专利名称：抗血脂与抗动脉粥样硬化药物疗效检测的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和医学领域，更具体的，本发明涉及一种检测个体抗血脂 与抗动脉粥样硬化药物疗效的试剂盒，通过检测他汀类药物用药靶向位点CYP3A4基因、 CYP2D6基因和CYP2C9基因多态性位点来评估个体抗血脂与抗动脉粥样硬化药物疗效。
背景技术：
动脉粥样硬化(atherosclerosis)是一组称为动脉硬化的血管病中最常见、最重 要的一种。各种动脉硬化的共同特点是动脉管壁增厚变硬、失去弹性和管壁缩小。动脉粥 样硬化的特点是受累动脉的病变从内膜开始，先后有多种病变合并存在，包括局部有脂质 和复合糖类积聚、纤维组织增生和钙质沉着，并有动脉中层的逐渐退变，继发性病变尚有斑 块内出血、斑块破裂及局部血栓形成。现代细胞核分子生物学技术显示动脉粥样硬化病变 具有巨噬细胞游移、平滑肌细胞增生；大量胶原纤维、弹力纤维和蛋白多糖等结缔组织基质 形成；以及细胞内、外脂质积聚的特点。由于在动脉内膜积聚的脂质外观呈黄色粥样，故此 称为动脉粥样硬化。他汀类药物(statins)即HMGCoA还原酶抑制剂，是目前临床广泛应用的调血脂 类药，是以胆固醇升高为主的高脂血症患者的首选治疗药物。另外，临床研究发现他汀类 药还具有抗炎和抗氧化作用，能稳定动脉硬化斑块，是冠脉综合征的标准治疗药之一。但 是该类药有明显的肌肉毒性，严重的可引起横纹肌溶解症，造成致命的肾功能衰竭。目前临 床常用的他汀类药主要有辛伐他汀(simvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、阿托伐他汀 (atrovastatin)、普伐他汀(pravastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)以及新近上市西立伐 ftktT (pitavastatin)。他汀(statin)类药物，如阿托伐他汀、西立伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、辛伐他 汀、氟伐他汀通过CYP3A4，5代谢清除。因此，CYP3A4，5基因多态性导致的酶活性改变将在 一定程度上反应到他汀类药物的用药效果，CYP3A4，5基因的分型检测对于临床他汀类药物 的用药指导具有的重要现实意义。CYP3A4*18是目前已确定的CYP3A4 SNP中等位基因突变率最高的位点，为外显子 10上T878C突变，引起第293位亮氨酸(L)被脯氨酸(P)所取代。L293氨基酸残基被包裹 在CYP3A4蛋白质的里面。由于L293P非组成性突变，影响了 CYP3A4蛋白的构成，底物结合 能力和酶催化活性。Gotoh(1992)证明了哺乳动物CYP450存在6种底物识别位点。根据这 一结论，L293P就位于第4种底物识别位点，而这种位点在不同动物中是高度保守的，并与 底物特异性相关。有研究认为该等位基因可能会提高CYP3A4酶活性，比如CYP3A4*18增加 了对睾酮、氯螨硫磷的催化活性；因此有必要研究该位点对特定药物的影响。肝、肠、食道、胃、胆囊、胆管、胰腺、肺、气管、鼻黏膜、肾、肾上腺、甲状旁腺、前列 腺、乳腺、卵巢、脑、垂体前叶等组织均有CYP3A5表达，提示它在这些组织中具有重要的生 理功能。CYP3A5曾经一度被认为是缺乏功能意义的假基因，但是近年来逐渐成为新的研 究热点，已发现的等位基因有多种，包括CYP3A5*1A、CYP3A5*1B、CYP3A5*1C、CYP3A5*2、CYP3A5*3A、CYP3A5*3B、CYP3A5*3C、CYP3A5*4、CYP3A5*5、CYP3A5*6、CYP3A5*7。CYP3A5 的表 达在人群中呈多态分布，它的功能仅在10 20%的白人，33%的东方人和55%的美国黑人 中存在，这主要是因为CYP3A5*3突变导致了不适当的mRNA剪接，使终止密码子提前，导致 CYP3A5缺乏。CYP3A5*3等位基因的发生频率的变化范围由50% (美国黑人)到90% (白 人)。CYP3A5*3/*3纯合子的肝微粒体表达CYP3A5的水平很低，表现为咪达唑伦的代谢活 性降低。