一种用于β-地中海贫血β17(A→T)点突变的检测试剂盒及ARMS-QPCR检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于β-地中海贫血β17(A→T)点突变的检测试剂盒及ARMS-QPCR检测方法，其特征在于：检测试剂盒包括PCR反应液Ⅰ、PCR反应液Ⅱ、混合酶液、DNA提取液、阴性对照液和阳性对照品；ARMS-QPCR检测方法包括样品采集、ARMS引物设计、样品处理等步骤。本发明提供的一种用于β-地中海贫血β17(A→T)点突变的检测试剂盒检测待检β-地中海贫血β17(A→T)点突变的DNA样品时，只需3小时即可完成检测，同时采用实时荧光定量PCR法检测β-地中海贫血β17(A→T)点突变基因特异性较强，检测灵敏度高，方法简单，误差小，准确度高。
【专利说明】—种用于β_地中海贫血β17(Α — Τ)点突变的检测试剂盒及ARMS-QPCR检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种用于β-地中海贫血β17(Α —Τ)点突变的检测试剂盒及ARMS-QPCR检测方法，属于分子生物学领域。
【背景技术】
[0002]β地中海贫血(β-mediterranean anemia)是指β链的合成受部分或完全抑制的一组血红蛋白病。患儿出生时无症状，多于婴儿期发病，生后3飞个月内发病者占50%，偶有新生儿期发病者。发病年龄愈早，病情愈重。严重的慢性进行性贫血，需依靠输血维持生命，3~4周输血I次，随年龄增长日益明显。
[0003]因本病多为点突变，故常用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)加等位基因特异性寡核苷酸杂交法(allele-specificoligonucleotide, AS0)才能明确突变点，我国各民族的β地中海贫血基因突变情况有一定差异，南方汉族的突变基因以CD41-42 (-TCTT)、CDL7 (Α — T)、IVS-11-654 (C — Τ)和 TATA_box28 (A — G)为主，占85%~90%。双重杂合子的突变组合可达近100种，β-地中海贫血β 17 (A —Τ)是众多β -地中海贫血突变位点中的一种，约占14%，它是由于17位碱基突变导致终止密码子TAG的形成，使β链不能合成。
[0004]扩增阻滞突变系统(amplificationrefractory mutation system, ARMS),又名等位基因特异PCR (allele specific PCR ,ASPCR),是验证性检测DNA序列变化的经典方法之一，典型的ARMS过程包含两个PCR扩增过程，引物有两对，它们的区别在于3’端不同，一条引物能与“正常”的靶DNA互补，另一条与“非正常”的靶DNA互补，因此两个扩增反应只能扩增“特定”的DNA模·板，因此要求3’末端核苷酸必须等位特异。
[0005]目前对该β -地中海贫血检测方法一般是采用PCR-反向点杂交法(PolymeraseChain Reaction -Reverse Dot Blot, PCR-RDB),该法是将特异的探针分别固定到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再将经PCR特异性扩增的产物(在PCR引物5’端预先进行生物素标记，使扩增产物相应标记有生物素)与之杂交，这样待检样本就会与具有同源序列的探针结合，经洗涤去除未结合的DNA样本，由于待测的DNA样本具有生物素类的标记物，结合了待测DNA的探针点上就带有生物素类的标记物，再经相应的显色反应就能显出杂交信号。这种以膜上固定探针取代固定靶DNA的方式，一次杂交反应可以检测多种靶序列，但是该法的基因检测技术需明确α、β珠蛋白基因的异常位点，检测时间长，检测灵敏度低，而且操作繁琐，不适用于大样本量的检测等缺点，基因检测技术需要送到专门检验单位去检查，费时费力。
