专利名称：一种牛传染性鼻气管炎疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种牛传染性鼻气管炎疫苗及其制备方法，属于兽用生物制品技术领 域。
背景技术：
牛传染性鼻气管炎infectious Bovine Rhinotracheitis, IBR)是由牛传染性 鼻气管炎病毒(Infectious Bovine Rhinotracheitis virus, IBRV)引起牛发生的一种急 性、热性、接触性传染病，以高热、呼吸困难、鼻炎、窦炎和上呼吸道炎症为特征。还可引起 母牛生殖系统损害、出现流产和死胎，以及发生肠炎和小牛脑炎，有时发生眼结膜炎和角膜 炎，对奶牛的产奶量、公牛的繁殖力及使役牛的使役力均有较大的影响，而且急性的IBR呼 吸道感染可继发牛致命性细菌性肺炎，是造成养牛业经济损失的主要原因之一。近年来随着奶牛数量的迅速增长，牛群中流产病例增多，而且有些病例布鲁氏菌 病检查为阴性，有的还出现生殖器疱疹。这些症状提示牛群中存在IBR，牛群中假如存在 IBR的潜伏感染，则很难将其根除，将对养牛业造成极大的危害。一旦感染IBRV，病毒可潜 伏于三叉神经节或荐神经节造成潜伏感染或散毒，病牛可终身带毒，给本病的防治带来很 大的困难。由于畜牧业的集约化发展和人们生活水平的提高，我国养牛业的规模不断扩大， 牛的数量也迅猛增加，但由于某些重大传染病不能根治，如牛呼吸道病毒群，包括牛疱疹病 毒-I型(BHV-I)、牛副流感病毒(BPIV3)、牛呼吸道综合症病毒(BRSV)和牛病毒性腹泻病 毒(BVDV)等，其流行和危害有增无减，给养牛业造成巨大的经济损失。另外，世界贸易组织 对进出口的牛及其制品具有严格地检疫政策，以控制牛病的发生和流行。我国的动植物检 疫法中也明确规定，凡进出口的牛及制品必须进行IBRV的检测。因此，尽快启动牛的重大 疾病的根除和控制计划势在必行，用疫苗免疫接种是预防和控制的重要措施。美国及欧洲很多国家通过疫苗免疫接种，对牛传染性鼻气管炎的流行起到很好的 控制作用，但也存在免疫效果差、抗体阳性率低及活疫苗散毒等问题。我国在这方面的研究 比较落后，未见疫苗研制成功报告。本发明通过无菌采集IBR流产胎牛的肝、脾、心、肾、胎 盘、肺病料，接种犊牛睾丸细胞进行病毒分离，并且对所分离病毒进行血清学、分子生物学 以及理化特性鉴定，确定为牛传染性鼻气管炎病毒，并将其制成油乳剂灭活疫苗，临床试验 结果证明，2头份剂量即可使免疫牛抗体阳性率达到100%，具有良好的免疫效果，且灭活 疫苗不存在散毒的危险，可以用来预防控制牛传染性鼻气管炎地方性流行，具有重要的应 用价值，填补了我国该方面研究的空白。同时，本发明也为牛传染性鼻气管炎基因工程疫苗 的应用研究奠定了基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种牛传染性鼻气管炎疫苗及其制备方法，用于解决牛传染 性鼻气管炎地区性流行的疫苗预防控制问题。本发明是通过以下技术方案实现的
一种牛传染性鼻气管炎疫苗，其特征在于所述病毒为牛传染性鼻气管炎病毒， Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus，简称IBRV，系从牛传染性鼻气管炎流行地区 分离鉴定。上述牛传染性鼻气管炎疫苗，所述牛传染性鼻气管炎病毒对乙醚、氯仿和胰蛋白 酶敏感；不耐酸碱，用0. lmol/L NaOH和0. lmol/L HCl溶液将病毒液分别调到pH3，pH9和 pHll，37°C作用lh，即可将病毒灭活；可被IBRV阳性血清中和，中和抗体滴度为2_7 9 ；TCID50 值为 1(Γ6.65/100 μ 1，1(Γ3.35/20 μ 1。上述牛传染性鼻气管炎疫苗，所述牛传染性鼻气管炎病毒可以用IBRV特异性引 物经PCR扩增出339bp的gB基因的高保守区序列，所述的IBRV特异性引物序列为PBl 5' -GGC TCT ACC GCA CGG GCA CCT CT-3'；PB2 5' -GCG GCT CTC GTC TCG CAG CAT TT-3'。一种牛传染性鼻气管炎疫苗制备方法，制备方法包含如下步骤a.