【具体实施方式】
[0028]以下实施例详细描述本发明，所述实施例仅是意图说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0029]以下实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0030]以下实施例中所使用的试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0031]实施例1本发明试剂盒中引物的设计和合成
根据GenBank中公布的IBV基因组序列(GenBank登录号为FJ807652)，选择Y端非编码区序列中无特殊结构且高度保守的区域设计引物，引物长度一般为20个碱基左右，引物间和引物内无互补序列:
引物 1: 5’ -CCGTTGCTTGGGCTACCTAGT-3’
引物 2: 5’ - CGCCTACCGCTAGATGAACC-3’ ；或引物 1:5’ -CTTTTGAGCCTAGCGTTGG-3’
引物 2:5’ - TTGTCACTGTCTATTGTATGTCTGC-3’ ；或引物 1:5’ -GGCGGGTGTGTGGAAGTAGC-3’
引物2:5’ - GCCGACCTTGTGCGAGAACG-3’。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
[0032]实施例2阳性对照质粒的构建
生物材料的准备:本发明所用的鸡传染性支气管炎病毒疫苗株H120，购自中国兽药监察所；SPF鸡胚购自北京梅里亚维通公司JM109基因工程菌、pMD18T载体购自大连宝生物工程有限公司。
[0033]5r端非编码区序列的RT-PCR扩增:根据传染性支气管炎病毒H120的基因组序列(GenBank登录号为FJ807652)设计引物，用于扩增其5'端非编码区片段，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列为5F:5’ -gttgctggtatcactgcttgt-3’，5R:5’-GACCACTGGCATGCTGTT-3’。将H120疫苗株接种于11日龄SPF鸡胚，36h后收获尿囊液；采用RNAiso Plus (大连宝生物工程有限公司)提取基因组RNA，反转录采用PrimeScript 1stStrand cDNA Synthesis Kit (大连宝生物工程有限公司)，按照使用说明书构建20 μ L的反应体系，以5R作为反转录引物，37°C，30min反转录反应。以上述反转录产物为模板，采用引物对5F和5R进行PCR扩增。PCR反应采用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase (大连宝生物工程有限公司)，按照产品说明书构建50 μ L的反应体系。反应条件为:95°C，30s ；52°C，30s ;72°C，lmin。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后进行胶回收，片段的大小约为0.7kb，与理论值一致(图1)。
[0034]重组质粒的构建及鉴定:将上述胶回收的DNA片段用T1ai7酶进行加T处理后，连接到pMD18-T载体中，转化JM109基因工程菌，菌落PCR鉴定阳性克隆。将获得的阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，筛选阳性对照质粒PMD5UTR。
[0035]实施例3 SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR的建立
1、标准曲线的建立和溶解曲线分析
采用无内毒素质粒提取试剂盒(美国Omega公司)提取阳性对照质粒pMD5UTR，并进行定量，然后按照10倍梯度进行稀释至10°?10 9拷贝/ μ L，以不同稀释度的阳性质粒作为模板，每个稀释度设3个重复，进行SYBR Green I实时荧光定量PCR扩增，绘制标准曲线。扩增反应体系为:SYBR Green 1、ROX Reference Dye、Ex Taq HS DNA 聚合酶、dNTPs、Mg2+等10yL，pMD5UTR质粒2yL，浓度为10 μ mol/L的引物I和引物2各0.4 μ L，dH20补足至20yL。扩增反应程序为:95°C 30s，然后95°C 5s, 60 °C 20s进行40个循环，然后95°C30s，20°C/s，60°C 30s，20°C/s，95°C 30s，0.1°C/s 进行溶解曲线分析。
[0036]标准曲线如图2所示，阳性对照模板浓度从I X 12?I X 10 7拷贝/ μ L具有良好的线性关系，各点基本在一条直线上。
[0037]溶解曲线如图3所示，从图中可以看出，溶解曲线只有单一的峰出现，表明为特异性的扩增反应，没有引物二聚体或其他非特异性的扩增。
[0038]2、IBV在鸡胚中的生长曲线测定
生物材料的准备:鸡传染性支气管炎病毒疫苗株Η120，购自中国兽药监察所；SPF鸡胚购自北京梅里亚维通公司；传染性支气管炎病毒致弱株rH120-YZ，已于2013年11月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC，中国，北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所)，其保藏编号为CGMCC N0.8501，分类命名为传染性支气管炎病毒，拉丁文名称为Infect1us Bronchitis Virus。
[0039]生长曲线的测定:将rH120_YZ株的种毒及H120的种毒，用PBS进行1: 1000倍稀释后，经尿囊腔接种10日龄SPF鸡胚各32枚。分别于接种后18h、24h、30h、36h、42h、48h、60h、72h收获尿囊液，采用荧光定量RT-PCR测定不同时间段的病毒滴度。结果如图4所示，毒株rH120-YZ株及其亲本毒株H120的病毒滴度在接种鸡胚30h后达到最高峰，然后逐渐下降。
【主权项】
