一种检测cyp3a4基因多态性的试剂盒及方法
【专利摘要】本发明涉及一种检测CYP3A4基因多态性的试剂盒及方法，属于基因测序【技术领域】。所述试剂盒包括检测用引物，即包括：CYP3A4基因第1～3外显子的长片段扩增特异性上下游引物、CYP3A4基因第4～7外显子的长片段扩增特异性上下游引物、CYP3A4基因第8～11外显子的长片段扩增特异性上下游引物和CYP3A4基因第12～13外显子的长片段扩增特异性上下游引物中的至少一对，以及与所述第1～3外显子的长片段DNA、第4～7外显子的长片段DNA、第8～11外显子的长片段DNA以及第12～13外显子的长片段DNA相对应的CYP3A4基因的各外显子的上下游测序引物中的至少一对。本发明检测时间短、工作量少。
【专利说明】—种检测CYP3A4基因多态性的试剂盒及方法
【技术领域】[0001]本发明涉及基因测序【技术领域】，具体涉及一种检测CYP3A4基因多态性的试剂盒及方法。
【背景技术】
[0002]细胞色素P450酶(Cytochrome P450, CYP),又称混合功能氧化酶(Mixed functionoxcidase)、单加氧酶(Monooxygenase)或药物代谢酶,其广泛分布于动物、植物和微生物体内。在哺乳动物的组织中已经发现有20多种同工酶，分为CYPl~4的4个家族。CYP3A型酶在体内占CYP450总量的70%，占肝内CYP450的30 %，参与60 %以上常用药物在体内的代谢转化。目前，在人体内己发现4种CYP3A~基因，即CYP3A4、CYF3A5，CYP3A7和CYP3A43，而其中CYP3A4是临床上最重要的P450酶之一，参与代谢38个类别的150多种药物的氧化代谢，约占全部药物的50%，是许多药物因相互作用发生不良反应的根源。CYP3A4是肝脏和胃肠道中主要的P450代谢酶，其活性表现为单态分布，在许多药物和环境污染物的代谢中发挥着重要作用。研究表明，CYP3A4不仅在表达水平上具有显著的个体差异，其底物的体内代谢也可相差10倍以上。编码CYP3A4蛋白的基因位于染色体7q21.3—22.1，编码区域包含13个外显子和12个内含子，主要调控其转录及表达的结构区位于5端，长约27kb, CYP3A4基因多态性具体详见CYP等位基因数据库(http://www.cypalleles.k1.se)。到目前为止CYP3A4已有24个等位基因已经确定，不同种族间CYP3A4SNPs的发生频率不同，如CYP3A4*3和*17仅在白种人中发现，CYP3A4*15只在黑种人中发现，而CYP3A4*16仅存在于日本人和墨西哥人中，在已发现的39个SNPs中，CYP3A4*4，*5，*6，*18，*19在中国人中已确定，它们的发生频率分别为1.5 %，0.98 %，0.5 %，2 %和2 %。许多常用药物是CYP3A4的强诱导剂或抑制剂，当CYP3A4作为诱导剂时，其与代谢底物合并用药，能大大提高后者的代谢速率，从而可能使后者无法达到发挥药效时的血药浓度，降低后者的利用度或者无法达到治疗效果。相反，当CYP3A4作为抑制剂时，它们与经CYP3A4代谢的药物合并用药时，会减少后者的代谢速率，导致后者的血药浓度升高，可能引起不良反应。因此，通过检测CYP3A4基因多态性，判断CYP3A4酶的活性，为临床用药个体化提供指导依据。
[0003]现有技术中采用直接测序法检测CYP3A4基因多态性，即首先采用PCR扩增不同的目的片段后，回收纯化PCR产物，然后进行测序。
[0004]由于直接测序法的检测时间过长，一般需要48个小时以上，使该检测的效率降低，因此，为检测CYP3A4基因多态性带来不便。
【发明内容】
[0005]针对现有技术中检测CYP3A4基因多态性的时间长、步骤繁琐、需要多次PCR的问题，本发明的目的在于提供一种检测CYP3A4基因多态性的试剂盒。
[0006]本发明的另一目的在于提供一种检测CYP3A4基因多态性的方法。
[0007]为了解决现有技术检测CYP3A4基因多态性时间长、步骤繁琐、需要多次PCR的问题，本发明采用了以下技术方案:
[0008]一种检测CYP3A4基因多态性的试剂盒，包括检测用引物，所述检测用引物包括:CYP3A4基因第I~3外显子的长片段扩增特异性上下游引物、CYP3A4基因第4~7外显子的长片段扩增特异性上下游引物、CYP3A4基因第8~11外显子的长片段扩增特异性上下游引物和CYP3A4基因第12~13外显子的长片段扩增特异性上下游引物中的至少一对，以及与所述第I~3外显子的长片段DNA、第4~7外显子的长片段DNA、第8~11外显子的长片段DNA以及第12~13外显子的长片段DNA相对应的CYP3A4基因的各外显子的上下游测序引物中的至少一对，其中:
[0009]所述CYP3A4基因第I~3外显子长片段扩增特异性上游引物序列如序列表中SEQID NO:1 所示；
[0010]所述CYP3A4基因第I~3外显子长片段扩增特异性下游引物序列如序列表中SEQID NO:2 所示；
[0011 ] 所述CYP3A4基因第4~7外显子长片段扩增特异性上游引物序列如序列表中SEQID NO:3 所示；
[0012]所述CYP3A4基因第4~7外显子长片段扩增特异性下游引物序列如序列表中SEQID NO:4 所示；
[0013]所述CYP3A4基因第8~11外显子长片段扩增特异性上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:5 所示；
[0014]所述CYP3A4基因第8~11外显子长片段扩 增特异性下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:6 所示；
[0015]所述CYP3A4基因第12~13外显子长片段扩增特异性上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:7 所示；
[0016]所述CYP3A4基因第12~13外显子长片段扩增特异性下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:8 所示；
[0017]所述CYP3A4基因第I外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO:9所示；
