专利名称：蛋白IbGGPS及编码基因与在调控植物类胡萝卜素含量中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种蛋白IbGGPS及编码基因与在调控植物类胡萝卜素含量中的应用。
背景技术：
自然界中，类胡萝卜素广泛存在于植物、真菌、藻类、细菌体内，呈现由黄到红的颜色变化，动物无法自身合成，需要直接或间接地从植物、真菌、细菌等中摄取。类胡萝卜素是动物和人类必需的微量营养物质，可合成视黄素、清除自由基，预防癌症、心血管及老年性疾病等。类胡萝卜素的缺乏，会严重影响人类的健康，夜盲症即缺乏Va所致。夜盲症初期通过摄入适量的β_胡萝卜素即可痊愈。面对全球特别是非洲部分国家Va缺乏的现状，有人提出通过服用Va解决，但从长远看，服用Va操作难度较大、加之Va摄入过多会引起中毒，因此从日常饮食中摄取Va的前体β-胡萝卜素是一条经济安全的途径。但在人类主食中，通常缺乏这些微量营养物质，因此深入研究其合成机制，并从基因水平上操纵其生物合成，将有效地提高作物、果蔬等的类胡萝卜素等微量营养物质的含量。类胡萝卜素的生物合成是由一系列核基因编码的酶催化反应完成的。高等植物类胡萝卜素是由类异戊二烯聚合而成的萜类化合物，其生物合成的前体是含有C5的异戊二烯焦磷酸(IPP)。IPP在IPP异构酶(IPPI)作用下生成二甲基丙烯基二磷酸(DMAPP)。然后在栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶(GGPS)催化下，DMAPP与3个IPP缩合依次形成栊牛儿基焦磷酸(GPP)、法尼西焦磷酸(FPP)、栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸(GGPP)。两分子GGPP由八氢番爺红素合成酶(phytoene synthase, PSY)催化形成第一个C4tl的类胡萝卜素一八氢番爺红素(Phytoene)。八氢番爺红素(Phytoene)由八氢番爺红素脱氢酶(PDS)、ζ _胡萝卜素脱氢酶(ZDS)和类胡萝卜素 异构酶(CRTISO) 3个酶共同催化形成番茄红素(Lycopene)。自番茄红素以下反应分成两条支路，一条是经连续两次环化反应生成胡萝卜素，由番爺红素β -环化酶(Lycopene β-cyclase, LCY-B)催化完成；另一条是生成α -胡萝卜素，由LCY-B和番爺红素ε -环化酶(Lycopene ε -cyclase, LCY-E)催化完成。类胡萝卜素尤以β_胡萝卜素是维生素A的前体，具有免疫和抗氧化功能，其药用潜力引起人们的极大关注。
发明内容
本发明的一个目的是提供蛋白IbGGPS及编码基因。本发明所提供的蛋白IbGGPS,来源于甘薯(Ipomoea batatas),是如下(a)或(b)的蛋白质:(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物组织中类胡萝卜素含量相关的由序列2衍生的蛋白质。
上述序列2有363个氨基酸残基组成。上述蛋白中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。上述类胡萝卜素为如下I)或2):I)由胡萝卜素、玉米黄素、叶黄素、隐黄质和α-胡萝卜素组成的类胡萝卜素；2) α-胡萝卜素或β-胡萝卜素；上述组织为叶片，上述植物为双子叶植物或单子叶植物。上述双子叶植物为烟草(Nicotiana tabacum)或甘暮(Ipomoea batatas)。编码上述蛋白的DNA分子也是本发明保护的范围。上述DNA分子是如下(1)-(3)中任一种的DNA分子:(I)编码区为序列表中序列I所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且编码与植物组织中类胡萝卜素含量相关蛋白的DNA分子；(3)与(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码与植物组织中类胡萝卜素含量相关蛋白的DNA分子。上述序列I由109 2个碱基组成，其开放阅读框(ORF)为自5'末端第I位一第1092位喊基，编码氣基酸序列是序列表中序列2所的蛋白。上述严格条件为:50°C，在7% SDS,0.5M NaPOjP ImM EDTA的混合溶液中杂交，在65。。