貉源性成分检测用引物和探针及其检测方法
【专利摘要】本发明涉及食品、饲料、毛皮及其制品中动物源性成分的定性检测技术，具体涉及一种貉源性成分检测用引物和探针及其检测方法。本发明选取貉的线粒体细胞色素氧化酶b基因序列，设计一组特异性引物和探针，使用该引物和探针，采用实时荧光PCR技术，可实现针对食品、饲料、毛皮及其制品中貉源性成分的简便快速检测。
【专利说明】貉源性成分检测用引物和探针及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物源性成分的检测，具体涉及一种貉源性成分检测用引物和探针及其检测方法。
【背景技术】 [0002]貉的养殖规模不断扩大，貉的毛皮制品很有市场，同时，貉的养殖量很大，貉单只的个体大，作为貉毛皮产业的副产物，貉肉往往被添加到食品或者饲料中，因此，提供一种能够快速准确检测貉源性成分的方法十分必要。传统感官方法鉴定貉源性成分，依据色泽、气味、组织性状等进行判断，容易受主观因素影响，而且需要经验的积累，尤其是添加了色素、芳香剂以及受到深度加工的制品，更增加了鉴定难度以及监控监管的风险性。目前，仍然没有从基因水平对貉源性成分进行鉴别鉴定的检测方法，在毛皮制品、食品及饲料中貉源性成分检测应用上存在空白。基于遗产物质DNA实时荧光PCR技术已经成功应用在一些常见家畜家禽物种中，如牛，马，鸡等，技术条件成熟。物种特异基因序列，为一段只有目标检测生物物种所特有的遗传信息，通过寻找比对貉与其他物种的遗传基因序列，查找貉的特异基因，获得遗传DNA序列信息，在此基础上设计引物、探针，能够区分出不同物种来源的样本，使得含有貉源性成分的样本产生特异扩增荧光信号，从而对貉源性成分进行鉴定。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种貉源性成分检测用引物和探针及其检测方法。
[0004]本发明的目的通过以下技术方案来实现:
一种貉源性成分检测用引物和探针:
上游引物序列为:5’ -TACAGCTGATCTCCTCACGTTAACA-3’ ；
下游引物序列为:5’ -TTGGCCGATGATGATGAAAG-3’ ；
探针序列为:5’ - AATTGCAGGCCAACCGGTCGAAC-3’，其5’端标记FAM报告荧光基团，3’端标记TAMRA淬灭荧光基团。
[0005]一种应用上述貉源性成分检测用引物和探针进行貉源性成分检测的方法，包括如下步骤:
(O提取样品DNA:取吸脂烘干并研磨成细粉的样品IOOmg放入2mL离心管中，加入CTAB提取液600 μ L和蛋白酶10yL，65°C水浴加热I小时，分别加入Tris饱和酚、氯仿异戊醇各400 μ L分别摇匀，离心取上清加入1.5mL离心管中，加入该上清量2倍体积的CTAB沉淀液，室温静置I小时，离心弃上清，先加入氯化钠水溶液400 μ L摇匀溶解沉淀，再加入400 μ L氯仿摇匀，离心取上清，加入新的1.5mL离心管中，加入该离心管中上清量0.8倍体积的异丙醇摇匀静置I小时，离心弃上清，加入1000 μ L的70%酒精洗涤，离心，静置晾干，溶于100 μ L水中；
(2)进行实时荧光PCR检测:实时荧光PCR检测的反应体系为25yL:包括12.5yL含有dNTP、Mg2+以及Taq酶的2Xreal time PCR Buffer ;所述的上游引物和下游引物各1μ L，终浓度为0.2 μ M ;所述的探针I μ L，终浓度为0.2 μ M ;步骤(1)提取的样品DNA模板
2μ L ;纯水7.5 μ L ;实时荧光PCR检测的反应程序为:预变性:温度95°C，时间10分钟，然后进行PCR扩增:温度95°C，时间15秒，温度60°C时间I分钟，循环45次。