CYP3A5*3/*3纯合子个体CYP3A5活性低于CYP3A5*3/*1杂合子，而CYP3A5*1/*1 纯合子活性最高，表现出明显的基因剂量效应。CYP3A5*5、CYP3A5*6、CYP3A5*7也可形成可 变剪切，从而导致编码的提前结束或外显子的丢失。CYP2D6基因呈现高度多态性，目前已知有63种主要的等位基因，导致酶活性增 加、降低或缺失。CYP2D6等位基因活性的改变是由于基因突变造成表达产物酶分子的改变， 从而产生代谢缺陷。基因突变的主要方式是碱基缺失或替换引起读码框架移位，或者大片 段基因的丢失。CYP2D6酶又称为异喹胍羟化酶，主要是因为异喹胍(debr-soquine)代谢仅依 赖于CYP2D6，可作为测定CYP2D6酶活性的探药。以代谢率(metabolicratio，MR =尿中 原型药物的量，代谢物的量)为指标，按代谢能力不同可分为4种表型慢代谢型(poor metabolizers, PM)、中代谢型(intermediate metabolizers, IM)、泛代谢型(extensive metabolizers, EM)和超快代谢型(ultra-rapid metabolizers, UM)。UM 具有多个功能正 常的等位基因(3-13)，使酶蛋白高表达，导致酶活性的显著增高。该表型携带者药物代谢率 高于其他表型。EM是正常人群的代谢表型。EM表型携带者的基因型组成有2种情况，一种 由2个活性正常的等位基因组成，第二种是1个活性正常的等位基因和1个具部分活性的 等位基因组成。因此，同为EM者其CYP2D6的活性也是不相同的。一般来讲，正常基因纯合 子者的酶活性要大于正常基因和突变基因杂合子者的酶活性。该表型携带者用药时可遵循 标准的药物剂量，对携带一个部分活性等位基因的EM表型携带者需更为仔细。IM介于EM 与PM之间。其基因型一种由2个部分活性等位基因组成，另外一种是1个功能正常和1个 无活性的等位基因组成。PM基因型一种是由2个无功能的等位基因组成，另外一种是1个 无活性和1个部分活性的等位基因组成。PM表型携带者由于药物代谢率降低增加了药物毒 副作用。迄今已在CYP2C9基因的编码区和非编码区发现多个等位基因多态性或突变，其 中编码区的11种单核苷酸多态性(SNP)，依次被编为*2 *12号，*1定义为无突变的野生 型。研究较多主要是CYP2C9*2 *6五种多态性，而针对另外的CYP2C9*7 *12开展的工 作很少。除此之外，在基因的非编码区也发现多个SNP，如内含子2上的两个SNP和5’端调 控区域的7个SNP等。它们能通过改变CYP2C9基因转录水平而影响酶活性。上述突变的 发生频率具种族差异。CYP2C9底物的体内代谢与其基因型相关。在日本人和英国人中发现CYP2C9*3的 杂合子病人所需华法令的平均剂量为*1野生型的60%，而*3的合子病人的剂量仅为*1野 生型的10%，即正常人的剂量为4 8mg/d，而CYP2C9*3纯合子仅需0. 4mg/d。CYP2C9*2同 样存在类似现象，杂合子和突变纯合子分别降低15 20%和40%。而且，携带CYP2C9*2和 *3的病人应用华法令时发生出血并发症等不良反应和INR比值增高(> 4. 0)的概率显著 高于正常人。在土耳其人和日本人中发现*2和*3杂合子个体服用苯妥因后12小时血药浓度比正常人高30%，而有*3纯合子个体的苯妥因体内口服清除率降低79%。CYP2C9*3 纯合子个体对甲苯磺丁脲和格列吡嗪的体内口服清除率较正常人低80%，或者其半衰期延 长3 4倍。最近的研究表明，氟伐他汀在不同基因型的个体中有明显的药代学差异，而在 药效学上无显著差别。在白种人中研究发现，洛沙坦的药代学和药效学均无基因型的显著 差异，而在日本人中的研究却表明有显著的基因剂量效应。由此可见，CYP2C9基因型对不 同药物的影响有不同，而且存在种族差异性。
发明内容