[0018]所述CYP3A4基因第I外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 10所示；
[0019]所述CYP3A4基因第2外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示；
[0020]所述CYP3A4基因第2外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 12所示；
[0021]所述CYP3A4基因第3外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 13所示；
[0022]所述CYP3A4基因第3外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 14所示；
[0023]所述CYP3A4基因第4外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 15所示；
[0024]所述CYP3A4基因第4外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 16所示；
[0025]所述CYP3A4基因第5~6外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 17所示；
[0026]所述CYP3A4基因第5~6外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 18所示；
[0027]所述CYP3A4基因第7外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 19所示；
[0028]所述CYP3A4基因第7外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 20所示；
[0029]所述CYP3A4基因第8外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 21所示；[0030]所述CYP3A4基因第8外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 22所示；
[0031]所述CYP3A4基因第9外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 23所示；
[0032]所述CYP3A4基因第9外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 24所示；
[0033]所述CYP3A4基因第10外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 25所示；
[0034]所述CYP3A4基因第10外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 26所示；
[0035]所述CYP3A4基因第11外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 27所示；
[0036]所述CYP3A4基因第11外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 28所示；
[0037]所述CYP3A4基因第12外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 29所示；
[0038]所述CYP3A4基因第12外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 30所示；
[0039]所述CYP3A4基因第13外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 31所示；
[0040]所述CYP3A4基因第13外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 32所示。
[0041]在上述试剂盒中，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括内参基因ACTB以及内参基因ACTB扩增引物，其中，
[0042]所述内参基因ACTB扩增引物的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:33所示；
[0043]所述内参基因ACTB扩增引物的下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 34所示；
[0044]所述内参基因ACTB的序列如序列表中SEQ ID N0:35所示。
[0045]在上述试剂盒中，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括测序缓冲液。更有选地，所述测序缓冲液为Buffer缓冲液,所述Buffer缓冲液的pH为8.3。
[0046]在上述试剂盒中，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照，其中，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为CYP3A4*8型的CYP3A4基因多态性中的含389G>A突变位点的基因序列DNA样品。
[0047]在上述试剂盒中，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括各种PCR反应试剂或者各种PCR反应试剂的混合物；更优选地，所述各种PCR反应试剂包括:PCR预混合液、Mg2+、dNTPs dUTP、Taq酶、BSA、T4噬菌体的基因32编码蛋白以及无RNase去离子水。
[0048]在上述试剂盒中，作为一种优选实施方式，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列以及内部阳性控制序列的扩增引物，其中:所述内部阳性控制序列如序列表中SEQ IDN0:36所示；所述内部阳性控制序列的扩增引物的上游引物如序列表中SEQ ID N0:37所示；所述内部阳性控制序列的扩增引物的下游引物如序列表中SEQ ID N0:38所示。