[0006]实时荧光定量PCR检测在基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域都有广泛应用，其基本原理为:在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号强度，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图，见图1，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可进行定量分析。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种检测灵敏度高，且能安全、快速检测的用于地中海贫血β 17 (A-T)点突变的检测试剂盒并提供一种方法简单，误差小，准确度高，灵敏度高的一种用于地中海贫血β 17 (A-T)点突变的ARMS-QPCR检测方法。
[0008]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为:
一种用于β -地中海贫血β 17 (A — T)点突变的检测试剂盒，其特征在于:包括PCR反应液1、PCR反应液I1、混合酶液、DNA提取液、阴性对照液和阳性对照品；
所述PCR反应液I包括上游引物1、探针和下游引物；
所述PCR反应液II包括上游引物I1、探针和下游引物；
所述混合酶液包括DNA聚合酶、灭菌超纯水I和显色液；
所述DNA提取液包括苯酚和氯仿；
所述阴性对照液为不含有β -地中海贫血β 17 (A — T)基因的Tris-EDTA缓冲液，浓度为 0.01M~0.015Μ, pH 为 8.00~8.02 ；
PCR反应液I用于扩增出野生型阳性DNA模板；
PCR反应液II用于扩增出突变型阳性DNA模板；
所述上游引物I 3’位末端碱基为A，所述上游引物II 3’位末端碱基为T ；
上游引物I和上游引物II的末端碱基(A — T)错配使ARMS-QPCR检测方法更灵敏。
[0009]所述阳性对照品为使用β -地中海贫血β 17 (A — T)的DNA合成阳性模板，包括突变型阳性模板对照和野生型阳性模板对照；
所述上游引物1、上游引物I1、探针和下游引物的序列分别为:
上游引物 1:5’ -TCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCA-3’ ；
上游引物 I1:5，-TCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCT-3，；
探针:5’_(FAM) GGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGT(DABCYL)-3’ ；
下游引物:5’ -ACCCAAGAGTCTTCTCTGTCTCCACAT-3’。
[0010]所述PCR反应液I和PCR反应液II都还包括灭菌超纯水I1、缓冲液、氯化镁和dNTPsο
[0011]所述灭菌超纯水I1、缓冲液、氯化镁、dNTPs、上游引物1、上游引物I1、下游引物、探针、DNA聚合酶、灭菌超纯水I和显色液含量如下:
灭菌超纯水II 体积为11.4~4.8 μ?/管；
缓冲液浓度为5~15 X Buffer体积为2~4 μ I /管；
氯化镁浓度为20~30 mM体积为2~4 μ I /管；
dNTPs浓度为2.0~3.0mM体积为2~4 μ I /管；
上游引物I 浓度为30-100 μ M 体积为0.1~0.2 μ I /管；
上游引物II 浓度为30-100 μ M 体积为0.1~0.2 μ I /管；
下游引物浓度为30-100 μ M 体积为0.1~0.2 μ I /管； 探针浓度为30-100 μ M 体积为0.06~0.2 μ I /管；DNA聚合酶浓度为3~10U/ul体积为0.15~0.3 μ I /管；
显色液体积为0.01~0.02 μ I /管；
灭菌超纯水I 体积为1.84~1.68 μ I /管。
[0012]所述DNA聚合酶为Taq酶，所述显色液为溴酚蓝。
[0013]所述DNA提取液的提取方法为苯酚-氯仿抽提法。
[0014]一种用于β -地中海贫血β 17 (A-T)点突变的ARMS-QPCR检测方法，其特征在于:包括如下步骤:
步骤一:样品采集:
以β-地中海贫血的合成DNA模板为检测样本，所述检测样本个数大于16个，一部分检测样本中含有地中海贫血β 17 (A —Τ)突变型基因，另一部分检测样本中含有β -地中海贫血β 17 (A — T)野生型基因；