，0.1XSSC,0.1%SDS中漂洗；也可为:在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65° C下杂交，然后用 2 X SSC, 0.1%SDS 和 I X SSC, 0.1%SDS 各洗膜一次。含有上述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。上述重组载体为将编码上述蛋白的DNA分子插入表达载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。在本发明的实施例中，表达载体为pCB⑶S，上述重组载体为将序列表中序列I所示的DNA分子插入pCB⑶S中，替换掉表达载体pCB⑶S中的gusA报告基因；得到表达上述蛋白的重组载体；上述重组载体具体可为将序列表中序列I所示的DNA分子取代pCB⑶S的BamH I和Sac I酶切位点间的小片段(gusA报告基因)得到的重组载体。所述载体pCB⑶S是通过包括如下步骤的方法得到的:(I)将pCAMBIA1301载体经过HindIII和EcoRI双酶切，回收11786bp载体大片段；(2)将pBI121载体经过HindIII和EcoRI双酶切，回收包含gusA基因的3032bp的片段；(3)将步骤(I)中回收的11786bp载体大片段与步骤(2)中回收的包含gusA基因的3032bp的片段连接，得到重组载体pCB⑶S。所述pCAMBIA1301载体购自CAMBIA公司；所述pBI121载体购自Clontech公司。扩增上述DNA分子全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。
所述引物对为如下I)或2)所示:I)由序列表中序列3所示的DNA片段和序列表中序列4所示的DNA片段组成的引物对；2)由序列表中序列5所示的DNA片段和序列表中序列6所示的DNA片段组成的引物对。上述蛋白、上述DNA分子或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物组织中类胡萝卜素含量中的应用也是本发明保护的范围。上述应用中，所述类胡萝卜素为如下I)或2):I)由β -胡萝卜素、玉米黄素、叶黄素、β -隐黄质和α -胡萝卜素组成的类胡萝卜素；2) α-胡萝卜素、叶黄素或β-胡萝卜素；所述组织为叶片，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。上述双子叶植物为烟草(Nicotiana tabacum)或甘暮(Ipomoea batatas)。上述调控植物组织中类胡萝卜素含量为提高植物组织中类胡萝卜素含量，提高植物组织中类胡萝卜素含量具体体现在如下I)或2):I)提高由胡萝卜素、玉米黄素、叶黄素、隐黄质和α-胡萝卜素组成的类胡萝卜素总体含量；
2)提高α -胡萝卜素含量、提高叶黄素含量或提高β -胡萝卜素含量。本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。本发明所提供的培育转基因植物的方法，为将编码上述蛋白的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物组织中类胡萝卜素含量高于所述目的植物。编码上述蛋白的DNA分子是通过所述重组载体导入目的植物中。在上述方法中，所述组织为叶片，所述类胡萝卜素为如下I)或2):I)由β -胡萝卜素、玉米黄素、叶黄素、β -隐黄质和α -胡萝卜素组成的类胡萝卜素；2) α-胡萝卜素、叶黄素或β-胡萝卜素；所述植物为双子叶植物或单子叶植物。上述双子叶植物为烟草(Nicotianatabacum)或甘暮(Ipomoea batatas)。上述提高植物组织中类胡萝卜素含量，提高植物组织中类胡萝卜素含量具体体现在如下I)或2):I)提高由胡萝卜素、玉米黄素、叶黄素、隐黄质和α-胡萝卜素组成的类胡萝卜素总体含量；2)提高α -胡萝卜素含量、提高叶黄素含量或提高β -胡萝卜素含量。本发明的实验证明，本发明提供了一种IbGGPS蛋白及其编码基因，将该基因导入野生型烟草中，得到转IbGGPS烟草，检测转IbGGPS烟草叶片中类胡萝卜素含量，发现转IbGGPS烟草叶片中由β_胡萝卜素、玉米黄素、叶黄素、β_隐黄质和α-胡萝卜素组成的类胡萝卜素含量提高，其中α-胡萝卜素含量或β-胡萝卜素含量均提高。说明IbGGPS基因过表达可以提高烟草中α-胡萝卜素、β_胡萝卜素和总类胡萝卜素的含量。