病毒分离无菌采集IBR流产胎牛的肝、脾、心、肾、胎盘、肺，剪碎、研磨，随后加 入5倍量Hanks (内含200IU/ml青霉素和200 μ g/ml链霉素)，制成乳剂后移入IOml离心管 中，反复冻融三次。以3000r/min离心lOmin，取上清液过滤除菌。用Hanks液稀释10倍、 100倍、1000倍，分别接种长成致密单层且形态完好的犊牛睾丸原代细胞，连续传代35-50 代分离得到。b.病毒鉴定用特异性的抗IBRV标准阳性血清与分离病毒进行中和试验，IBRV标 准阳性血清对分离株的中和抗体滴度为2_81 ；提取分离病毒DNA模板，用IBRV特异性引物 经PCR扩增出339bp的gB基因的高保守区序列，证实分离的病毒为IBRV。c.病毒繁殖将毒种接种长成致密单层且形态完好的犊牛睾丸原代细胞，适时收 获，测定效价，效价达到106_5TCID5cZO. Iml的毒液用于制苗。d.灭活乳化毒液中加入37%甲醛溶液使终浓度达到2%。，灭活12小时，按4%加 入吐温-80，与含有硬脂酸铝、6%司班-80熬制而成的白油按体积比1 2混合，经高 速剪切乳化机10000转/分钟乳化15分钟制成油乳剂灭活疫苗。上述牛传染性鼻气管炎疫苗制备方法，适用于所有牛传染性鼻气管炎分离毒株的 疫苗制备。上述牛传染性鼻气管炎疫苗制备方法，在疫苗制备过程中可加入任意免疫增强 佐剂。本发明从牛传染性鼻气管炎流产胎牛采集病料，接种犊牛睾丸原代细胞连续传代 分离病毒，鉴定证明分离病毒为牛传染性鼻气管炎病毒，并将其制备成油乳剂灭活疫苗，可 用于地区性牛传染性鼻气管炎的预防控制。
具体实施例方式本发明将结合具体实施例做进一步的说明，这些实例仅用于说明目的，而不用于 限制本发明范围。实施例1牛传染性鼻气管炎疫苗制备方法1.病毒分离无菌采集IBR流产胎牛的肝、脾、心、肾、胎盘、肺，用灭菌的Hanks液 漂洗数次后剪碎、研磨。随后加入5倍量Hanks (内含200IU/ml青霉素和200 μ g/ml链霉素)，制成乳剂后移入IOml离心管中，反复冻融三次。以3000r/min离心lOmin，取上清液 过滤除菌。用Hanks液稀释10倍、100倍、1000倍，置-20°C保存备用。挑选长成致密单层 且形态完好的犊牛睾丸原代细胞，弃营养液，用Hanks液轻洗细胞3次，分别按原液、10倍、 100倍、1000倍四个梯度加入处理好的病料上清液，加入量为细胞培养液的1/10，37°C吸附 Ih,加入维持液，37°C继续培养并逐日观察并记录细胞病变(CPE)，培养7 后收毒，反复冻 融3次后继续传代，一直传代到出现细胞病变，此时当细胞出现75%的细胞病变时收毒，反 复冻融3次后继续传代，连续传代至第50代。病料悬液接种犊牛睾丸细胞后盲传至第7代时，接种后的细胞变圆、变暗，中心部 位细胞脱落，形成典型的IBRV细胞病变。继续传代，细胞病变规律，出现细胞病变时间变 短，24h即出现病变，4 细胞病变最明显，7 细胞完全脱落，最终将病毒传代至第50代。 测定各代次病毒TCID5tl，35-50代次病毒TCID5tl基本趋于一致，效价为106 5TCID5(1/0. 1ml，作 为生产用毒种。2.病毒鉴定用特异性的抗IBRV标准阳性血清与分离病毒进行中和试验，IBRV标 准阳性血清对分离株的中和抗体滴度为2_81 ；提取分离病毒DNA模板，用IBRV特异性引物 经PCR扩增出339bp的gB基因的高保守区序列，证实分离的病毒为IBRV。3.病毒繁殖将毒种按量接种长成致密单层且形态完好的犊牛睾丸原代 细胞，37°C、10转/小时转瓶培养，当病变达到75-80%时适时收获，测定效价，效价达到 l(f5TCID5Q/0. Iml的毒液用于制苗。4.灭活乳化毒液中加入37%甲醛溶液使终浓度达到2%0，灭活12小时，按4%加 入吐温-80，与含有硬脂酸铝、6%司班-80熬制而成的白油按体积比1 2混合，经高 速剪切乳化机10000转/分钟乳化15分钟制成油乳剂灭活疫苗。该疫苗经物理性状检测，剂型为油包水，粘度适中，稳定性良好，疫苗在4°C放置1 年；37°C放置21天，均未见分层。安全检验1.用10头份剂量肌肉注射1月龄犊牛，观察14天，未见由疫苗注射引起的局部及 全身不良反应。