[0049]在上述试剂盒中，各种优选实施方式可以任意组合。
[0050]一种检测CYP3A4基因多态性的方法，包括如下步骤:
[0051]步骤一，提取受检者基因组DNA ;
[0052]步骤二，以步骤一得到的基因组DNA为模板，采用如序列表中SEQ ID NO:1和SEQID N0:2所示的CYP3A4基因第I~3外显子的长片段扩增特异性上下游引物、如序列表中SEQ ID NO: 3和SEQ ID NO: 4所示的CYP3A4基因第4~7外显子的长片段扩增特异性上下游引物、如序列表中SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示的CYP3A4基因第8~11外显子的长片段扩增特异性上下游引物或者如序列表中SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8所示的CYP3A4基因第12~13外显子的长片段扩增特异性上下游引物，PCR扩增CYP3A4基因第I~3外显子的长片段DNA、CYP3A4基因第4~7外显子的长片段DNA、CYP3A4基因第8~11外显子的长片段DNA或CYP3A4基因第12~13外显子的长片段DNA ；[0053]步骤三，对步骤二的PCR扩增产物进行凝胶电泳，并回收纯化得到的CYP3A4基因第I~3外显子的长片段DNA、CYP3A4基因第4~7外显子的长片段DNA、CYP3A4基因第8~11外显子的长片段DNA或CYP3A4基因第12~13外显子的长片段DNA ；
[0054]步骤四，以步骤三回收纯化后得到的产物为模板，采用如序列表中SEQ IDN0:9和SEQ ID NO: 10所示的上下游引物、SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12所示的上下游引物、SEQID NO: 13和SEQ ID NO: 14所示的上下游引物、SEQ IDN0:15和SEQ ID NO: 16所示的上下游引物、SEQ ID NO: 17 和 SEQ ID NO: 18 所示的上下游引物、SEQ ID NO: 19 和 SEQ ID NO: 20所示的上下游引物、SEQ IDN0:21和SEQ ID NO:22所示的上下游引物、SEQ ID NO:23SEQ ID N0:24所示的上下游引物、SEQ ID N0:25和SEQ ID NO:26所示的上下游引物、SEQIDN0:27和SEQ ID NO:28所示的上下游引物、SEQ ID N0:29和SEQ ID N0:30所示的上下游引物以及SEQ ID N0:31和SEQ ID NO:32所示的上下游引物中的至少一对相应的上下游测序引物进行测序反应；
[0055]步骤五，将步骤四得到的测序反应产物纯化后上测序仪进行测序，将测得序列在NCBI核酸数据库中进行比对分析以获得CYP2D6基因多态性。
[0056]在上述方法中，作为一种优选实施方式，在所述步骤二中，所述PCR的反应条件如下:先经过95°C 3min;然后进入PCR循环，所述PCR循环为95 °C 30s, 57 °C 3.6min、72°C 3min，共35个循环；最后72°C IOmin0更优选地，所述PCR的反应液中部分组分及浓度如下:1 X 的 PCR 预混合液、Mg2+:2.5-4.0mM, dNTPs:0.2-0.4mM、dUTP:0.3-0.6mM、Taq 酶:0.2υ/μ L、BSA:1.25wt%、T4 噬菌体的基因 32 编码蛋白:lnmol/L。
[0057]在上述方法中，作为一种优选实施方式，在所述步骤四中，所述测序反应的条件如下:先98°C变性2min，然后进行PCR循环，PCR循环参数为96°C 10s，50°C 5s, 60°C 4min，共25个循环。
[0058]在上述方法中，作为一种优选实施方式，在所述步骤二中，所述PCR反应中还加入了如序列表中SEQ ID N0:36所示的内部阳性控制序列、如序列表中SEQ ID N0:37所示的内部阳性控制序列的扩增引物的上游引物以及如序列表中SEQ ID N0:38所示的内部阳性控制序列的扩增引物的下游引物。
[0059]本发明试剂盒及检测方法的优点和效果如下:
[0060](I)敏感性高:可以同时检测出目前报道的24种CYP3A4基因多态性，具体详见CYP 等位基因数据库(http://www.cypalleles.k1.se)。
[0061](2)特异性强:使用特异性引物扩增CYP3A4基因长片段序列，然后进行测序，对特定的分子进行识别，准确性高，特异性好、假阳性低，可达到直接测序法的准确度，甚至比直接测序法更准确。
[0062](3)简便安全:操作简单、安全，只需一次PCR扩增后可以同时进行多个外显子测序检测多态性，极大地减少了检测环节，降低了污染的可能性。
[0063](4)全程监控:本发明实施例提供的试剂盒引入了内部阳性控制质量控制体系，对检测过程进行全程质量监控，有效避免假阳性或者假阴性。
[0064](5)快速:速度快、高通量，只需一次性扩增CYP3A4基因长片段序列，而无需对CYP3A4基因每个外显子进行扩增，极大地降低了劳动强度，节省了检测时间，可在8小时内完成。[0065]本发明的试剂盒及方法，利用长片段PCR测序法快速、准确的检测目前报道的24种CYP3A4基因多态性，有效杜绝了假阳性和假阴性的发生，用于经CYP3A4代谢的药物的使用剂量的预测并且为药物的选择提供了重要的手段。
【专利附图】
【附图说明】
[0066]为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0067]图1是本发明实施例2提供的采用实施例1的试剂盒的长片段扩增引物对扩增受检者外周血DNA PCR产物凝胶电泳结果，其片段大小预计的核酸片段大小一致，扩增结果对应为:第一条带为Marker，第二条带为CYP3A4第I~3外显子引物扩增长片段，第三条带为CYP3A4第4~7外显子引物扩增长片段，第四条带为CYP3A4第8~11外显子引物扩增长片段，第六条带为CYP3A4第12~13外显子引物扩增长片段，第七条带为阳性对照，第八条带为阴性对照；