图1为转IbGGPS烟草植株的PCR检测结果2为混合标样中β-胡萝卜素(β-carotene)、玉米黄素(zeaxanthin)、叶黄素(lutein)、β -隐黄质(β-cryptoxanthin)和α -胡萝卜素(a-carotene)的标准曲线图
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、与甘薯栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶相关的蛋白及其编码基因的获得—、与与甘薯栊牛儿基栊牛儿基焦磷酸合成酶相关的蛋白及其编码基因的获得(一)甘薯(Ipomoeabatatas) IbGGPS 蛋白 cDNA 的克隆实验材料:将农大辐14 (高系14号的高类胡萝卜素含量突变体)(公众可从中国农业大学获得，记载过农大福14 (Nongdaful4)的非专利文献是:Wang YP, Wang F，Zhai H, LiuQC.Production of a useful mutant by chronic irradiation in sweetpotat0.ScientiaHorticulturael 11，2007:173 - 178 ；)在大田种植约90天，块根膨大前期收获直径3 4cm的块根，液氮速冻，-80 ° C保存。 1、块根总RNA提取和纯化取农大辐14膨大块根约2g，在液氮中研磨成粉状，加入IOmL离心管，用Applygen植物RNA提取试剂盒(Applygen Technologies Inc, Beijing)提取甘薯块根总RNA,试剂盒中包括:Plant RNA Reagent,植物组织裂解、分离RNA、去除植物多糖和多酹！ExtractionReagent，有机抽提去除蛋白质、DNA、多糖和多酚；Plant RNA Aid，去除植物多糖多酚和次生代谢产物。利用 QIAGEN Oligotex Mini mRNA Kit (QIAGEN，GmbH，Germany)从总 RNA 中纯化mRNA。最后，取I μ L于1.2%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，另取2 μ L稀释至500 μ L，用紫外分光光度计检测其质量(OD26tl)和纯度(OD26tlA)D28tl),提取的农大辐14的块根总RNA，经非变性胶琼脂糖凝胶电泳检测，28S和18S条带清晰，且二者亮度比值为1.5 2: 1，表明总RNA没有降解，纯化所得mRNA符合实验要求，可用于甘薯IbGGPS蛋白cDNA全长的克隆。2、IbGGPS蛋白cDNA的全长克隆以本实验室获得的IbGGPS EST片段设计引物进行IbGGPS蛋白cDNA的全长克隆。(1)3' -RACE以农大辐14块根cDNA为模板，用IbGGPS EST正向引物I及Takara RNA PCRKit (AMV).3.0 (购自北京六合通经贸有限公司，产品编号DRR019A)中的M13Primer M4引物I引物2作为反向引物进行PCR反应。引物序列如下:引物1:5' -CTATTCCAGGTGGTGGAT-3，引物2:5' -GTTTTCCCAGTCACGAC-3，PCR得到的3' RACE片段，回收后连接pGEM T-Easy载体进行TA克隆，以SP6/T7通用引物进行测序。
(2)5' -RACE以农大辐14块根cDNA为模板，用IbGGPS EST正向引物3和正向引物4及反向引物5、反向引物6 (反向引物5、反向引物6序列参照Invitrogen5’ RACE System forRapid Amplification of cDNA Ends, Version2.0,购自北京拓英坊科技有限公司，产品编号18374-058)进行PCR反应。其中正向引物3在引物4的下游。引物序列如下:引物3:5' -TCGCCAGAATTTCAAGAACC-3’引物4:5' -CACCGGATTACCCACAAATC-3’引物5:5' -GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGGGGGGGG3’引物6:5' -GGCCACGCGTCGACTAGTAC3’PCR得到的5' RACE片段，回收后连接pGEM T-Easy载体进行TA克隆，以SP6/T7通用引物进行测序。(3) PCR扩增IbGGPS蛋白cDNA的编码区利用DNAMAN6.0软件拼接候选的甘薯IbGGPS蛋白cDNA序列。进一步设计正向弓丨物5和反向引物6进行PCR扩增IbGGPS蛋白cDNA的编码区。引物序列如下:引物5:5' -ATGAGGTCGATGAATCTT-3'(序列 3)引物6:5' -TTAATTCTGTCTATAAGC-3'(序列 4)