2.用10头份剂量肌肉注射产前1月怀孕母牛，未见由疫苗注射引起的局部及全身 不良反应和流产。效力检验用1头份剂量肌肉注射12月龄奶牛，免疫后21-35天采血测抗体，抗体 阳性率为95%。实施例2免疫效果试验1.材料1. 1牛传染性鼻气管炎油乳剂灭活疫苗1. 2牛传染性鼻气管抗体阴性成年奶牛2.方法选取牛传染性鼻气管抗体阴性成年奶牛70头，随机分为4组，3个组作为免疫组， 1个组作为对照组。免疫组分别肌肉注射实施例1制备的牛传染性鼻气管炎油乳剂灭活疫 苗1头份、2头份、4头份；对照组不免疫，免疫后35天，分别采血测抗体。分组及免疫方法 见表1。
表1分组及免疫方法
权利要求
1.一种牛传染性鼻气管炎疫苗，其特征在于所述病毒为牛传染性鼻气管炎病毒， Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus，简称IBRV，系从牛传染性鼻气管炎流行地区 分离鉴定。
2.根据权利要求1所述的牛传染性鼻气管炎疫苗，其特征在于所述牛传染性鼻气管炎 病毒对乙醚、氯仿和胰蛋白酶敏感；不耐酸碱，用0. Imol/LNaOH和0. lmol/L HCl溶液将病 毒液分别调到pH3，pH9和pHll，37°C作用lh，即可将病毒灭活；可被IBRV阳性血清中和，中 和抗体滴度为 2_7.9 ；TCID5tl 值为 10_6·65/100 μ 1，10_3·35/20 μ 1。
3.根据权利要求1所述的牛传染性鼻气管炎疫苗，其特征在于所述牛传染性鼻气管炎 病毒可以用IBRV特异性引物经PCR扩增出339bp的gB基因的高保守区序列。
4.根据权利要求3所述的牛传染性鼻气管炎疫苗，其特征在于所述的IBRV特异性引物 序列为PBl 5' -GGC TCT ACC GCA CGG GCA CCT CT-3'；PB2 5' -GCG GCT CTC GTC TCG CAG CAT TT-3'。
5.一种牛传染性鼻气管炎疫苗制备方法，其特征在于所述制备方法包含如下步骤a.病毒分离无菌采集IBR流产胎牛的肝、脾、心、肾、胎盘、肺，剪碎、研磨，随后加入5 倍量Hanks (内含200IU/ml青霉素和200 μ g/ml链霉素)，制成乳剂后移入IOml离心管中， 反复冻融三次。以3000r/min离心lOmin，取上清液过滤除菌。用Hanks液稀释10倍、100 倍、1000倍，分别接种长成致密单层且形态完好的犊牛睾丸原代细胞，连续传代35-50代分 离得到。b.病毒鉴定用特异性的抗IBRV标准阳性血清与分离病毒进行中和试验，IBRV标准 阳性血清对分离株的中和抗体滴度为2_81 ；提取分离病毒DNA模板，用IBRV特异性引物经 PCR扩增出339bp的gB基因的高保守区序列，证实分离的病毒为IBRV。c.病毒繁殖将毒种接种长成致密单层且形态完好的犊牛睾丸原代细胞，适时收获， 测定效价，效价达到106_5TCID5tlA). Iml的毒液用于制苗。d.灭活乳化毒液中加入37%甲醛溶液使终浓度达到2%0，灭活12小时，按4%加入吐 温-80，与含有硬脂酸铝、6%司班-80熬制而成的白油按体积比1 2混合，经高速剪 切乳化机10000转/分钟乳化15分钟制成油乳剂灭活疫苗。
6.根据权利要求5所述的牛传染性鼻气管炎疫苗制备方法，其特征在于所述疫苗制备 方法适用于所有牛传染性鼻气管炎分离毒株的疫苗制备。
7.根据权利要求5所述的牛传染性鼻气管炎疫苗制备方法，其特征在于所述疫苗制备 过程中可加入任意免疫增强佐剂。
全文摘要
本发明涉及一种牛传染性鼻气管炎疫苗及其制备方法，属于兽用生物制品技术领域，用于解决牛传染性鼻气管炎地区性流行的疫苗预防控制问题。该疫苗通过从感染牛传染性鼻气管炎病毒的母牛流产胎儿组织分离病毒、繁殖传代、效价检测、灭活乳化等步骤制备而成，可以用于地区性牛传染性鼻气管炎流行的预防控制。
文档编号A61P31/20GK102049043SQ20091007113
公开日2011年5月11日 申请日期2009年11月4日 优先权日2009年11月4日
发明者刘爱玲, 夏雪林, 申宏旺, 马丽伟 申请人:天津瑞普生物技术股份有限公司