步骤二:ARMS引物设计:
设计两条上游引物、一条 下游引物和一条探针；
所述上游引物1、上游引物I1、探针和下游引物的序列分别为:
上游引物 1: 5 ’ -TCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCA-3，；
上游引物 I1: 5，-TCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCT-3，；
探针:5’ - (FAM) GGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGT (DABCYL)-3’ ；
下游引物:5’ -ACCCAAGAGTCTTCTCTGTCTCCACAT-3’ ；
所述上游引物I 3’位末端碱基为A，所述上游引物II 3’位末端碱基为T ；
步骤三:样品处理:将待检β -地中海贫血β 17 (A — T)点突变的DNA模板使用苯酚/氯仿抽提方法提取基因组DNA，获得DNA样品；
步骤四:配制含上游引物1、探针和下游引物的PCR反应液1:将上游引物1、探针和下游引物与灭菌超纯水I1、缓冲液、氯化镁和dNTPs混合均匀；
步骤五:配制含上游引物I1、探针和下游引物的PCR反应液I1:将上游引物I1、探针和下游引物与灭菌超纯水I1、缓冲液、氯化镁和dNTPs混合均匀；
步骤六:配制混合酶液:将DNA聚合酶、灭菌超纯水I和显色液混合均匀；
步骤七:反应和检测:
71)检测样本溶液的配置:依次取适量上述的DNA样品2份，在检测反应器中分别加入至含上游引物1、探针和下游引物的PCR反应液I中和含上游引物I1、探针和下游引物的PCR反应液II中；
72)阴性对照组溶液的配置:取适量Tris-EDTA缓冲液2份，分别加入至含上游引物1、探针和下游引物的PCR反应液I中和含上游引物I1、探针和下游引物的PCR反应液II中；
73)突变型阳性模板对照组溶液的配置:取适量突变型阳性模板对照，加入至含上游引物I1、探针和下游引物的PCR反应液II中；
74)野生型阳性模板对照组溶液的配置:取适量野生型阳性模板对照，加入至含上游引物1、探针和下游引物的PCR反应液I中；
75)将适量混合酶液分别加入至71-74各组PCR反应管中；
76)将步骤75所得的各组混合物同时放入荧光定量PCR仪中进行PCR反应并进行实时荧光定量PCR检测，分析结果。[0015]所述PCR反应的反应条件为:50~55°C反应2~5min，94~95°C反应2~3min，94~95°C反应5~10s，55~60°C反应40~80s，35~39个循环。
[0016]所述上游引物I和上游引物II的3’末端分别与野生型和突变型碱基匹配，共用下游引物和探针。
[0017]所述上游引物I和上游引物II的3’末端为碱基错配，所述碱基错配方式为A — T。
[0018]本发明提供的一种用于β -地中海贫血β 17 (A — T)点突变的检测试剂盒检测待检β -地中海贫血β 17 (A — T)点突变的DNA样品时，只需3小时即可完成检测，同时采用实时荧光定量PCR法检测β-地中海贫血β17 (A-T)点突变基因特异性较强，检测灵敏度高，有效克服了地中海贫血PCR-反向点杂交法在基因检测技术中存在的周期长、操作繁琐，需要送到专门检测单位的缺点。本发明提供的一种用于β_地中海贫血β 17(A — T)点突变的ARMS-QPCR检测方法，只需获取待检β -地中海贫血β 17 (A-T)点突变的DNA样品，然后加入上述一种用于β-地中海贫血β 17 (A-T)点突变的检测试剂盒，检测即可，方法简单，误差小，准确度高。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为荧光扩增曲线图；
图2为本发明ARMS-QPCR检测方法的流程图；
图3为本发明检测组的突变型样本检测结果图，荧光扩增曲线图Ct值< 35，具有明显指数增长；
图4为本发明检测组的野生型样本检测结果图，荧光扩增曲线图Ct值< 35，具有明显指数增长；· 图5为本发明阴性对照组的检测结果图；
图6是本发明突变型阳性模板对照组检测结果图；
图7是本发明野生型阳性模板对照组检测结果图。
