反向调节烟草NtPSY基因功能的载体组合物的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种载体组合物，其中至少一个载体含有烟草NtPIF1基因编码，至少另外一个载体含有烟草NtRAP2.2基因编码。本发明的载体组合物能够相互促进来反向调节烟草中PSY基因的表达，在调节烟草类胡萝卜素代谢合成中具有应用前景。
【专利说明】反向调节烟草NtPSY基因功能的载体组合物
【技术领域】:
[0001]本发明属于分子生物学领域，具体而言，涉及ー种反向调节烟草NtPSY基因功能的载体组合物。
【背景技术】:
[0002]类胡萝卜素(Carotenoids)是ー类重要的天然色素的总称，普遍存在于动物、高等植物、真菌、藻类中的黄色、橙红色或红色的色素之中。迄今，被发现的天然类胡萝卜素已达600多种，在人体中存在的主要有a-胡萝卜素、卜胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质、(6-隐黄素以及番茄红素等，前四种具有维生素A活性(即可以转化为视黄醛)。Lei等研究表明通过不同特色烟叶生态区成熟期烟叶基因表达谱比较分析发现类胡萝卜素合成途径基因在不同生态区的表达具有显著差异，合成的类胡萝卜素物质含量与基因表达趋势吻合，表明这些物质的差异可能对烟叶特色风格形成有一定的影响。
[0003]尽管在其他植物中类胡萝卜素合成的主要途径已有大量的研究，但对其在细胞水平如何进行转录调节还不清楚。到目前为止，仅在拟南芥中发现光敏色素互作因子(phytochrome-1nteracting factorl, PIF1)能够直接调节类胡萝卜素合成途径基因的表达。在不同的植物中，类胡萝卜素途径中的第一个主要驱动酶均为八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase, PSY),当PSY表达量迅速上调后,植物体内的类胡萝卜素将立刻大量积累。在红光和远红光外下，PSY的表达受光受体的光敏色素基因家族调控。
[0004]光敏色素存在两种光逆形式:Pr吸收红光，Pfr吸收远红外光。当吸收红光的Pr在暗处处于失活状态吋，Pf r形式将被激活并重新定位到细胞核，并与信号因子互作最终将光信号转换为基因表达调节和生理响应。这些细胞核组分主要是PIF因子的bHLH转录因子亚家族。PIF是光调节响应的主要调节因子，至少有4个成员是暗处抑制光形态发育所必须的(PIF1、PIF3、PIF4和PIF5)。当幼苗处于红光下时，光激活的光敏色素Pfr形式与PIFs直接互作导致其磷酸化或蛋白酶调节的降解，使光形态得以继续发育。在暗处，PIFs的抑制能导致PSY基因表达与活性的上调，从而导致类胡萝卜素合成的増加，表明PIFs可能通过结合PSY基因启动子中的相应元件，实现对植物整个生育期类胡萝卜素合成的调节。另ー个AP2类型的转录因子RAP2.2 (RELATED TO AP22)被发现能够绑定启动子顺式调节元件ATCTA-motif。因此对烟草NtPSY基因的分子调控对烟草类胡萝卜素合成途径物质的转录调控具有重要的意义，也对判断烟叶的风格特色有着重要的意义。
[0005]经过检索，中国专利数据库中未发现关于烟草中NtPSY基因调控的专利，而现有的技术文献也没有相关的报道。
[0006]但在烟草中，NtPSY的调控机制还未见报道。
【发明内容】
[0007]本发明的目的在于具有协同作用的载体组合物，为了实现本发明的目的，拟采用如下技术方案:[0008]本发明另一方面涉及ー种载体混合物，其中一个载体含有NtPIFl基因编码，另外一个载体含有NtRAP2.2基因编码。
[0009]在本发明的ー个优选实施方式中，所述的NtPIFl和NtRAP2.2的基因编码分别为SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的序列分别经过BamHI/XhoI和BamHI/Sall双酶切之后的片段。
[0010]本发明另一方面还涉及上述载体的制备方法，其特征在于包括如下步骤:
[0011]利用表1 中的引物(NtPIFl-eF cgGGATCCATGAATCATTCAGTTCCTGATTTTGATATGGATG/NtPIFl-eR cgCTCGAGCAATATGCAACAACTAGACTTTTCGATGGTG 和 NtRAP2.2_eFcgGGATCCATGTGCGGTGGTGCCATAATCTC/NtRAP2.2_eR acgcGTCGACATAGACACCTCTCATTAGAGAAGAAAGTTC)，扩增SEQ ID N0.1和SEQIDN0.2所示的NtPIFl和NtRAP2.2基因的编码区序列，扩增产物胶回收后以BamHI/XhoI和BamHI/Sall双酶切并再次胶回收；
