLC分析方法如下将装有300-400 yl 的上清液的HPLC专用小瓶放入到HPLC的自动进样装置(auto-sampler)。HPLC (Hitachi LaChrom Elite, Hitachi High-TechnologiesCrop.，Japan)条件设定使用 0DS-3 逆向柱 (4. 6X250mm,5um, GL Science, Japan)，柱温40°C . UV检测器应具备2个波段(波长在 200-900nm之间可用)，其中检测维生素E用UV波长为292-295nm，检测叶黄素用UV波长 为445-450nm，检测叶绿素及0 -胡萝卜素用430nm波长。移动相A为75%的高效液相色 谱专用甲醇，然后用高效液相色谱专用脱离子水配制成75%的甲醇溶液，并用超声波脱气； 移动相B为高效液相色谱专用乙酸乙酯。进样量25-30 yl，采用线性梯度法检测的流程见表1。表1.未成熟大豆子叶的维生素E及叶黄素等的营养成分HPLC (Hitachi)同步梯度分析工艺流程 注Inertsil 0DS-3 反向柱(4. 6X 250mm，5 ii m，GL Science, Japan) ,40°CA:75%甲醇，B 乙酸乙酯如表1和图2所示，0-12分钟时，移动相A的比分从开始的60%降到12分钟时 的50% (相对应的B则从40%上升到50% )，对应的波长是450nm，流速设定为0.8ml/ min，叶黄素可在此时间段内检出。12-24分钟时，移动相A的比分保持在50%，波长保持 在295nm，流速不变为0. 8ml/min，检出成分的顺序是18-20分钟时母育酚被检出；22-23分 钟时，5-生育酚被检出；24-26分钟时，移动相A的比分仍保持在50%，波长变为450nm， 流速保持在0. Sml/min，检出成分为0 -阿朴胡萝卜素醛；26-28分钟时，波长变为295nm， 其他不变，可检出生育酚；28-29分钟，移动相A的比分为60%，波长为430nm，流速不 变0.8ml/min，可检出叶绿素b ;28-30分钟波长为295nm，其他也不变，可检出a -生育酚； 30-35分钟时，移动相A比分为50 %，波长430nm，其他不变，可检出叶绿素a ；35-40分钟时， 移动相A上升至60%，波长变为430nm，其他不变，可检出胡萝卜素。以上方法可根据实际需要检测哪种成分，就根据上述某成分的检测条件加以设 定；不需要的成分就可以不设定与之对应的条件，则该成分就不会被检出。(2)异黄酮的HPLC检测方法将装有300-400 yl的上清液的HPLC专用小瓶放入到HPLC的自动进样装置 (auto-sampler)。 HPLC(Hitachi LaChrom Elite, Hitachi High-TechnologiesCrop., Japan)条件设定使用 0DS-3 逆向柱(4. 6 X 250讓，5 y m，GL Science，Japan)，柱温:40°C UV检测器应具备1个波段(200-400nm)就可以。进样量5 yl，移动相A为高效液相色谱专 用乙腈(内添加终浓度为0. 的乙酸)，使用前要脱气，移动相B为高效液相色谱专用脱
8离子水(内添加终浓度为0.1%的乙酸)，使用前要脱气。整个过程波长保持254nm，流速 0. 8ml/min不变，采用线性梯度法检测的流程见表2。表2.异黄酮HPLC (Hitachi)同步梯度分析工艺流程 注Inertsil 0DS-3 反向柱(4. 6X 250mm，5 ii m，GL Science, Japan) ,40°CA:乙腈+0. 的乙酸，B 脱离子水+0. 