以农大辐14块根总RNA经Oligo (dT)反转录cDNA为模板，用高保真的KOD酶，进行PCR扩增，PCR条件为94°C 5min,随后60°C 30min和72°C 2min30s进行34个循环，最后72°C延伸5min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，获得1092bp长度的扩增片段。综合上述4个步骤的结果，获得了 1092bp目的cDNA序列，其核苷酸序列如序列表中序列I所示。序列表中序列I由1092个碱基组成，自5'端第I位-第1092位碱基为其开放阅读框，编码具有序列表中序列2所示的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中序列2由363个氨基酸残基组成。将该基因命名为IbGGPS，将其编码的蛋白命名为IbGGPS。实施例2、甘薯IbGGPS蛋白在提高植物组织中类胡萝卜素含量中的应用一、转IbGGPS烟草的获得1、植物表达载体的构建根据甘薯IbGGPS蛋白cDNA的编码序列，设计扩增出完整编码序列的引物序列，正反向引物分别引入BamH I和Sac I酶切位点，引物序列如下:引物7:5' -GGGATCC ATGAGGTCGATGAATCTT-3'(序列表中序列 5)(下划线部分为BamH I酶切位点)，引物8:5' -TCGAGCTC TTAATTCTGTCTATAAGC-3'(序列表中序列 6)(下划线部分为Sac I酶切位点)。以人工合成的序列表中序列2所示的DNA分子为模板(或以农大辐14块根cDNA为模板)，PCR扩增后，得到1107bp的PCR产物，将产物连接到pGEM-TEasy载体(购自北京泽平科技有限责任公司，产品目录号为A1360)上，命名为pGIbGGPS载体，进行T7/sp6的测序，保证甘薯IbGGPS蛋白cDNA的阅读框及酶切位点的正确。用Sac I和BamH I酶切载体pCB⑶S，回收12926bp载体大片段；同时，用Sac I和BamH I酶切载体pGIbGGPS，回收约1.1kb中间片段；将回收12926bp载体大片段与约1.1kb中间片段连接，得到重组载体pCBIbGGPS，即为植物表达载体。
将重组载体pCBIbGGPS转化大肠杆菌DH5a (购自北京全式金生物技术有限公司，产品目录号为⑶201-01 )，37°C培养20h，进行重组载体的PCR分析和酶切鉴定，并进行测序验证。测序结果表明，重组载体pCBIbGGPS为将序列表中序列I自5'端第I位-第1092位所示核苷酸插入载体PCBGUS的BamH I和Sac I酶切位点(替换掉gusA报告基因)间得到的载体。上述pCB⑶S载体是通过包括如下步骤的方法得到的:(I)将pCAMBIA1301载体(购自CAMBIA公司)经过Hind III和EcoR I双酶切，回收11786bp的载体大片段；(2)将pBI121载体(购自Clontech公司；含35S启动子，gusA报告基因，nos终止子片段)也经过Hind III和EcoR I双酶切，回收包含gusA基因的3032bp的片段；(3)将步骤(I)中回收的11786bp载体大片段与步骤(2)中回收的包含gusA基因的3032bp的片段经T4DNA酶连接，得到重组载体pCB⑶S。2、植物表达载体转化农杆菌(I)从-80° C低温冰箱中取出200 yL EHA105感受态细胞(购自北京拜尔迪生物技术有限公司)，置冰上融化，加入I μ g上述步骤I得到的植物表达载体pCBIbGGPS，混匀。(2)液氮冷冻 Imin, 37° C 温育 5min。(3)加入800 μ L LB液体培养基，28。C培养2_6h。(4)取100 μ L菌液至LB固体培养基上(含100 μ g/mL利福平(Rif) >25 μ g/mL卡那霉素(Kan))，涂布均匀，将培养皿封口。倒置培养皿28。C培养2d。