[0068]图2是本发明实施例2提供的采用实施例1试剂盒的CYP3A4基因第7外显子上游测序引物进行测序后所得的结果，在第7外显子核酸序列566碱基处发生了 566T>C，提示为CYP3A4基因多态性*17 ；
[0069]图3是本发明实施例2提供的采用实施例1试剂盒的CYP3A4基因第11外显子上游测序引物进行测序后所得的结果，在第11外显子核酸序列1088碱基处发生了 1088CXT，提示为CYP3A4基因多态性*11。
【具体实施方式】
[0070]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常为本领域常规方法，如按照常规实验条件如SambiOOk等人，分子克隆，实验手册(第三版)(科学出版社，2002)中所述的条件，或按照试剂制造厂家所建议的条件。
[0071]实施例1.试剂盒的制备
[0072]1、内参基因ACTB以及CYP3A4基因的引物设计
[0073]根据基因序列ACTB基因序列和CYP3A4基因序列来源于美国国家生物技术信息中心核酸数据库(NCBI)，其中ACTB基因ID为60，参考序列号为NG_007992.1，也可参见本发明序列表中SEQ ID N0:35 ;CYP3A4基因ID为1574，参考序列号为NG_008421.1，采用Primer5.0引物设计软件分别设计内参基因ACTB和CYP3A4基因的特异引物，包括:CYP3A4基因第I~3外显子的长片段扩增特异性上下游引物、CYP3A4基因第4~7外显子的长片段扩增特异性上下游引物、CYP3A4基因第8~11外显子的长片段扩增特异性上下游引物、CYP3A4基因第12~13外显子的长片段扩增特异性上下游引物，以及CYP3A4基因第I外显子上下游测序引物、CYP3A4基因第2外显子上下游测序引物、CYP3A4基因第3外显子上下游测序引物、CYP3A4基因第4外显子上下游测序引物、CYP3A4基因第5~6外显子上下游测序引物、CYP3A4基因第7外显子上下游测序引物、CYP3A4基因第8外显子上下游测序引物、CYP3A4基因第9外显子上下游测序引物、CYP3A4基因第10外显子上下游测序引物、CYP3A4基因第11外显子上下游测序引物、CYP3A4基因第12外显子上下游测序引物和CYP3A4基因第13外显子上下游测序引物，其中，如CYP3A4基因第I~3外显子的长片段扩增特异性上下游引物分别用于鉴别CYP3A4基因的CYP3A4*14型，CYP3A4基因第7外显子上下游引物用于鉴别CYP3A4*17基因多态性，CYP3A4基因第11外显子上下游引物用于鉴别CYP2D6*11等均为——对应关系，可以同时检测出目前报道的24种CYP3A4基因多态性，其中，24种CYP3A4基因多态性具体详见CYP等位基因数据库(http://www.cypalleles.k1.se)。
[0074]通过上述引物设计得到:
[0075]CYP3A4基因第I~3外显子长片段扩增特异性上游引物序列:5’ -TGGACTTGGGGTGCTAATCA-3’，如序列表中 SEQ ID NO:1 所示；
[0076]CYP3A4基因第I~3外显子长片段扩增特异性下游引物序列:5’ -TGTGTGTGTGTAAAAACCCTGAC-3’，如序列表中 SEQ ID NO: 2 所示；
[0077]CYP3A4基因第4~7外显子长片段扩增特异性上游引物序列:5’-GGCTGTTGATGTTTAATCAACTCTG-3’，如序列表中 SEQ ID NO: 3 所示；
[0078]CYP3A4基因第4~7外显子长片段扩增特异性下游引物序列:5’-CAAATGTACTACAAATCACTGAACTG-3’，如序列表中 SEQ ID NO: 4 所示；
[0079]CYP3A4基因第8~11外显子长片段扩增特异性上游引物序列5’-AGCAAATAATTATACAACCACATGAC-3’，如序列表中 SEQ ID NO: 5 所示；
[0080]CYP3A4基因第8~11外显子长片段扩增特异性下游引物序列:5’ -GCTCCAGGTAAATTT TGCACA-3’，如序列表中 SEQ ID NO: 6 所示；
[0081]CYP3A4基因第12~13外显子长片段扩增特异性上游引物序列:5’ -GTAAGAAACCCTAACATGTAACT-3’，如序列表中 SEQ ID NO: 7 所示；
[0082]CYP3A4基因第12~13外显子长片段扩增特异性下游引物序列:5，-AGGCCAGGATGTCTCTCCA-3’，如序列表中 SEQ ID NO: 8 所示；
[0083]CYP3A4基因第I外显子上游测序引物序列:5’ -GCCCTGCTACTGGCTGCA-3’，如序列表中SEQ ID NO:9所示；
[0084]CYP3A4基因第I外显子下游测序引物序列:5’ -CGGCCTGAACATCTTTTTTG-3’，如序列表中SEQ ID NO: 10所示；
[0085]CYP3A4基因第2外显子上游测序引物序列:5’-TCGCTGTGACTTGATTTCTGT-3’，如序列表中SEQ ID NO: 11所示；
[0086]CYP3A4基因第2外显子下游测序引物序列:5’-AAAACTTCAGACCTTCCCCCT-3’，如序列表中SEQ ID NO: 12所示；
[0087]CYP3A4基因第3外显子上游测序引物序列:5’ -TGACAAGAGCTTCATCCCAA-3’，如序列表中SEQ ID NO: 13所示；
[0088]CYP3A4基因第3外显子下游测序引物序列:5’-TCCCAATTAGAGGCAGGGTTA-3’，如序列表中SEQ ID NO: 14所示；
[0089]CYP3A4基因第4外显子上游测序引物序列:5’-TTGGGCTCCAGCTGTAGAATA-3’，如序列表中SEQ ID NO: 15所示；[0090]CYP3A4基因第4外显子下游测序引物序列:5’-CCTGGACATTTTTTAGGCAAC-3’，如序列表中SEQ ID NO: 16所示；
[0091]CYP3A4基因第5~6外显子上游测序引物序列:5’-AAGTGTTCCTGTTTAACACATTTTC-3’，如序列表中SEQ ID NO: 17所示;