[0006]本发明的有益效果在于:根据貉的物种特异基因序列设计用于实时荧光PCR检测的引物和探针，同时对样品前处理、PCR扩增体系条件等做了优化，提供了一种貉源性成分的实时荧光PCR检测方法，可准确、快速鉴定貉源性成分，能够有效抵御假冒动物源性成分产品掺假，在食品、饲料以及皮毛类产品的鉴定上具有很大的实用价值。同时对于经动物貉传播的某些疾病也可通过该方法鉴定其成分，并控制其进出境，来防止这些疾病病原的传播与蔓延。
[0007]本发明通过优化改良了样品前处理DNA提取方法，可以有效减少所提取DNA中的杂质干扰，DNA纯度更高，提高了检测的灵敏度，比商业化的试剂盒更为经济。针对引物和探针序列采取的PCR扩增体系也保证了检测的特异性与灵敏度。
[0008]本发明针对貉的物种特异遗产物质DNA的PCR分子鉴定技术，具有特异性高、针对性强、灵敏度高、简便快速、对检测样品要求低的特点，能够准确客观的提供实验证据。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1为貉源性成分实时荧光PCR检测方法特异性实验图；
图2为貉源性成分实时荧光PCR检测方法灵敏性实验图。
【具体实施方式】
[0010]结合实施例对本发明做进一步说明。
[0011]实施例:
(I)、实时荧光PCR检测方法特异性引物的设计
下载GenBank中公布的各种动物线粒体基因序列，通过DNAMAN软件比对分析，选取貉的线粒体细胞色素氧化酶b基因序列设计出鉴别检测貉源性成分的荧光PCR特异性引物和探针(只能扩增出貉DNA限制性片段，而扩增不出其它动物DNA限制性片段)，引物和探针分别如下:
上游引物序列:5’ -TACAGCTGATCTCCTCACGTTAACA-3’ ；
下游引物序列:5’ -TTGGCCGATGATGATGAAAG-3’ ；
探针序列:5，(FAM)- AATTGCAGGCCAACCGGTCGAAC-3’(TAMRA)。
[0012](2)、DNA 的提取
(2.1)取样品经研磨机研磨成糜状或者细碎状，置于在恒温干燥箱中烘干，肉类等脂肪含量高的样品可以包裹无菌滤纸吸收多余油脂；
(2.2)烘干样品经研磨机研磨成均匀细粉状；
(2.3)称取上述细粉状样品lOOmg，加入CTAB提取液600 μ L和蛋白酶IOy L，65°C水浴加热I小时；
(2.4)分别加入Tris饱和酚、氯仿异戊醇各400 μ L分别摇匀，离心取上清加入1.5ml离心管中；
(2.5)加入2倍体积的CTAB沉淀液，室温静置I小时，离心弃上清；(2.6)先加入氯化钠水溶液400 μ L摇匀溶解沉淀，再加入400 μ L氯仿摇匀，离心取上清，加入新的1.5mL离心管中；
(2.7)加入0.8倍体积的异丙醇摇匀静置I小时，离心弃上清；
(2.8)加入1000 μ L的70%酒精洗涤，离心静置晾干，溶于100 μ L水中。
[0013]提取基因组DNA均经紫外分光光度计测定其纯度和浓度。测定0D260/0D280值均为1.8左右，DNA纯度较高符合PCR扩增要求。以上DNA的提取为优化改良的CTAB法，DNA纯度高，量大，DNA片段较完整，高质量的DNA提取方法对于提高后续PCR灵敏度很重要。
[0014](3)、貉源性成分实时荧光PCR检测
利用上述设计的特异性引物和探针，以提取的DNA为模板进行PCR扩增。
[0015](3.I)实时荧光 PCR 反应体系为 25μ L，包括 I2.δμ L 2 X real time PCR Buffer (包含有dNTP、Mg2+以及Taq酶)，设计的上游引物和下游引物各I μ L (终浓度为0.2 μ Μ)，探针I μ L (终浓度为0.2 μ M)，提取的产品DNA模板2 μ L，纯水7.5 μ L ;