【具体实施方式】
[0020]下面结合附图对本实用作更进一步的说明。
[0021]实施例1:
如图1-7所示，一种用于β_地中海贫血β17 (A-T)点突变的检测试剂盒，其特征在于:包括PCR反应液1、PCR反应液I1、混合酶液、DNA提取液、阴性对照液和阳性对照品；所述PCR反应液I包括上游引物1、探针和下游引物；
所述PCR反应液II包括上游引物I1、探针和下游引物；
所述混合酶液包括DNA聚合酶、灭菌超纯水I和显色液；
所述DNA提取液包括苯酚和氯仿；
所述阴性对照液为不含有β -地中海贫血β 17 (A — T)基因的Tris-EDTA缓冲液，浓度为 0.01Μ, pH 为 8.00 ；
所述阳性对照品为使用β_地中海贫血β17 (A-T)的DNA合成阳性模板，包括突变型阳性模板对照和野生型阳性模板对照；
所述上游引物1、上游引物I1、探针和下游引物的序列分别为:上游引物 1: 5 ’ -TCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCA-3 ’ ；
上游引物 I1: 5，-TCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCT-3，；
探针:5’ - (FAM) GGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGT (DABCYL)-3’ ；
下游引物:5’ -ACCCAAGAGTCTTCTCTGTCTCCACAT-3’。
[0022]所述PCR反应液I和PCR反应液II都还包括灭菌超纯水I1、缓冲液、氯化镁和dNTPsο
[0023]所述灭菌超纯水I1、缓冲液、氯化镁、dNTPs、上游引物1、上游引物I1、下游引物、探针、DNA聚合酶、灭菌超纯水1、显色液、阴性对照液、突变型阳性模板对照和野生型阳性模板对照含量如下:
灭菌超纯水II 体积为11.4 μ I /管；
缓冲液浓度为5 X Buffer体积为2 μ I /管；
氯化镁浓度为20 mM体积为2 μ I /管；
dNTPs浓度为2.0mM体积为2.0 μ I /管；
上游引物I 浓度为30 μ M 体积为0.1 μ I /管；
上游引物II 浓度为30 μ M 体积为0.1 μ? /管；
下游引物浓度为30 μ M 体积为0.1 μ?/管；` 探针浓度为30 μ M 体积为0.06 μ I /管；
DNA聚合酶浓度为3U/ul体积为0.15 μ I /管；
显色液体积为0.01 μ I /管；
灭菌超纯水I 体积为1.84 μ I /管；
阴性对照液置于阴性对照管内，规格I管，40 μ I/管；
突变型阳性模板对照置于阳性对照管内，规格I管，40 μ I/管；
野生型阳性模板对照置于阳性对照管内，规格I管，40 μ I/管。
[0024]所述DNA聚合酶为Taq酶,所述显色液为溴酚蓝。
[0025]所述DNA提取液的提取方法为苯酚-氯仿抽提法。
[0026]一种用于β -地中海贫血β 17 (A-T)点突变的ARMS-QPCR检测方法，其特征在于:包括如下步骤:
步骤一:样品采集:
以β -地中海贫血的合成DNA模板为检测样本，所述检测样本个数大于6个，一部分检测样本中含有β-地中海贫血β 17 (A —Τ)突变型基因，另一部分检测样本中含有β-地中海贫血β 17 (A — T)野生型基因；
步骤二:ARMS引物设计:
设计两条上游引物、一条下游引物和一条探针；
所述上游引物1、上游引物I1、探针和下游引物的序列分别为:
上游引物 1:5’ -TCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCA-3’ ；
上游引物 I1:5，-TCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCT-3，；
探针:5’_(FAM) GGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGT(DABCYL)-3’ ；
下游引物:5’ -ACCCAAGAGTCTTCTCTGTCTCCACAT-3’ ；