(5)取PCR鉴定呈阳性的单菌落(引物为引物7和引物8，得到1107bp的为阳性)，接种到含有100 μ g/mL Rif、25 μ g/mL Kan的LB液体培养基中，28° C培养30h至对数生长期，取适量农杆菌用液体MS培养基稀释30倍备用，即得到导入pCBIbGGPS载体的农杆菌菌液。3、转IbGGPS烟草的获得I)转化用农杆菌介导的方法将IbGGPS cDNA的编码序列导入到烟草品种cv.Wisconsin38 (以下也称为野生型烟草；Wang LJ, He SZ, Zhai H, Liu DG, WangYN, Liu QC(2012):Molecular cloning and functional characterization of a salttolerance-associated gene IbNFUlfrom sweetpotat0.Journal of IntegrativeAgriculture, 2012,12 (I):101-108 ;公众可从中国农业大学获得)中，具体方法如下:(I)取经过继代培养6周的野生型烟草无菌苗叶片，在超净台中，切下5 X 5mm的烟草叶盘(去掉主叶脉)，悬浮于上述步骤2制备好的EHA105/pCBIbGGPS农杆菌菌液中，IOmin后将菌液吸出，将侵染过的烟草叶盘接种培养在固体培养基(1.0mg/16-BA.0.lmg/1 NAA的MS)上。28°C、黑暗，共培养3d。(2)将共培养 3d 后的烟草叶盘用含有 500mg/l CarbU.0mg/16-BA,0.lmg/1 NAA的MS液体培养基洗涤2次后，将烟草叶盘转至含有1.0mg/16-BA.0.lmg/1 NAA、6mg/l PPT的固体MS培养基上进行选择培养，培养条件为27±1°C、每日13h、30001x的光照。培养4周后，将不定芽转移至含有1.0mg/16-BA.0.lmg/1 NAA、6mg/l PPT的1/2MS固体培养基上进行不定根诱导，培养条件为27土1°C、每日13h、30001x的光照。8周后，形成完整的再生植株，得到Ttl代转IbGGPS烟草。采用同样的方法将空载体pCBGUS转入野生型烟草中，得到转空载体烟草。2)分子鉴定用CTAB法提取Ttl代转IbGGPS烟草、转空载体烟草和野生型烟草的基因组DNA作为模板，用常规方法进行PCR检测，所使用的IbGGPS基因引物为:primerI:5 ' -AGGTGGCTCCTACAAATGC-3 '和 primer2:5 ' -TTAATTCTGTCTATAAGCTA-3 '。在 0.2mlEppendorf 离心管中加入 IOXPCR buffer2 μ l、4dNTP (10mol/L) I μ 1、引物(10 μ mol/1)均为 I μ 1、模板 DNA (50ng/ul) 2 μ 1、Taq DNA 聚合酶 0.25ul，加 H2O 至总体积 20 μ I。反应程序为94°C预变性5min，94°C变性30S，55°C复性30S，72°C延伸2min，共35个循环。电泳检测扩增结果见图1 (泳道M为Maker，泳道W野生型烟草植株；泳道P为阳性对照(重组质粒pCBIbGGPS);泳道C为转空载体烟草；泳道1-泳道5为Ttl代转IbGGPS烟草)，可以看出，泳道1-泳道5所示的Ttl代烟草均扩增出1386bp的目标片段，为Ttl代转IbGGPS烟草，表明IbGGPS基因已经整合到烟草的基因组中，并证明这些再生植株为阳性转基因植株；转空载体烟草和野生型烟草均没有目的片段。将经鉴定为阳性的编号为I和编号4的Ttl代转IbGGPS烟草扩繁进行类胡萝卜素含量的测定。二、转IbGGPS烟草类胡萝卜素含量的鉴定1、高效液相色谱法测定转基因烟草的类胡萝卜素含量(I)标样的准备①β-胡萝卜素( β-carotene)、玉米黄素(zeaxanthin)和叶黄素(lutein)标样购自sigma公司，商品号分别为C4582-10MG、14681-1、95507) ;β -隐黄质(β -cryptoxanthin)标样购自北京华美互利生化公司，商品号为0317S。②α -胡萝卜素(a -carotene)标样:由于a -carotene标样极易降解,没有进行商业化标样，必须自行提取，具体方法如下:I)将胡萝卜丁放入食物料理机中打碎。2)将打碎的胡萝卜浆状物导入盛有5g硅藻土的大研钵中，混匀。