[0092]CYP3A4基因第5~6外显子下游测序引物序列:5’ -TCACTGGAATAACCCAACAGCA-3’，如序列表中SEQ ID NO: 18所示；
[0093]CYP3A4基因第7外显子上游测序引物序列:5’-GTGGATGAATTACATGGTGATTT-3’，如序列表中SEQ ID NO: 19所示；
[0094]CYP3A4基因第7外显子下游测序引物序列:5’ -GGAAGGATGGTAAAAAGGTGCT-3’，如序列表中SEQ ID NO:20所示；
[0095]CYP3A4基因第8外显子上游测序引物序列:5’-GCTCCAGGTAAATTTTGCACA-3’，如序列表中SEQ ID NO:21所示；
[0096]CYP3A4 基因第 8 外显子下游测序引物序列:5’ -AAAACATACAGGTAACTGCACTGA-3’，如序列表中SEQ ID NO:22所示；
[0097]CYP3A4基因第9外显子上游测序引物序列:5’ -TCAGGAGCCACTTTCTGTCA-3’，如序列表中SEQ ID NO:23所示；
[0098]CYP3A4基因第9外显子下游测序引物序列:5’-TATGCCTGCATGCCTCTAGAA-3’，如序列表中SEQ ID NO:24所示； [0099]CYP3A4 基因第 10 外显子上游测序引物序列:5’-CTCTTCATCTAAACTGTGATGCCC-3’，如序列表中SEQ ID NO:25所示；
[0100]CYP3A4 基因第 10 外显子下游测序引物序列:5’-AGAGTCAGTGAAAGAATCAGTGATT-3’，如序列表中SEQ ID N0:26所示；
[0101]CYP3A4 基因第 11 外显子上游测序引物序列:5’-CTTCATTAGTACTGCATGGACTGAG-3’，如序列表中SEQ ID NO:27所示；
[0102]CYP3A4 基因第 11 外显子下游测序引物序列:5’ -AGCAAATAATTATACAACCACATGACTG-3’，如序列表中SEQ ID NO: 28所示；
[0103]CYP3A4基因第12外显子上游测序引物序列:5’-TCTCAACAAGACTGAAAGCTCC-3’，如序列表中SEQ ID NO:29所示；
[0104]CYP3A4 基因第 12 外显子下游测序引物序列:5’-GGGCTTTACATGATGTTTTTGATG-3’，如序列表中SEQ ID NO:30所示；
[0105]CYP3A4基因第13外显子上游测序引物序列:5’ -TCCCCTCAACACTGAAGGAGT-3’，如序列表中SEQ ID NO:31所示；
[0106]CYP3A4基因第13外显子下游测序引物序列:5’ -CAATGCATGTACAGAATCCCC-3’，如序列表中SEQ ID NO:32所示；
[0107]内参基因ACTB扩增上游测序引物序列:5’ -CGATTTCTCGCAGCTCACCAT-3’，如序列表中SEQ ID NO:33所示；
[0108]内参基因ACTB扩增下游测序引物序列:5’ -AATACACACTCCAAGGCCGC-3’，如序列表中 SEQ ID NO:34 所示。
[0109]2、内部阳性控制序列及其引物的设计[0110]该内部阳性控制序列包含CYP3A4基因部分序列和一部分人工合成序列，如序列表中SEQ ID NO:36所示。
[0111]采用Primer5.0引物设计软件并按照上述引物设计原则设计出上述内部阳性控制序列的上下游引物分别为:5’-GCGCGTGACACTGCTACATG-3’(如序列表中SEQ ID NO:37所示)、5’ -TCGAGTAGCTGAGACTGCGT-3’(如序列表中 SEQ ID N0:38 所示)。
[0112]3、试剂盒的组成及制备
[0113]本发明试剂盒组成如下:
[0114]①基因组DNA提取试剂:该提取试剂为本领域常用试剂，本实施例采用组织基因组DNA提取试剂盒(Qiagen公司，货号:69504)中的试剂。
[0115]②引物:包括上述可以分别扩增CYP3A4基因第1~3外显子、4~7外显子、8~11外显子和12~13外显子的长片段扩增上下游引物、上述CYP3A4基因第1、2、3、4、5~
6、7、8、9、10、11、12以及13外显子测序上下游引物、上述内部阳性控制序列扩增上下游引物和内参基因ACTB扩增上下游引物。
[0116]③上述内参基因ACTB以及内部阳性控制序列。
[0117]上述引物序列、内部阳性控制序列和内参基因ACTB序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0118]④阴性对照和阳性对照:以去离子水为阴性对照，以含有CYP3A4*8型的CYP3A4基因多态性中的含389G>A突变位点的基因序列DNA样品为阳性对照；
[0119]阳性对照的制备:采用组织基因组DNA提取试剂盒(Qiagen公司，货号:69504)快速提取已经确诊的含有CYP3A4*8型的CYP3A4基因多态性中的含389G>A突变位点的基因序列的0.5ml受检者外周血基因组DNA，作为阳性对照。
[0120]⑤各种PCR反应试剂:PCR预混合液，本实施例中选用2 XPCR Premix (Qiagen公司，产品货号:210212) ;Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、BSA (Albumin from bovine serum,牛血清白蛋白)、T4噬菌体的基因32编码蛋白、无RNase去离子水。
[0121]⑥测序缓冲液,pH为8.3的Buffer缓冲液,其Buffer缓冲液的配制:1 μ IBigdye和 3 μ 15x 含 IOmM MgCl2 的 400mM Tris 溶液。
[0122]实施例2.用实施例1制备的试剂盒检测CYP3A4基因多态性
[0123]以随机检测30例受检者外周血标本结果为例。
