耐热植酸酶及其基因的克隆和表达的制作方法

专利名称：耐热植酸酶及其基因的克隆和表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植酸酶，特别涉及一种植酸酶及其基因的克隆和表达。
背景技术：
长期以来，农村广泛使用化肥，化肥可以增加土壤肥力，但连续使用化肥，肥效日减，不得不加大施肥量。而过量施用化肥，则会造成土壤板结，地力减弱，还破坏农作物品质。同时造成化学残留公害，污染环境(如水体富营养化)，导致恶性循环，危及子孙后代。在七十年代，国际上成立了“有机农业联盟”，在世界范围呼吁不用或尽量少用化肥，大力提倡使用有机肥料。在这种共识下，世界各国均在努力以生物菌肥来取代化肥。现美国已有5％的农场发展为不用化肥和农药的无化学农场。德国正在鼓励和发展不用化肥，已有3％的农田采用生态农业模式。前苏联也有1/2豆类农作物使用微生物肥料。
现有生物肥料的活性大多是矿化不溶性无机磷[Ca3(PO4)2·Ca(OH)2]和部分有机磷。使耕层土壤中的无效磷成为植物可以利用的磷营养。耕层土中的磷15％--95％为有机形态。其中大量有机磷以植酸的形式存在。特别是提倡秸杆还田和使用粪肥以后，更多的植酸被带入耕层。许多研究表明决定磷对植物的有效性的主要因素不是土壤内有机磷的含量，而是矿化速率。植酸酶的作用底物是植酸及其盐类，它能释放出有效磷。
然而，植物所编码的植酸酶是非分泌型的，由于缺少胞外植酸酶活力，植物对于土壤中有机磷的主要成分植酸的利用率很低。自然状态下由某些微生物产生的植酸酶(3-肌醇六磷酸酶，Myo-Inositol-hexaphosphate 3-phosphohydrolase)可作用于酯键，催化磷酸单酯水解，能将植酸水解为肌醇和无机磷。具体反应为
同时植酸酶是一种能将饲料中植酸水解成无机磷和肌醇的新型单胃动物饲料添加剂，这是当前世界性的研究热点之一。磷在植物中主要以植酸(肌醇六磷酸)及其盐类的形式存在。它们在植物和油料作物种子中的含量占干重的1％-3％，但却贮存着植物中总磷的60％-90％，是种子萌发所需磷的主要来源。动物所需的磷主要从植物中获取。动物的生长、繁殖、骨骼矿化及代谢都需要磷。然而，在人和单胃动物的食物中，来源于植物的植酸具有强烈的抗营养作用。美国肯塔基大学通过10年研究证实，猪只能利用玉米中磷的10％-20％，豆饼中磷的15％-35％，而鸡对玉米和豆粕中磷的利用率比猪还低。由此可见，食物中85％左右的磷未能有效吸收就从粪便中排出。
磷作为一种必须的矿物营养素在动物营养中具有重要作用。为预防磷缺乏病，又必须在食物或饲料中添加无机磷酸盐，以满足畜禽对磷的需求，因此，造成磷酸的严重浪费。人类营养学家研究表明，植酸的这种性质也导致了人类钙、锌、铁、钾的缺乏和数量不平衡。由于植酸的抗营养作用造成了食物利用率低下、营养无利用流失和必须营养的“添加浪费”现象，也是一直困扰食品和饲料工业的一大难题。
植酸酶可解除植酸的抗营养作用，提高食品及饲料中矿物元素和蛋白质的营养有效性以及能量平衡能力。Nayini等(1983)证明，添加植酸酶经过约2小时发酵后，植酸盐含量可降低58％-70％。植酸酶能从植酸分子上将磷酸水解下来，破坏了它对矿物质和蛋白质的亲和力，从而提高矿物质的营养有效性和蛋白质的消化率；同时可使一些酶如淀粉酶等恢复其原有的活性，提高了食品和饲料的能量有效性。Simons等将植酸酶添加到鸡饲料中，饲喂肉用仔鸡，试验表明，添加植酸酶可使磷的利用率提高60％，粪便中磷排出量减少40％，显著提高了肉仔鸡的增重量和饲喂效果。由此可见，在讲究膳食营养和注重饲料利用率的今天，研究和利用植酸酶具有相当重要的意义。
然而，植酸酶应用于农业及食品和饲料添加剂，需要进行工业化加工和处理，为此，要求植酸酶在经过较高温度的工艺加工和处理后，仍能保持较高的生物活性。而现有的植酸酶其耐温性较差，使植酸酶在农业及食品和饲料添加剂领域的应用受到制约。

发明内容
本发明是针对上述问题进行的研究，目的是筛选一种可产生耐热植酸酶的菌株，利用分子生物学的手段，将编码此产物的基因进行基因克隆和表达；提供一种经过较高温度的工艺加工和处理后仍具有生物活性的耐热植酸酶。
本发明的技术方案是筛选一种可产生耐热植酸酶的天然菌株，并从菌株中提取基因DNA，采用PCR方法(ManiatisT.，et al.Molecular cloning.New Yorkcold spring harberlaberalory，1982)扩增出耐热植酸酶基因。利用连接酶将此基因连接于克隆载体pMD18-T上，转化大肠杆菌，检出阳性克隆。对于阳性克隆所携带目的基因进行全序列分析。耐热植酸酶基因DNA序列为S1，由DNA序列推导出氨基酸序列为S2。