的乙酸如表2和图5所示，0-10分钟，移动相A的比分从开始的20%升到10分钟时的 30% (相对应的B则从80%降到70% )，在6-7分钟时可检出大豆苷(Daidzin)，7_10分 钟时可检出染料木苷(Genistin) ； 10-15分钟时，移动相A的比分从30 %上升到40 %，在 12-15分钟时可检出丙二酰大豆苷(Malonyl-daidzin) ；15-20分钟时，移动相A从40%上 升到50%，在16-18分钟时可检出丙二酰染料木苷(Malonyl-genistin) ；20-25分钟，移动 相A —直保持50%，波长一直为254nm，流速为0. 8ml/min,使HPLC检测状态稳定并恢复到 样本检测的起始时预备状态，以确保检测样品的连续性，准确性。对比例1维生素E的现有检测方法提取方法称取大豆粉末50mg，加入到10ml试管，加入1ml的含3 u g/ml母育酚 (Tocol)内部标准的80%的乙醇，振荡器振荡10-20秒后，室温下超声波超声15分钟，然后 加入2ml含临苯三酚的正己烷饱和液，振荡器强烈振荡10-20秒，遮光静置30分钟后，5速， 2，500转/分钟，离心10分钟，取上层正己烷液600 iU，装入HPLC专用小瓶，进行HPLC的 维生素 E 分析(Ujiie et al.，2005)。HPLC分析方法将装有600 u 1的上清液的HPLC专用小瓶放入到HPLC的自动进样 装置(auto-sampler)。HPLC (Hitachi LaChrom Elite, HitachiHigh-Technologies Crop., Japan)条件设定使用 0DS-3 逆向柱(3. 0 X 250mm，GLScience，Japan)，柱温:40°C 流速 0.51111/1^11，淠波长29511111，进样量20111移动相为乙腈甲醇=75 25v/v)。如图3所 示，在10-13分钟，6 -生育酚检出，在14-16分钟，y -生育酚被检出，在17-19分钟，a -生 育酚被检出(Ujiie et al.，2005)。对比例2叶黄素的现有检测方法提取方法称取大豆粉末25mg，加入到1. 5ml eppendorf离心管，加入0. 5ml的含 0. 5 u g/ml 3 -Apo-carotenal内部标准的丙酮乙醇混合液(1 1，v/v)，振荡器振荡10-20 秒后，室温下超声波超声15分钟，遮光静置30分钟后，13，000转/分钟离心10分钟，取上 层正己烷液300-400 iil，装入HPLC专用小瓶，进行HPLC的叶黄素分析(Kanamaru et al.，2006)。HPLC分析方法将装有300-400 u 1的上清液的HPLC专用小瓶放入到HPLC的自 动进样装置(auto-sampler)。HPLC(Hitachi LaChrom Elite,HitachiHigh-Technologies Crop.，Japan)条件设定使用 0DS-3 逆向柱(4. 6X250mm, GLScience，Japan)，柱温 40 °C .流速0.8ml/min，UV检测器波段400-700nm，采用线性梯度洗脱法，进样量30 yl， 移动相A为乙腈，移动相B为乙醇，在0-5min时，移动相A:75% (移动相B为25% )，在 5-15min时，移动相A下降到25%，并保持25%到20min。如图4所示，在0_10min时，波 长保持在447nm，5-7min时，叶黄素被检出，在8_10min时，内部标准^ -Apo-carotenal 被检出，在13-20min时，波长改为430nm，叶绿素b，叶绿素a及3 -胡萝卜素相继被检出 (Kanamaruet al.,2006)o对比例3异黄酮的现有检测方法提取方法称取大豆粉末100mg，加入到10ml试管，加入70-80%乙醇2_4ml，振荡 器振荡10-20秒后，室温下超声波超声15分钟，遮光静置30分钟后，5速2，500转/分钟 离心10分钟后，取上清液取lml移入1.5ml的印pendorf离心管，13，000转/分钟，离心5 分钟，上清液400-500 u 1装入HPLC专用小瓶，进行HPLC的异黄酮分析。