[0124]用本发明的试剂盒检测人群CYP3A4基因多态性的检测流程为:首先获取临床受检者外周血样本，快速提取基因组DNA ;其次，先配制内参基因ACTB的PCR反应液，然后加入浓度均为2ng/l.! I内参基因ACTB序列和内部阳性控制序列各2 μ 1，进行PCR扩增，PCR结束后在浓度为2%的琼脂糖DNA凝胶中进行电泳，查看PCR扩增情况。如果内参基因ACTB的PCR扩增产物中存在390bp和800bp左右的两个条带，提示整个检测过程有效，如图1所示，如果缺少一条或二条带，提示检测失败，则需要重新进行检测。再次，如果通过内参基因ACTB的PCR结果证明检测过程有效，则配制CYP3A4基因长片段扩增PCR反应液和阴性、阳性反应液，前者中加入2μ I提取的受检者外周血基因组DNA，后者分别加入2μ I去离子水和阳性样品DNA，并各加入浓度为2ng/ μ I内部阳性控制序列2 μ 1，进行PCR扩增，PCR扩增结束后在浓度为2%的琼脂糖DNA凝胶电泳上成像，查看PCR扩增情况。受检者外周血标本CYP3A4基因第1~3外显子、4~7外显子、8~11外显子和12~13外显子扩增片段大小分别应为3780bp、4500bp、5210bp、4281bp左右，而且均有390bp左右条带一个，阳性对照组为800bp和390bp左右条带各一个，阴性对照组为390bp条带I个，如图1所示。
[0125]最后，回收纯化PCR产物以得到受检者CYP3A4第I~3外显子、4~7外显子、8~11外显子和12~13外显子的长片段中的一个，将该DNA片段用于测序反应的模板，配制PCR测序反应液后进行PCR测序反应，将PCR测序反应物纯化后上测序仪进行测序。
[0126]CYP3A4基因多态性的具体检测步骤如下:
[0127]①受检者外周血基因组DNA的抽提:采用实施例1试剂盒中的基因组DNA提取试剂按DNA抽提纯化的方法快速提取0.5ml受检者外周血基因组DNA。
[0128]②将上述提取的受检者外周血基因组DNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，通过紫外分光光度计测定260nm与280nm光密度值计算DNA的纯度与浓度，用无菌去离子水调节抽提的DNA至相同浓度，置冰箱_20°C保存。
[0129]③将实施例1试剂盒中的内部阳性控制序列标准品和内参基因ACTB标准品分别稀释至浓度为2ng/y I。
[0130]④内参基因ACTB的PCR扩增:
[0131]PCR反应体系为20 μ L，在该反应体系中各成分及终浓度如下:1Χ的PCR预混合液(Qiagen 公司，产品货号:210212, 2XPCR Premix, 10.0μ L)、Mg2+:3mM ； dNTPs:0.3mM ；dUTP:0.5mM ；Taq 酶:0.2U/μ L ；BSA:1.25wt% ；T4 噬菌体的基因 32 编码蛋白:lnmol/L ；内参基因ACTB上、下游引物均为:0.25pmol/yL;内部阳性控制序列上、下游引物均为:0.25pmol/ μ L ;内部阳性控制序列:0.3pmol/ μ L ;内参基因ACTB序列:0.2ng/ μ I ;其余为无RNase去离子水。
[0132]在ABI9700PCR仪器上进行PCR扩增，PCR反应程序为:先经过95° C3min，然后950C 30s, 570C 3.6min，72°C 3min，35 个循环，最后 72°C IOmin0
[0133]PCR扩增结束后在浓度为2%的琼脂糖DNA凝胶电泳上成像，从电泳图中可以看到存在390bp和SOObp左右的两个条带，提示整个检测过程有效，因此可以进行以下操作。
[0134]⑤CYP3A4基因第I~3外显子、4~7外显子、8~11外显子和12~13外显子长片段PCR扩增:
[0135]上述四个CYP3A4基因长片段的PCR反应体系均为20 μ L，在该反应体系中各成分及终浓度如下=IX的PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号:210212，2XPCR Premix,10.0μ L) ；Mg2+:3mM ；dNTPs:0.3mM ；dUTP:0.5mM ；Taq 酶:0.2U/μ L ；BSA:1.25wt% ；T4 噬菌体的基因32编码蛋白:lnmol/L ；CYP3A4基因第I~3外显子、第4~7外显子、第8~11外显子或第12~13外显子长片段扩增特异性上、下游引物均为0.25ρπι01/μ L ;内部阳性控制序列上、下游引物均为0.25ρπι01/μ L ;内部阳性控制序列:0.3pmol/yL ;受检者外周血基因组DNA的用量为2 μ L ;其余为无RNase去离子水。
[0136]在CYP3A4基因第I~3外显子、4~7外显子、8~11外显子和12~13外显子长片段PCR扩增的同时设置阳性对照和阴性对照，阳性对照和阴性对照的反应体系均为20 μ L，在该反应体系中各成分及终浓度如下:1Χ的PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号:210212，2XPCR Premix, 10.0μ L)；Mg2+:3mM ；dNTPs:0.3mM ；dUTP:0.5mM ；Taq 酶:0.2U/μ L ；BSA:1.25wt% ；T4噬菌体的基因32编码蛋白:lnmol/L ;内参基因ACTB扩增上、下游引物均为:0.25pm0l/y L ;内部阳性控制序列上、下游引物均为0.25pm0l/y L ;内部阳性控制序列:0.3pmol/yL ;阳性样品或者阴性样品的用量为2 μ L，其余为无RNase去离子水。
[0137]在ABI9700PCR仪器上进行PCR扩增，PCR反应程序为:先经过95°C 3min,然后95°C 30s, 57°C 3.6min，72°C 3min，35 个循环，最后 72°C IOmin0
[0138]PCR扩增结束后在浓度为2%的琼脂糖DNA凝胶电泳上成像。如图1所示。
[0139]⑥分别切取CYP3A4基因第I~3外显子、第4~7外显子、第8~11外显子和第12~13外显子长片段扩增PCR产物以及内部阳性控制序列PCR产物，利用Axy公司DNA凝胶回收试剂盒回收纯化扩增的DNA片段。
[0140]⑦测序反应液的配制:取4口1 Buffer测序缓冲液，浓度均为2ng/μ I的步骤⑥回收纯化得到的四个长片段DNA各I μ 1，再相对应地取浓度均为lpmol/ml的CYP3A4基因第1、2、3、4、5~6、7、8、9、10、11、12和13外显子上下游测序引物各I μ I。