步骤三:样品处理:将待检β -地中海贫血β 17 (A — T)点突变的DNA模板使用苯酚/氯仿抽提方法提取基因组DNA，获得DNA样品；
步骤四:配制含上游引物1、探针和下游引物的PCR反应液I ;
步骤五:配制含上游引物I1、探针和下游引物的PCR反应液II ；
步骤六:配制混合酶液；
步骤七:反应和检测:
71)检测样本溶液的配置:依次取5μI上述的DNA样品2份，在检测反应器中分别加入至18 μ I含上游引物1、探针和下游引物的PCR反应液I中和18 μ I含上游引物I1、探针和下游引物的PCR反应液II中；
72)阴性对照组溶液的配置:取5μ ITris-EDTA缓冲液2份，分别加入至18 μ I含上游引物1、探针和下游引物的PCR反应液I中和18 μ I含上游引物I1、探针和下游引物的PCR反应液II中；
73)突变型阳性模板对照组溶液的配置:取5μ I突变型阳性模板对照，加入至18 μ I含上游引物I1、探针和下游引物的PCR反应液II中；
74)野生型阳性模板对照组溶液的配置:取5μ I野生型阳性模板对照，加入至18 μ I含上游引物1、探针和下游引物的PCR反应液I中；
75)将0.5ml混合酶液分别加入至71-74各组PCR反应管中；
76)将步骤75所得的各组混合物同时放入荧光定量PCR仪中进行PCR反应并进行实时荧光定量PCR检测，分析结果。
[0027]所述PCR反应的反应条件为:50°C反应2min，94°C反应2min，94°C反应5s，55°C反应40s，39个循环。
[0028]所述上游引物I和上游引物II的3’末端分别与野生型和突变型碱基匹配，共用下游引物和探针。
[0029]所述上游引物I和上游引物II的3’末端为碱基错配，所述碱基错配方式为A — T。
[0030]进行上述试验操作时平行进行PCR-反向点杂交法的对比试验:所述对比试验的步骤如下:
1)采集含有β-地中海贫血β17 (A —Τ)的样本，该对比实例的样本和本发明的检测样本一致,得到β -地中海贫血β 17 (A — T)的DNA样品；
2)反应及检测:采集含有β_地中海贫血β17(A-T)的样本，使用特异性标记的引物进行PCR扩增，扩增产物与固定在膜上的寡核苷酸探针进行杂交，结果进一步进行显色反应。
[0031]采用本发明的检测试剂盒进行β -地中海贫血β 17 (A — T)检测只需要约3h，且本发明的检测试剂盒的检测结果与PCR-反向点杂交法检测结果一致，而PCR-反向点杂交法检测地中海贫血β17 (A-T)则需要48h以上，而且花费成本较高，操作繁琐，因此，从以上结果可以看出，本发明实施例的地中海贫血β17 (A-T)检测试剂盒与PCR-反向点杂交法相比，在检测β-地中海贫血β 17 (A-T)方面具有快速、灵敏、安全等优点，可应用于地中海贫血β17 (A-T)的检测。
[0032]实施例2:
如图1-7所示，一种用于β-地中海贫血β 17 (A —Τ)点突变的检测试剂盒，
所述阴性对照液为不含有β -地中海贫血β 17 (A — T)基因的Tris-EDTA缓冲液，浓度为 0.015M, pH 为 8.02 ；
所述灭菌超纯水I1、缓冲液、氯化镁、dNTPs、上游引物1、上游引物I1、下游引物、探针、DNA聚合酶、灭菌超纯水I和显色液含量如下:
灭菌超纯水II 体积为4.8 μ I /管；
缓冲液浓度为15 X Buffer体积为4 μ I /管；
氯化镁浓度为30 mM体积为4 μ I /管；
dNTPs浓度为3.0mM体积为4 μ I /管；
上游引物I浓度为100 μ M 体积为0.2 μ I /管；
上游引物II 浓度为100 μ M 体积为0.2 μ? /管；
下游引物浓度为100 μ M 体积为0.2 μ? /管；
探针浓度为100 μ M 体积为0.2 μ I /管；
DNA聚合酶浓度为lOU/ul体积为0.3 μ I /管；
显色液体积为0.02 μ I /管；
灭菌超纯水I 体积为1.68 μ I /管。
[0033]其余均同实施例1。
[0034]以上所述仅是本发 明的优选实施方式，应当指出:对于本【技术领域】的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【权利要求】