HPLC分析标准方法采用YMC0DS. AM-RP (250x30mm，5pm)分析柱，进样量为 5 y 1，移动相由 A(0. 醋 酸水溶液V/V)和B(0. 醋酸乙睛溶液V/V)组成，采用梯度洗脱。梯度为0 60mni，B 由10 %线性递增至60 %，后用90 % B洗脱3min，最后10 % B平衡lOmin。紫外检测波长为 254nm。洗脱速度0. 65ml/min，柱温40°C。如图6所示在14_17min时大豆苷(Daidzin) 被检出，在24-25min时染料木苷(genistin)被检出，26-27时丙二酰大豆苷被检出，在 34-36min时丙二酰染料木苷被检出。在53-55min时染料木黄酮被检出。图6检出的峰均 为标准物质的峰，而不是从大豆子叶中检出的峰，所以峰面比较好看，染料木黄酮在大豆种 子一般含量较低，少量试样较难检测到。结果对比采用实施例1的方法检测主要的性能指标和现有技术的对比如表3所示表3.维生素E、异黄酮及叶黄素等类胡萝卜素新旧分析方法比较表
10 由表3可以得出如下结论1、本发明方法与现有方法相比较，现有方法分析上述3种成分，得需要3次称量，3 次抽提，3次HPLC分析，而本发明方法只需1次称量，2次抽提，2次HPLC分析。2、本发明方法在所用的提取液种类上，可减少两种化学试剂。即现有方法检测上 述几种成分，需要乙醇、甲醇、正己烷及丙酮4种化学试剂。而本发明方法仅需正己烷和乙 醇两种试剂。3、本发明方法在所用样品质量上，至少可比现有方法减少90mg。即现有方法要完 成上述几种成分的检测，合计需用样品量90mg以上，而本发明方法仅需5mg即可。4、本发明方法可以为研究者节约时间50-60%，减少人力、物力投入；节约试剂成 本50%左右减少财力的投入；减少废液排放30-60%左右，降低环境污染。功能性营养成分含量的计算方法根据事先测得已知浓度标准样品的标准曲线，含量与峰面积呈极显著的线性正相 关关系，求未知样品的含量假设已知标准样品的浓度C’(Pg/ml)，维生素E标准样品浓度C’ t，叶黄素 C’ 1，异黄酮C’ i，对应的峰面积为As，则维生素E标准样品的峰面积为A’ ts,叶黄素A’ Is, 异黄酮A’ is ；未知样品含量为C，维生素E含量为Ct，对应的峰面积为At，叶黄素含量C1， 对应的峰面积为A1，异黄酮含量Ci，对应的峰面积为Ai，样品的干物重为W(mg)。Ct(u g/100mg) = (C，t XAt) X 100/(WXA，ts)Cl(u g/lOOmg) = (C，1 X Al) X 100/(WX A，Is)Ci(u g/lOOmg) = (C，i X Ai) X 100/(WX A，is)采用实施例1的方法检测筛选出的维生素E和叶黄素含量均高的杂交后代(目 前F3世代已经可以获得较多的种子，育种的瓶颈在于F2代种子)的系统代号为02-16， 02-19，04-6，05-12，05-27，通过与现有方法比较，没有显著差异，表示新方法可用(表4)， 同样利用这种新方法对普通的品系/种(如国交06-241，06-528，06-1012)进行异黄酮含量的检测与现有方法相比较，没有显著差异(表5)。表4.叶黄素和维生素E的测定结果比较单位mg/100g 注表内数值，3次重复的平均值士标准误差。表5.异黄酮新旧分析法实验结果比较 注表内数值，3次重复的平均值士标准误差。根据所述计算方法得出的杂交后代的各成分含量的比较，可以看出改良后的新分 析方法的含量与旧方法没有显著地差异，即优化简便后的新方法可以用于对杂交后代进行检测分析而不影响结果的真实性。
权利要求