3)加入适量的预冷丙酮用力研磨，将胡萝卜中的胡萝卜素萃取到丙酮中。4)将研磨液倒入磨砂漏斗中进行抽真空，黄色液体会被抽到三角瓶中，磨砂漏斗中的干燥物质用勺取出，再放入到大研钵中，加适量预冷丙酮再次用力研磨。重复5-6次，直到研磨液的颜色变为无色。5)将三角瓶中的金黄色液体(胡萝卜素萃取液)分若干次倒入分液漏斗中，每倒入一次胡萝卜素萃取液后，均倒入300ml的dd H2O,静置稍许，将下层透明液层排出到废液瓶中。6)胡萝卜素萃取液经过若干次dd H2O洗涤后，最后一次用饱和食盐水洗涤，以彻底除去所形成的乳状物层，同样排出下层的透明废液。7)用吸水纸擦干分液漏斗的出水孔。将金黄色的石油醚层(高纯度胡萝卜素萃取液)排出倒入一个干燥的锥形瓶中；加入适量无水硫酸钠(Na2SO4)干燥(至无水NaSO4结晶呈分散状态)，摇晃，吸取萃取液中的残留水分。8)将处理后的金黄色液体倒入一干燥的球形瓶中，再加入100mll0%K0H的甲醇溶液皂化和0.1% 二丁基羟基甲苯。9)将球形瓶接入旋转蒸发仪，旋转蒸发仪的另一接口接真空泵，真空蒸干液相石油醚，将有机相浓缩至大约5ml，之后用胶头滴管吸取石油醚(<5ml)以洗净球形瓶壁上的橙色固态物质，胶头滴管反复吹打橙色液相，使固态物质充分溶解，以获得更高纯度的胡萝
卜素萃取液，工作时间约50分钟。10)柱填料硅藻土和氧化镁(1:1)于110°C活化4个小时，在干燥器里冷却、干燥。准备一个铁架台，将玻璃层析柱放置在铁架台上并固定。在玻璃层析柱下方接好一个带口三角瓶，三角瓶通过皮管连接真空泵。11)填柱:将高温激活的硅藻土氧化镁混合物小心倒入玻璃层析柱内，不时用柱塞棒小心压实，填柱约20cm左右，确保柱面水平；再在柱面上方加入细化无水硫酸钠层lcm，之后塞入一层1.5cm左右的脱脂棉层，保证硫酸钠层和脱脂棉层的相平。再次压实后，打开真空泵，抽真空I小时。12)石油醚过柱:抽真空I小时后，不要关闭真空泵，沿柱壁加入石油醚润柱，调整真空泵，使流速为每秒2-3滴，并用柱塞棒保持固态面的水平，最终使石油醚润洗整个层析柱。13)用滴管将浓缩后的提取物小心转入层析柱中，至样品层进入到接近无水Na2SO4层时，再把冲洗圆底烧瓶的石油醚相转入层析柱中，过柱过程中要保证石油醚相始终高于无水Na2SO4层。14)层析工作过程中，一定要保证固相上方的石油醚液相的存在，石油醚一旦不足必须立即补充(层析柱需要避光，可以使用锡箔纸包裹)。15) α-胡萝卜素是第一个流出层析柱的物质，所以当分层的α-胡萝卜素层即将流出层析柱时，暂时关闭真空泵，更换新的带口三角瓶，以盛接α-胡萝卜素，连接好后，打开真空泵，金黄色的α-胡萝卜素会流出进入到三角瓶内(三角瓶同样需要避光)。16)将获得的金黄色液体倒入玻璃螺口离心管中保存，详细注明标样提取时间，parafilm严格密封，锡箔纸避光，_80°C冰箱直立保存。17)取出少量用N2气吹干(剩余的大量提取物密封、避光保存于_70°C，备用)，用Iml V乙腈:V甲醇:V 二氯甲烷=45:20:35的溶剂溶解。18)用Iml—次性注射器使溶质完全溶解后，通过0.22 μ I的过滤器转移至2ml棕色进样小瓶中，50μ I进样检测提取样品的纯度。(2)混合标准样品的制备及标准曲线的绘制将提取并检测的α-胡萝卜素(a-carotene)直接用于混合标样的制备；叶黄素(Lutein)标样用无水乙醇和乙醚溶解；玉米黄素(Zeaxanthin)用丙酮溶解；β -隐黄质(β-cryptoxanthin)标样用乙醚和石油醚溶解；β _胡萝卜素(β-catotene)标样则用石油醚进行溶解。将标准样品溶解后各取100 μ I至小容量瓶(5ml)定容，用紫外-可见光分光光度计在各成分特定波长下测定其吸光值。根据公式(I)计算浓度，公式(2)校对公式(1)计算所得浓度，用公式(3)配置成50ml混合标样。混合标样需经氮气浓缩后，用石油醚定容。分别取lml、2ml、3ml和5ml混合标样并分别重复3次共45ml建立标准曲线，标样测定值满足表I所列各成分所在的浓度范围内即可进行标准曲线的绘制。混合标样中β_胡萝卜素(β-carotene)、玉米黄素(zeaxanthin)、叶黄素(lutein)、β-隐黄质(β-cryptoxanthin)和α-胡萝卜素(a-carotene)的标准曲线如图2所示，图2中A为β-胡萝卜素的标准曲线，其标准曲线方程为y=294.92x-35.199 ;图2中B为玉米黄素的标准曲线，其标准曲线方程为y=339.83x-126.76 ;图2中C为叶黄素的标准曲线，其标准曲线方程为y=479.56x-72.214 ;图2中D为β -隐黄质的标准曲线，其标准曲线方程为y=425.88x-40.863 ;图2中E为α -胡萝卜素的标准曲线，其标准曲线方程为y=350.51x-4.7455。