[0012]带Hi s标签的重组蛋白表达载体pET28a和GST标签的pGEX_4T I载体分别以BamHI/XhoI和BamHI/Sall双酶切，回收载体骨架；
[0013]分别将NtPIFl和NtRAP2.2表达片段连接至pET28a和pGEX_4Tl载体，构建成pET-NtPIFl 和 pGEX-NtRAP2.2 载体。
[0014]在本发明的另一方面，还涉及上述载体的另外ー种制备方法，其特征在于包括如下步骤:
[0015]用表1 中的引物(NtPIFl-yF cgGAATTCATGAATCATTCAGTTCCTGATTTTGATATGGATG/NtPIFl-yR cgGGATCCCAATATGCAACAACTAGACTTTTCGATGGTG 和 NtRAP2.2-yFcgGAATTCATGTGCGGTGGTGCCATAATCTC/NtRAP2.2-yR cgGGATCCATAGACACCTCTCATTAGAGAAGAAAGTTC)扩增出 SEQ ID N0.1 和 SEQ ID N0.2 所示的 NtPIFl 和 NtRAP2.2 基因编码区，通过EcoRI和BamHI酶切连接到pGBKI7和pGADI7双元表达载体中，构建成激活域载体pGAD-NtPIFl 和 pGAD-NtRAP2.`2，绑定域载体 pGBK_NtPIFl 和 pGBK_NtRAP2.2，获得含有pGAD-NtPIFl 与 pGBK-NtRAP2.2 及 pGAD_NtRAP2.2 和 pGBK_NtPIFl 质粒载体组合物。
[0016]本发明另一方面还涉及上述载体组合物在反向调节烟草中NtPSY基因的用途。
[0017]本发明另一方面还涉及上述载体组合物在调节烟草类胡萝卜素代谢合成中的应用。
[0018]本发明的载体组合物能够相互促进来反向调节烟草中NtPSY基因的表达，在调节烟草类胡萝卜素代谢合成中具有应用前景。
【具体实施方式】
[0019]材料
[0020]植物材料为烟草栽培品种K326。质粒与菌株:大肠杆菌菌株DH5 a和BL21 (DE3)、农杆菌菌株GV3101及酵母表达菌株AH109为商购。T-载体pGEM_T
easy 购自美国 Promega 公司。cDNA 反转录试剂盒 Invitrogen SuperScript? III
First-Strand Synthesis SuperMix、 InvitrogenlKb Plus DNA Ladder DNA marker、
Invitrogen pENTR?/D-TOPO? Cloning Kit 购自 Invitrogen 公司;胶回收试剂盒
Pormega Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System 购自 Pormega 公司；质粒提取试剂盒QIAGEN Plasmid Mini Kit、RNA提取试剂盒QIAGEN RNeasy Plant Mini Kit和DNA提取试剂盒 QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit 购自 QIAGEN 公司；定量PCR试剂盒Bio-Rad iQ SYBRGreen Supermix 购自 Bio-Rad 公司；Phlision? Hot Start Flex DNA Polymerase 购自
NEB公司；其它分子生物学试剂购自SIGMA有限公司。
[0021]总DNA和RNA提取及純化
[0022]烟草叶片总DNA和RNA提取采用QIAGEN公司的相应试剂盒以试剂盒提供的标准方法进行提取。核酸浓度和质量采用NanoDrop2000超微量分光光度计检测。RNA样品中基因组DNA的去除，使用QIAGEN RNase-Free DNase Set中的DNaseI在室温下反应30分钟，甲醛变性胶电泳检测RNA完整性及基因组DNA是否被去除。
[0023]重组蛋白表达与纯化