基于他汀类药物用药靶向位点CYP3A4基因、CYP2D6基因和CYP2C9基因多态性可 用来评估个体抗血脂与抗动脉粥样硬化药物疗效的基础上，本发明提供一种检测个体抗血 脂与抗动脉粥样硬化药物疗效的试剂盒。该试剂盒包括检测他汀类药物用药靶向位点CYP3A4基因、CYP2D6基因和CYP2C9基因多态性位 点的特异性引物对及特异性荧光探针对；荧光定量PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、反应缓冲液、去离 子水等)。本试剂盒中所述的特异性荧光探针对是能够轻易完成设计的，特异性荧光探针对 可用常规的探针合成技术进行合成。本发明试剂盒的组分和含量包括IOX荧光定量PCR反应缓冲液3 μ 1，25mM dNTP 混合液 0. 3 μ 1，25mM MgC12 溶液 1. 8μ 1，5units/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0· 075 μ 1,20 μ M特异性引物对每条引物各0. 225 μ 1，10 μ M特异性荧光探针对每条探针各0. 25 μ 1，去离子水 15. 975 μ I0本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验 方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。实施例检测试剂盒的使用步骤1:DNA模板的抽取用硅胶吸附法抽提口腔上皮细胞的基因组DNA。步骤2 荧光定量PCR反应使用检测试剂盒中的荧光定量PCR套装，进行3次独立的荧光定量PCR反应，每次 反应的体系为总体积10 μ 1，包含浓度为20ng/μ 1的DNA模板2 μ 1、1 μ 1 IOX荧光定量PCR 反应缓冲液、0. 1 μ 1 25mM dNTP 混合液、0. 6 μ 1 25mM MgCl2 溶液、0. 025 μ 1 (5units/ μ 1) Taq DNA聚合酶、20 μ M的有义引物和反义引物各0. 225 μ 1、10 μ M的带VIC荧光探针和带FAM荧光探针各0. 25 μ 1，去离子水5. 325 μ 1。在PCR扩增仪上进行反应，反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，进行60个循环 的95°C、30秒，60°C、1分钟。反应结束后在荧光定量PCR仪上读取样品荧光量。步骤4 基因型分析根据试剂盒使用说明书标示的基因分型图示对SNP位点进行基因型分析。熟悉荧光定量PCR技术的本领域技术人员能够通过辨识荧光定量PCR仪上显示 的最终样品荧光量，根据不同序列探针荧光信号的强弱即可确定所检测的SNP位点的基因 型。
权利要求
一种检测个体抗血脂与抗动脉粥样硬化药物疗效的试剂盒，其特征在于包括检测他汀类药物用药靶向位点CYP3A4基因、CYP2D6基因和CYP2C9基因多态性位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、荧光定量PCR反应缓冲液、去离子水。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括 IOX荧光定量PCR反应缓冲液3 μ 1，·25mM dNTP 混合液 0. 3 μ 1，·25mM MgCl2 溶液 1. 8 μ 1，·5units/ μ 1 Taq DNA 聚合酶 0. 075 μ 1,·20 μ M特异性引物对每条引物各0. 225 μ 1，·10 μ M特异性荧光探针对每条探针各0. 25 μ 1，去离子水15. 975 μ 1。本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为-20°C。
全文摘要
本发明公开了一种检测个体抗血脂与抗动脉粥样硬化药物疗效的试剂盒。该试剂盒包括检测他汀类药物用药靶向位点CYP3A4基因、CYP2D6基因和CYP2C9基因多态性位点的特异性引物对及特异性荧光探针对、荧光定量PCR常规组件等。本发明的试剂盒通过他汀类药物用药靶向位点CYP3A4基因、CYP2D6基因和CYP2C9基因多态性位点来评估个体抗血脂与抗动脉粥样硬化药物疗效。
文档编号C12Q1/68GK101928756SQ20091005395
公开日2010年12月29日 申请日期2009年6月26日 优先权日2009年6月26日
发明者冯哲民, 邹祖烨 申请人:上海主健生物工程有限公司