一种植物营养成分含量的快速提取检测法，包括如下步骤水溶性物质异黄酮和脂溶性物质维生素E、叶黄素等类胡萝卜素物质的一次取样同时提取，制备样品；HPLC两步分析法。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其中所述的提取是用低温冷藏条件下的正己烷试 剂将欲检测的植物种子微量样品中的维生素E、叶黄素等类胡萝卜素物质溶出后，剩余物再 用乙醇试剂溶出异黄酮。
3.根据权利要求2所述的检测方法，其中所述低温是0-4°C；所述正己烷是化学纯试 齐U，其用量为250-500 μ 1 ；所述植物种子是杂交大豆，所述微量样品是5-10mg，优选种子碎 末；所述乙醇是70-80%乙醇，其用量为250-500 μ 1。
4.根据权利要求2所述的检测方法，其中所述正己烷试剂中含有0.25yg/ml的β-阿 朴胡萝卜素醛和3μ g/ml母育酚作为内部标准物。
5.根据权利要求2所述的检测方法，其中所述提取是将欲检测的种子逐粒用裁纸刀 片，在种脐的正相反侧的子叶部位切取碎末加入离心管，同时加入含有β-阿朴胡萝卜素 醛和母育酚内部标准的所述正己烷试剂，振荡器振荡10-20秒后，4°C下超声波超声8-10分 钟，之后遮光冷藏静置15-30分钟后，离心10分钟，取上清液300-400 μ 1得到维生素Ε、叶 黄素等类胡萝卜素HPLC分析样品；再取沉淀加入70-80%的乙醇试剂，振荡器振荡10-20 秒，超声波超声8-10分钟，之后室温静置15-30分钟后，离心10分钟，取上清液300-400 μ 1 得到异黄酮HPLC分析样品。
6.根据权利要求1所述的检测方法，其中所述HPLC两步分析法包括维生素E及叶黄素 等类胡萝卜素的HPLC检测和异黄酮的HPLC检测。
7.根据权利要求6所述的检测方法，所述维生素E及叶黄素等类胡萝卜素的HPLC检测 条件为使用ODS-3逆向柱，柱温为40°C，UV检测器波长在200-900nm之间可用，进样量为 25-30 μ 1，移动相A为75%的甲醇溶液，移动相B为乙酸乙酯，移动相A与移动相B的体积 比为50-60 50-40 ；采用线性梯度法检测，流速设定为0.8ml/min ；优选的检测维生素E用UV波长为292-295nm，检测叶黄素用UV波长为445-450nm，检 测叶绿素及β-胡萝卜素用430nm波长，所述移动相所用试剂均为液相色谱专用，并用超声 波脱气。
8.根据权利要求6所述的检测方法，所述异黄酮的HPLC检测条件为使用ODS-3逆向 柱，柱温40°C，UV检测器波长在200-400nm可用，进样量5μ 1，移动相A为乙腈(内添加终 浓度为0. 1 %的乙酸)，移动相B为脱离子水(内添加终浓度为0. 1 %的乙酸)，移动相A与 移动相B的体积比为20-50 80-50 ；采用线性梯度法检测，流速0. 8ml/min ；优选的检测异黄酮用UV波长为254nm，所述移动相所用试剂和水均为液相色谱专用， 并用超声波脱气。
9.权利要求1-8所述的检测方法的应用，用于大豆多基因聚合育种杂交后代的功能性 营养成分的快速检测和杂交后代的筛选。
全文摘要
本发明提供一种植物，尤指大豆多基因聚合育种杂交后代营养成分含量快速检测法，包括水溶性物质异黄酮和脂溶性物质维生素E、叶黄素、胡萝卜素等物质的一次取样同时提取，以及HPLC两步分析法，实现了“一次取样，多种功能性营养成分可同步分析检测”，进而加快育种后代选拔进程，培育高附加值大豆新品种，同时也可以缩短检测时间，降低人力、物力、财力的投入，减少检测废弃物的对环境的污染。
文档编号G01N30/06GK101865888SQ20101019183
公开日2010年10月20日 申请日期2010年6月1日 优先权日2010年6月1日
发明者冯晓, 刘伟, 刘燕, 喜多村启介, 姚磊, 姜妍, 富校轶, 张平, 朱秀清, 李宏伟, 李文滨, 李远明, 王晓云, 王浩, 王绍东 申请人:黑龙江省大豆技术开发研究中心