[0141]在ΑΒΙ9700仪器上先98°C变性2min，然后进行PCR循环，PCR循环参数为96°C 10s，50°C 5s, 60°C 4min，25个循环，扩增结束后设置4°C保温。
[0142]⑧采用醋酸钠/乙醇法纯化步骤⑦的测序反应产物，按照ABI3130测序仪的操作说明进行测序。
[0143]⑨数据收集处理和分析:将所测得序列在NCBI核酸数据库中进行比对分析，分析CYP3A4基因多态性，结果参见表1。
[0144]表1为长片段PCR测序法分析受检者外周血基因组中CYP3A4基因多态性
[0145]
【权利要求】
1.一种检测CYP3A4基因多态性的试剂盒，包括检测用引物，其特征在于，所述检测用引物包括:CYP3A4基因第I~3外显子的长片段扩增特异性上下游引物、CYP3A4基因第4~7外显子的长片段扩增特异性上下游引物、CYP3A4基因第8~11外显子的长片段扩增特异性上下游引物和CYP3A4基因第12~13外显子的长片段扩增特异性上下游引物中的至少一对，以及与所述第I~3外显子的长片段DNA、第4~7外显子的长片段DNA、第8~11外显子的长片段DNA以及第12~13外显子的长片段DNA相对应的CYP3A4基因的各外显子的上下游测序引物中的至少一对，其中: 所述CYP3A4基因第I~3外显子长片段扩增特异性上游引物序列如序列表中SEQ IDNO:1所示； 所述CYP3A4基因第I~3外显子长片段扩增特异性下游引物序列如序列表中SEQ IDN0:2所示； 所述CYP3A4基因第4~7外显子长片段扩增特异性上游引物序列如序列表中SEQ IDN0:3所示； 所述CYP3A4基因第4~7外显子长片段扩增特异性下游引物序列如序列表中SEQ IDNO:4所示； 所述CYP3A4基因第8~11外显子长片段扩增特异性上游引物序列如序列表中SEQ IDN0:5所示； 所述CYP3A4基因第8~11外显子长片段扩增特异性下游引物序列如序列表中SEQ IDNO:6所示； 所述CYP3A4基因第12~13外显子长片段扩增特异性上游引物序列如序列表中SEQID NO:7 所示；. 所述CYP3A4基因第12~13外显子长片段扩增特异性下游引物序列如序列表中SEQID NO:8 所示； 所述CYP3A4基因第I外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO:9所示； 所述CYP3A4基因第I外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 10所示； 所述CYP3A4基因第2外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示； 所述CYP3A4基因第2外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 12所示； 所述CYP3A4基因第3外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 13所示； 所述CYP3A4基因第3外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 14所示； 所述CYP3A4基因第4外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 15所示； 所述CYP3A4基因第4外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 16所示； 所述CYP3A4基因第5~6外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 17所示； 所述CYP3A4基因第5~6外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 18所示； 所述CYP3A4基因第7外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 19所示； 所述CYP3A4基因第7外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 20所示； 所述CYP3A4基因第8外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 21所示； 所述CYP3A4基因第8外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 22所示； 所述CYP3A4基因第9外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 23所示； 所述CYP3A4基因第9外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ ID NO: 24所示；所述CYP3A4基因第10外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 25所示； 所述CYP3A4基因第10外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 26所示； 所述CYP3A4基因第11外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 27所示； 所述CYP3A4基因第11外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 28所示； 所述CYP3A4基因第12外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 29所示； 所述CYP3A4基因第12外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 30所示； 所述CYP3A4基因第13外显子上游测序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 31所示； 所述CYP3A4基因第13外显子下游测序引物序列如序列表中SEQ IDNO: 32所示。