[0024]利用表1 中的引物(NtPIFl-yF cgGAATTCATGAATCATTCAGTTCCTGATTTTGATATGGATG/NtPIFl-yR cgGGATCCCAATATGCAACAACTAGACTTTTCGATGGTG 和 NtRAP2.2-yFcgGAATTCATGTGCGGTGGTGCCATAATCTC/NtRAP2.2-yR cgGGATCCATAGACACCTCTCATTAGAGAAGAAAGTTC),扩增NtPIFl和NtRAP2.2基因的编码区序列，扩增产物胶回收后以BamHI/XhoI和BamHI/Sall双酶切4h并再次胶回收測定产物浓度。带His标签的重组蛋白表达载体pET28a和GST标签的pGEX_4Tl载体分别以BamHI/XhoI和BamHI/Sall双酶切4h，回收载体骨架。分别将NtPIFl和NtRAP2.2表达片段连接至pET28a和pGEX_4Tl载体，构建成pET-NtPIFl 和 pGEX-NtRAP2.2 载体用于 His-NtPIFl 和 GST_NtRAP2.2 蛋白表达。将构建好的蛋白表达载体导入大肠杆菌蛋白表达菌株BL21(DE3)或Rosetta(DE3)中，在含有相应抗性的LB平板上生长并筛选阳性克隆。蛋白诱导步骤參考《pET系统操作手册》(Novagen)。His-NtPIFl 纯化采用 QIAGEN公司的 N1-NTAAgarose，GST_NtRAP2.2 蛋白纯化采用 SIGMA 公司的Glutathione-agarose,`以超声破碎法提取并纯化蛋白。SDS-PAGE电泳、Western blot參考《分子克隆实验指南》(第三版)。
[0025]表1所用引物列表
[0026]
【权利要求】
1.ー种载体组合物，其中至少ー个载体含有SEQ ID N0.1所示的NtPIFl基因编码，至少另外一个载体含有SEQ ID N0.2所示的NtRAP2.2基因编码。
2.根据权利要求1所述的载体组合物，所述的NtPIFl和NtRAP2.2的基因编码分别为SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的序列分别经过BamHI/XhoI和BamHI/Sall双酶切之后的片段。
3.根据权利要求1所述的载体组合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤: 利用表 I 中的引物 NtPIFl-eF cgGGATCCATGAATCATTCAGTTCCTGATTTTGATATGGATG/NtPIFl-eR cgCTCGAGCAATATGCAACAACTAGACTTTTCGATGGTG 和 NtRAP2.2_eFcgGGATCCATGTGCGGTGGTGCCATAATCTC/NtRAP2.2_eR
acgcGTCGACATAGACACCTCTCATTAGAGAAGAAAGTTC，扩增 SEQ ID N0.1 和 SEQIDN0.2 所示的NtPIFl和NtRAP2.2基因的编码区序列，扩增产物胶回收后以BamHI/XhoI和BamHI/Sall双酶切并再次胶回收； 带His标签的重组蛋白表达载体pET28a和GST标签的pGEX_4Tl载体分别以BamHI/XhoI和BamHI/Sall双酶切，回收载体骨架； 分别将NtPIFl和NtRAP2.2表达片段连接至pET28a和pGEX_4Tl载体，构建成pET-NtPIFl 和 pGEX-NtRAP2.2 载体。
4.根据权利要求1所述的载体组合物的制备方法，其特征在于包括如下步骤: 用表 I 中的引物 NtPIFl-yF cgGAATTCATGAATCATTCAGTTCCTGATTTTGATATGGATG/NtPIFl-yR cgGGATCCCAATATGCAACAACTAGACTTTTCGATGGTG 和 NtRAP2.2-yFcgGAATTCATGTGCGGTGGTGCCATAA`TCTC/NtRAP2.2-yR
cgGGATCCATAGACACCTCTCATTAGAGAAGAAAGTTC 扩增出 SEQIDN0.1 和 SEQIDN0.2 所示的NtPIFl和NtRAP2.2基因编码区，通过EcoRI和BamHI酶切连接到pGBKI7和pGADI7双元表达载体中，构建成激活域载体pGAD-NtPIFl和pGAD-NtRAP2.2，绑定域载体pGBK_NtPIFl和 pGBK-NtRAP2.2，获得含有 pGAD-NtPIFl 与 pGBK_NtRAP2.2 及 pGAD_NtRAP2.2 和PGBK-NtPIFl质粒载体组合物。
5.根据权利要求1或2所述的载体组合物载体组合物在反向调节烟草中NtPSY基因的用途。
6.根据权利要求1或2所述的载体组合物载体组合物在调节烟草类胡萝卜素代谢合成中的应用。
【文档编号】C12N15/63GK103555748SQ201310528496
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月30日 优先权日:2013年10月30日
【发明者】雷波, 丁福章, 卢坤, 赵会纳, 任竹, 蔡凯, 潘文杰 申请人:贵州省烟草科学研究院