1.一种用于鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测的引物，其特征在于，所述的引物对是通过对GenBank中公布的IBV基因组序列进行比较分析，选择5'端非编码区序列中无特殊结构且高度保守的区域设计而成。2.根据权利要求1所述的一种用于鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测的引物，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示:引物 1: 5’ - CCGTTGCTTGGGCTACCTAGT-3’ ；或5’ - CTTTTGAGCCTAGCGTTGG-3’ ；或5’ -GGCGGGTGTGTGGAAGTAGC-3’ ；引物 2: 5 ’ - CGCCTACCGCTAGATGAACC-3 ’ ；或5’ - TTGTCACTGTCTATTGTATGTCTGC-3’ ；或5 ’ - GCCGACCTTGTGCGAGAACG-3’。3.一种包含权利要求1或2所述引物的鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，包括引物对、SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR扩增预混液、阳性对照和水。4.根据权利要求3所述的鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述实时荧光定量RT-PCR扩增预混液:包含有SYBR Green 1、ROX Reference Dye、DNA聚合酶、反转录酶、dNTPs、Mg2+和RNA酶抑制剂。5.根据权利要求3所述的鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的阳性对照包含有IBV基因组5'端非编码区保守序列的重组质粒。6.一种鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，按以下步骤进行: O阳性对照质粒的构建: 5r端非编码区序列的RT-PCR扩增:根据传染性支气管炎病毒H120的基因组序列设计引物，用于扩增其5'端非编码区片段； 将H120疫苗株接种于SPF鸡胚，后收获尿囊液；采用RNAiso Plus提取基因组RNA，反转录米用 PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit，构建 20 μ L 的反应体系，以 5R作为反转录引物进行反转录反应； 以上述反转录产物为模板，采用引物对5F和5R进行PCR扩增，PCR反应采用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase，构建50 μ L的反应体系；PCR产物经电泳检测后进行胶回收； 重组质粒的构建及鉴定:将上述胶回收的DNA片段用T1ai7酶进行加T处理后，连接到pMD 18-T载体中，转化JMl 09基因工程菌，菌落PCR鉴定阳性克隆，将获得的阳性克隆进行序列测定，筛选阳性对照质粒PMD5UTR ; 2 )标准曲线的建立和溶解曲线分析 提取阳性对照质粒PMD5UTR，并进行定量，然后按照10倍梯度进行稀释至10°?10 9拷贝/yL，以不同稀释度的阳性质粒作为模板，每个稀释度设3个重复，进行SYBR Green I实时荧光定量PCR扩增，绘制标准曲线；扩增反应体系为:SYBR Green 1、ROX ReferenceDye、Ex Taq HS DNA 聚合酶、dNTPs、Mg2+ 等 10 μ L，pMD5UTR 质粒 2 μ L，浓度为 10 μ mol/L的引物I和引物2各0.4 μ L，dH20补足至20 μ L，扩增反应程序为:95°C 30s，然后95°C 5s，60°C 20s 进行 40 个循环，然后 95°C 30s，20°C/s，60°C 30s，20°C/s，95°C 30s, 0.1°C /s进行溶解曲线分析。7.根据权利要求6所述的一种鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述引物对的核苷酸序列分别如下所示:引物 1: 5’ - CCGTTGCTTGGGCTACCTAGT-3’ 或5’ - CTTTTGAGCCTAGCGTTGG-3’ 或5’ -GGCGGGTGTGTGGAAGTAGC-3’引物 2: 5’ - CGCCTACCGCTAGATGAACC-3’ 或5’ -TTGTCACTGTCTATTGTATGTCTGC-3’ 或5’ -GCCGACCTTGTGCGAGAACG-3’所述 5F:5’ -gttgctggtatcactgcttgt-3，，5R:5’ -GACCACTGGCATGCTGTT-3，。8.根据权利要求6所述的一种鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述I)步骤中:所述H120疫苗株接种于11日龄SPF鸡胚，36h后收获尿囊液；PCR反应条件为:95°C，30s ；52°C, 30s ;72°C，Imin ;PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后进行胶回收。9.根据权利要求6所述的一种鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，所述2)步骤中:采用无内毒素质粒提取试剂盒提取阳性对照质粒PMD5UTR，并进行定量。
【专利摘要】本发明涉及一种用于鸡传染性支气管炎病毒荧光定量RT-PCR检测的引物及含有该引物的检测试剂盒及其检测方法。包括用于扩增鸡传染性支气管炎病毒（IBV）5′端非编码区保守序列的特异性引物对，其中所述的引物对由引物1和引物2组成，所述引物1为序列表中序列1或序列2或序列3所示的单链DNA，所述引物2为序列表中序列4或序列5或序列6所示的单链DNA。通过特异性、灵敏度、稳定性和重复性实验，证明该试剂盒只能特异性扩增IBV核酸，在1×102～1×107个拷贝·μL-1范围内具有良好的线性关系，灵敏度达到102个拷贝·μL-1。本发明适用于各种组织、细胞、体液样品及疫苗生产中间产品中IBV核酸的定量检测。CGMCC No.850120131108
【IPC分类】C12R1/93, C12Q1/68, C12Q1/70, C12N15/11
【公开号】CN105039585
【申请号】CN201510099986
【发明人】周生, 唐梦君, 许明, 陈连颐, 蒲俊华, 姜逸, 程旭, 沈欣悦, 李建梅, 戴亚斌, 戴有理, 赵宝华
【申请人】江苏省家禽科学研究所, 周生, 唐梦君
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年3月8日