<110>天津师范大学<120>耐热植酸梅及其基因的克隆和表达<160>1200<211>383
<212>DNA<213>芽孢杆菌(Bacillus sp.)<400>1S1NewSequence SequenceATGAATCATT CAAAAACACT TTTGTTAACC GCGGCAGCCG GATTGATGCT 50CACATGCGGT GCGGTTTCTT CCCAGGCCAA GCATAAGCTG TCTGATCCTT 100ATCACTTTAC CGTGAATGCG GCGGCGGAAA CGGAGCCGGT TGATACAGCC 150GGTGATGCAG CTGATGATCC TGCGATTTGG CTGGACCCCA AGAATCCTCA 200GAACAGCAAA TTGATCACAA CCAATAAAAA ATCAGGCTTA GTCGTGTACA 250GCCTAGAGGG AAAGACGCTT CATTCCTATC ATACCGGGAA GCTGAACAAT 300GTTGATATCC GCTATGATTT TCCGTTGAAC GGAAAAAAAG TCGATATTGC 350GGCGGCATCC AATCGGTCTG AAGGAAAGAA TACCATTGAG ATTTACGCCA 400TTGACGGGAA AAACGGCACA TTACAAAGCA TTACAGATCC AGACCGCCCG 450ATTGCATCAG CAATTGATGA AGTATACGGT TTCAGCTTGT ACCACAGTCA 500AAAAACAGGA AAATATTACG CGATGGTGAC AGGGAAAGAA GGCGAATTTG 550AACAATACGA ATTAAATGCG GATAAAAATG GATACATATC CGGCAAAAAG 600GTAAGGGCGT TTAAAATGAA TTCTCAGACA GAAGGGATGG CAGCAGACGA 650TGAATACGGC AGTCTTTTAT TCGCAGAAGA AGATGAGGCC ATCTGGAAGT 700TCAGCGCTGA GCCGGACGGC GGCAGTAACG GAACGGTTAT CGATCGTGCC 750GACGGCAGGC ATTTAACCCC TGATATTGAA GGACTGACGA TTTACTACGC 800TGCTGACGGG AAAGGTTATC TGCTTGCATC AAGCCAGGGT AACAGCAGCT 850ACGCGATTTA TAAAAGACAG GGACAGAACA AATATGTTGC GGACTTTCAG 900ATAACAGACG GGCCTGAAAC AGACGGCACA AGCGATACAG ACGGAATTGA 950CGTTCTGGGT TTCGGGCTGG GGCCTGAATA TCCGTTCGGC CTTTTTFTCG1000CACAGGATGG AGAAAATATA GATCACGGCC AAAAAGTGAA TCAAAATTTT1050AAAATGGTGC CTTGGGAAAG AATCGCCGAT AAAATCGGCT TTCACCCGCA1100GGTCAATAAA CAGGTCGACC CGAGAAAACT GACCGACAGA AGCGGAAAAT1150AAACATGCAA AAAGCAGCTT ATACAAGCTG CTTTTTGCAT GTGAAGAACG1200S2NewSequence Sequence
MNHSKTLLLT AAAGLMLTCG AVSSQAKHKL SDPYHFTVNA AAETEPVDTA 50GDAADDPAIW LDPKNPQNDK LITTNKKSGL VVYSLEGKTL HSYHTGKLNN100VDURYDFPLN GKKVDUAAAS NRSEGKNTUE UYAUDGKNGT LQSUTDPDRP150IASAIDEVYG FSLYHSQKTG KYYAMVTGKE GEFEQYELNA DKNGYISGKK200VRAFKMNSQT EGMAADDEYG SLYIAEEDEA IWKFSAEPDG GSNGTVIDRA250DGRHLTPDIE GLTTYYAADG KGYLLASSQG NSSYAIYERQ GQNKYVADFQ300ITDGPETDGT SDTDGIDVLG FGLGPEYPFG LFVAQDGENI DHGQKVNQNF350KMVPWERIAD KIGFHPQVNK QVDPRKLTDR SGK- 383耐热植酸酶基因全长1152核苷酸，编码383个氨基酸；N端的26个氨基酸为信号肽，信号肽的切割位点在+26位的Ala之后。