(3.2)PCR反应程序为:预变性:温度95°C，时间10分钟，然后进行PCR扩增:温度95°C，时间15秒，温度60°C时间I分钟，循环45次；
(3.3)应用荧光定量PCR仪随机软件，设定反应参数，反应结束后保存文件，打开分析软件，分析实验结果。
[0016]样品出现阳性扩增曲线，一般Ct值14-20之间，阴性对照(其他物种DNA)和空白对照(水)无扩增或者CT值与阳性差别明显，Ct值大于30，阳性对照(貉DNA)产生典型阳性扩增曲线，据此可判定该样品检出貉成分。
[0017]本方法的特异性与灵敏度验证说明。
[0018](I)引物与探针的特异性验证
利用上述设计的特异性引物与探针，分别以对貉、貂、狗、鸡、鸭、猫、猪、鹌鹑、狐、牛、羊、驴、兔、鹅、马动物的DNA为模板，进行实时荧光PCR，验证引物的特异性。检测结果如图1所示，图1中:I为貉；2为貂；3为狗；4为鸡；5为鸭；6为猫；7为猪；8为鹌鹑；另外狐、牛、羊、驴、兔、鹅、马未检测到信号。个别物种出现的阳性扩增曲线，但其信号CT值与貉相差很多(>15)，显示上述引物和探针有良好的特异性。
[0019](2)实时荧光PCR的灵敏度验证
用超纯水10倍梯度稀释纯貉肉样DNA，直至10_n，进行实时荧光PCR检测，结果如图2。图2中:1为纯貉肉DNA样品；2-8分别为用超纯水10倍梯度稀释的样品。因此检测最低限度至少可达10_7纯貉肉样DNA浓度，即该引物的灵敏度是10_7纯貉肉样品。
【权利要求】
1.一种貉源性成分检测用引物和探针，其特征在于: 上游引物序列为:5’ -TACAGCTGATCTCCTCACGTTAACA-3’ ； 下游引物序列为:5’ -TTGGCCGATGATGATGAAAG-3’ ； 探针序列为:5’ - AATTGCAGGCCAACCGGTCGAAC-3’，其5’端标记FAM报告荧光基团，3’端标记TAMRA淬灭荧光基团。
2.一种应用权利要求1所述的貉源性成分检测用引物和探针进行貉源性成分检测的方法，其特征在于包括如下步骤: (O提取样品DNA:取吸脂烘干并研磨成细粉的样品IOOmg放入2mL离心管中，加入CTAB提取液600 μ L和20mg/mL的蛋白酶K IOyL, 65°C水浴加热I小时，分别加入Tris饱和酚、氯仿异戊醇各400 μ L分别摇匀，离心取上清加入1.5mL离心管中，加入该上清量2倍体积的CTAB沉淀液，室温静置I小时，离心弃上清，先加入氯化钠水溶液400 μ L摇匀溶解沉淀，再加入400 μ L氯仿摇匀，离心取上清，加入新的1.5mL离心管中，加入该离心管中上清量0.8倍体积的异丙醇摇匀静置I小时，离心弃上清，加入1000 μ L的70%酒精洗涤，离心，静置晾干，溶于100 μ L水中； (2)进行实时荧光PCR检测:实时荧光PCR检测的反应体系为25yL:包括12.5yL含有dNTP、Mg2+以及Taq酶的2Xreal time PCR Buffer ;所述的上游引物和下游引物各Iμ L，终浓度各为0.2 μ M ;所述的探针I μ L，终浓度为0.2 μ M ;步骤(1)提取的样品DNA模板2 μ L ;纯水7.5 μ L ;实时荧光PCR检测的反应程序为:预变性:温度95°C，时间10分钟，然后进行PCR扩增:温度95°C`，时间15秒，温度60°C时间I分钟，循环45次。
【文档编号】C12Q1/68GK103602732SQ201310528738
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月1日 优先权日:2013年11月1日
【发明者】钱云开, 王海洋, 高飞, 吴曦, 王飞, 肖艳霞, 张会敏, 李琳, 张进杰, 曹彦忠, 刘永明, 李丽娜 申请人:秦皇岛出入境检验检疫局检验检疫技术中心