1.一种用于β-地中海贫血β17 (A-T)点突变的检测试剂盒，其特征在于: PCR反应液I包括上游引物1、探针和下游引物，用于扩增出野生型阳性DNA模板； PCR反应液II包括上游引物I1、探针和下游引物，用于扩增出突变型阳性DNA模板； 所述上游引物I 3’位末端碱基为Α，所述上游引物II 3’位末端碱基为Τ。
2.根据权利要求1所述的一种用于β_地中海贫血β17(A-T)点突变的检测试剂盒，其特征在于:所述上游引物1、上游引物I1、探针和下游引物的序列分别为:
上游引物 1: 5 ’ -TCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCA-3，；
上游引物 I1: 5，-TCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGCT-3，；
探针:5’ - (FAM) GGCCCTGGGCAGGTTGGTATCAAGGT (DABCYL)-3’ ； 下游引物:5’ -ACCCAAGAGTCTTCTCTGTCTCCACAT-3’。
3.根据权利要求1所述的一种用于β_地中海贫血β17(A-T)点突变的检测试剂盒，其特征在于:试剂盒还包括混合酶液、DNA提取液、阴性对照液和阳性对照品，所述混合酶液包括DNA聚合酶、灭菌超纯水I和显色液，所述PCR反应液I和PCR反应液II均还包括灭菌超纯水I1、缓冲液、氯化镁和dNTPs。
4.根据权利要求1或3所述的一种用于β-地中海贫血β 17 (A — T)点突变的检测试剂盒，其特征在于:所述灭菌超纯水I1、缓冲液、氯化镁、dNTPs、上游引物1、上游引物I1、下游引物、探针、DNA聚合酶、灭菌超纯水I和显色液含量如下: 灭菌超纯水II 体积为11.4~4.8 μ?/管； 缓冲液浓度为5~15 X Buffer体积为2~4 μ I /管； 氯化镁浓度为20~30 mM体`积为2~4 μ I /管； dNTPs浓度为2.0~3.0mM体积为2~4 μ I /管； 上游引物I 浓度为30-100 μ M 体积为0.1~0.2 μ I /管； 上游引物II 浓度为30-100 μ M 体积为0.1~0.2 μ I /管； 下游引物浓度为30-100 μ M 体积为0.1~0.2 μ I /管； 探针浓度为30-100 μ M 体积为0.06~0.2 μ I /管； DNA聚合酶浓度为3~10U/ul体积为0.15~0.3 μ I /管； 显色液体积为0.01~0.02 μ I /管； 灭菌超纯水I 体积为1.84~1.68 μ I /管。
5.根据权利要求1所述的一种用于β_地中海贫血β17(A-T)点突变的检测试剂盒，其特征在于:所述DNA聚合酶为Taq酶，所述显色液为溴酚蓝。
6.根据权利要求1所述的一种用于β_地中海贫血β17(A-T)点突变的检测试剂盒，其特征在于:所述DNA提取液的提取方法为苯酚-氯仿抽提法。
7.一种用于β-地中海贫血β17 (A-T)点突变的ARMS-QPCR检测方法，其特征在于:包括如下步骤: 样品采集:以β -地中海贫血的合成DNA模板为检测样本； 样品处理:将待检β -地中海贫血β 17 (A-T)点突变的DNA模板使用苯酚/氯仿抽提方法提取基因组DNA,犾得DNA样品； 样品检测:将获得的DNA样品进行荧光定量PCR检测，荧光定量PCR检测步骤中使用一种用于地中海贫血β17 (A-T)点突变的检测试剂盒。
8.根据权利要求7所述的一种用于β-地中海贫血β17 (A-T)点突变的ARMS-QPCR检测方法，其特征在于:所述PCR反应的反应条件为:50-55 V反应2飞min，94~95 V反应2~3min，94~95°C反应5~10s，55~60°C反应40~80s，35~39个循环。
9.根据权利要求7或8所述一种用于β-地中海贫血β17 (A-T)点突变的ARMS-QPCR检测方法在一种用于β-地中海贫血β 17 (A-T)点突变的检测试剂盒中的应用 。
【文档编号】C12Q1/68GK103589793SQ201310528510
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年10月30日 优先权日:2013年10月30日
【发明者】龚剑, 王新旺, 吴晶萍, 熊许洁 申请人:苏州发士达生物科技有限公司