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内参基因ACTB以及内参基因ACTB扩增引物，其中， 所述内参基因ACTB扩增引物的上游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 33所示； 所述内参基因ACTB扩 增引物的下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:34所示； 所述内参基因ACTB的序列如序列表中SEQ ID NO:35所示。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括测序缓冲液，优选地，所述测序缓冲液为Buffer缓冲液,所述Buffer缓冲液的pH为8.3。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照和阳性对照，其中，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为CYP3A4*8型的CYP3A4基因多态性中的含389G>A突变位点的基因序列DNA样品。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括各种PCR反应试剂或者各种PCR反应试剂的混合物，优选地，所述各种PCR反应试剂包括:PCR预混合液、Mg2+(t匕如氯化镁)、dNTPs、dUTP、Taq酶、牛血清白蛋白、T4噬菌体的基因32编码蛋白以及无RNase去离子水。
6.根据权利要求1-5任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列以及内部阳性控制序列的扩增引物，其中: 所述内部阳性控制序列如序列表中SEQ ID NO:36所示； 所述内部阳性控制序列的扩增引物的上游引物如序列表中SEQ ID N0:37所示；所述内部阳性控制序列的扩增引物的下游引物如序列表中SEQ ID N0:38所示。
7.一种检测CYP3A4基因多态性的方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤一，提取受检者基因组DNA ； 步骤二，以步骤一得到的基因组DNA为模板，采用如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ IDNO: 2所示的CYP3A4基因第I~3外显子的长片段扩增特异性上下游引物、如序列表中SEQID N0:3和SEQ ID NO:4所示的CYP3A4基因第4~7外显子的长片段扩增特异性上下游引物、如序列表中SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6所示的CYP3A4基因第8~11外显子的长片段扩增特异性上下游引物或者如序列表中SEQ ID N0:7和SEQ ID NO:8所示的CYP3A4基因第12~13外显子的长片段扩增特异性上下游引物，PCR扩增CYP3A4基因第I~3外显子的长片段DNA、CYP3A4基因第4~7外显子的长片段DNA、CYP3A4基因第8~11外显子的长片段DNA或CYP3A4基因第12~13外显子的长片段DNA ； 步骤三，对步骤二的PCR扩增产物进行凝胶电泳，并回收纯化得到的CYP3A4基因第I~3外显子的长片段DNA、CYP3A4基因第4~7外显子的长片段DNA、CYP3A4基因第8~11外显子的长片段DNA或CYP3A4基因第12~13外显子的长片段DNA ； 步骤四，以步骤三回收纯化后得到的产物为模板，采用如序列表中SEQ IDN0:9和SEQID NO: 10所示的上下游引物、SEQ ID NO: 11和SEQ ID NO: 12所示的上下游引物、SEQ IDNO: 13和SEQ ID NO: 14所示的上下游引物、SEQ IDNO:15和SEQ ID NO: 16所示的上下游引物、SEQ ID NO: 17和 SEQ ID NO: 18所示的上下游引物、SEQ ID NO: 19和 SEQ ID NO: 20 所示的上下游引物、SEQ IDNO:21和SEQ ID NO:22所示的上下游引物、SEQ ID NO:23和SEQ IDNO: 24所示的上下游引物、SEQ ID NO: 25和SEQ ID NO: 26所示的上下游引物、SEQ IDNO: 27和SEQ ID N0:28所示的上下游引物、SEQ ID N0:29和SEQ ID NO:30所示的上下游引物以及SEQ ID N0:31和SEQ ID NO:32所示的上下游引物中的至少一对相应的上下游测序引物进行测序反应； 步骤五，将步骤四得到的测序反应产物纯化后上测序仪进行测序，将测得序列在NCBI核酸数据库中进行比对分析以获得CYP2D6基因多态性。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述步骤二中，所述PCR的反应条件如下:先经过95°C 3min ;然后进入PCR循环，所述PCR循环为95°C 30s,57°C 3.6min、72°C 3min，共 35 个循环；最后 72°C IOmin0
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述步骤四中，所述测序反应的条件如下:先98°C变性2min，然后进行PCR循环，PCR循环参数为96°C 10s，50°C 5s, 60°C 4min，共25个循环。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在所述步骤二中，所述PCR反应中还加入了如序列表中SEQ ID N0:36所示的内部阳性控制序列、如序列表中SEQ ID N0:37所示的内部阳性控制序列的扩增引物的上游引物以及如序列表中SEQ ID N0:38所示的内部阳性控制序列的扩增引物的下游引物。
【文档编号】C12Q1/68GK103468814SQ201310433222
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月22日 优先权日:2013年9月22日
【发明者】刘辉 申请人:刘辉