浓度 C (Pg/ml = (OI) X IO4)/ (A:: X 稀释倍数)(公式 I)式中OD为吸光值；Λ!::为吸光系数；校对浓度(μ g/ml)=浓度c X纯度(%) (公式2)纯度(%)=标样HPLC峰面积/HPLC峰总面积X 100 ；a=(50Xb)/c (公式 3)式中50为混合标样总体积50ml ；a为加入标样量(μ g/ml);b为浓度范围中值(μ g/ml) ；c为校对浓度(μ g/ml)。表1为标准溶液吸光系数和浓度范围
权利要求
1.一种蛋白，是如下(a)或(b): Ca)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物组织中类胡萝卜素含量相关的由序列2衍生的蛋白质。
2.编码权利要求1所述蛋白的DNA分子。
3.如权利要求2所述的DNA分子，其特征在于:所述DNA分子是如下(1)-(3)中任一种的DNA分子: (1)编码区为序列表中序列I所示的DNA分子； (2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且编码与植物组织中类胡萝卜素含量相关蛋白的DNA分子； (3)与(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码与植物组织中类胡萝卜素含量相关蛋白的DNA分子。
4.含有权利要求2或3所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
5.如权利要求4所述的重组载体，其特征在于: 所述重组载体为将编码权利要求1所述蛋白的DNA分子插入表达载体中，得到表达权利要求I所述蛋白的重组载体。
6.扩增权利要求2或3所述DNA分子全长或其任意片段的引物对。
7.权利要求1所述蛋白、权利要求2或3所述DNA分子或权利要求4所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在调控植物组织中类胡萝卜素含量中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于:所述类胡萝卜素为如下I)或2): 1)由胡萝卜素、玉米黄素、叶黄素、隐黄质和α-胡萝卜素组成的类胡萝卜素； 2)α -胡萝卜素、叶黄素或β -胡萝卜素； 所述组织为叶片，所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
9.一种培育转基因植物的方法，为将编码权利要求1所述蛋白的DNA分子导入目的植物，获得转基因植物，所述转基因植物组织中类胡萝卜素含量高于所述目的植物。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于:所述组织为叶片，所述类胡萝卜素为如下I)或2): 1)由胡萝卜素、玉米黄素、叶黄素、隐黄质和α-胡萝卜素组成的类胡萝卜素； 2)α -胡萝卜素、叶黄素或β -胡萝卜素； 所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
全文摘要
本发明公开了一种蛋白IbGGPS及编码基因与在调控植物类胡萝卜素含量中的应用。本发明所提供的蛋白IbGGPS，来源于甘薯(Ipomoea batatas)，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物组织中类胡萝卜素含量相关的由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，IbGGPS基因过表达可以提高烟草中α-胡萝卜素、β-胡萝卜素和总类胡萝卜素的含量。
文档编号C12N5/10GK103205405SQ20131012499
公开日2013年7月17日 申请日期2013年4月11日 优先权日2013年4月11日
发明者刘庆昌, 翟红, 何绍贞, 陈伟 申请人:中国农业大学