耐热植酸酶基因的克隆方法，包括如下步骤(1)菌株的筛选a)取土样少许，放入无菌水的三角瓶中，摇匀，稀释，涂布于基因供体菌筛选固体培养基上，37℃培养24小时，挑选单个菌落转接基因供体菌筛选培养基上；b)收集各种细菌纯培养菌种，转接基因供体菌筛选培养基斜面培养基上。蒋株菌以相同的方法转接于基因供体菌筛选固体培养基上，37℃培养7天，取出，比较水解圈的情况，挑选形成明显水解圈的菌种，得到SD01N，SD01X，SD01B，SD01D。
(2)设计合成引物P1和P2根据参考资料(《精编分子生物学实验指南》[美]F.奥斯伯等)提供的方法分别提取SD01N，SD01X，SD01B，SD01D菌株的总DNA，设计合成引物P1和P2P15’CTG CAG GAT CCATGAATC ATT CAAAAA CAC TTT TGT 3’1P25’TTTAAGCTTCGTTCTTCACATGCAAAAAGC 3’(3)克隆耐热植酸酶基因分别以SD01N，SD01X，SD01B，SD01D菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应参数为94℃ 1分钟，50℃ 1分钟，72℃ 2分钟，30个循环，72℃ 10分钟。由SD01N菌株的基因组DNA扩增出约1.2Kb的DNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳，回收DNA片段，经酶切后连接于载体pMD18-T上，得到pMD18-TP，转化E.coli Competent CellJM109，筛选阳性克隆，进行DNA全序列测定分析，序列测定结果为S2，耐热植酸酶基因全长1152个核苷酸，编码383个氨基酸，其氨基酸序列为S2；N-端26个氨基酸为信号肽，信号肽的切割位点在+26位的Ala之后。
耐热植酸酶基因的工程菌株制备方法，它包括如下步骤(1)将耐热植酸酶基因从pMD18-TP上切下，再连接于表达载体的pQE30上形成重组DNA即pQE30-P；(2)挑取E.Coli M15单菌落接种于LB(Km50μg/mlAp100μg/ml)培养基中，LB培养基1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，PH7；250rpm，37℃，摇床培养3小时，冰浴10分钟，转入预冷离心管中，冷冻离心，收集沉淀，用CaCl2溶液洗沉淀，并且重悬于CaCl2溶液中，冰浴30分钟，加入pQE30-P，冰浴30分钟，42℃水浴1分30秒，冰浴2分钟，添加新鲜LB培养液，37℃ 250rpm培养1小时，培养物涂于LB平板培养基上，放入37℃温箱培养过夜。
(3)挑选克隆子，以PCR的方法筛选阳性克隆子，将阳性克隆子转接LB斜面培养基；由此，筛选出耐热植酸酶基因工程菌株SDLiuTP01，即本发明的构建的基因工程菌株，其微生物分类名为大肠杆菌(E.coli)。
本发明的耐热植酸酶基因的表达产物----是在25---95℃温度范围内具有生物活性，最适反应温度为65℃的耐热植酸酶，见图5。
本发明的耐热植酸酶，它可用于研制植物生长促进剂、堆肥添加剂、生物肥料、生物菌肥、有机肥料、复合肥料等肥料、饲料、食品添加剂。
本发明的优点和积极效果是目前用于微生物肥料和植物生长促进剂生产的菌株均为原核生物。由于本发明所持耐热植酸酶基因来源于原核生物，原核生物来源的耐热植酸酶基因与这些菌株具有遗传学上的亲缘关系，物种间的差异较小。因此，本发明所持耐热植酸酶基因可以基因工程手段导入这些菌株，获得新的植酸酶基因工程菌株，使这些具有优良性状的自然菌株增加耐热植酸酶的新性状，能使其更好地应用于科学研究和生产实践。
本发明所持耐热植酸酶基因导入真核生物，通过基因重组，可以更便利地表达耐热植酸酶。
本发明克隆的耐热植酸酶基因，具有独特的核苷酸序列，其编码的植酸酶为耐热植酸酶，因为具有耐热性，在较宽温度范围内具有生物活性，实验证明，在25-95℃温度范围内均具有生物活性，见图5。其产品在工业化操作过程中，例如堆制、发酵、造粒、粉碎、运输等操作中，仍能保持较高的生物活性，解决了植酸酶生产、制造、运输等过程中的耐高温问题，使其农业和工业应用价值增加。
本发明克隆的耐热植酸酶具有增加土壤肥力、不破坏农作物品质、提高磷利用率、促进植物生长的作用。可解除植酸的抗营养作用，提高食品及饲料中矿物元素和蛋白质的营养有效性以及能量平衡能力，提高矿物质的营养有效性和蛋白质的消化率；同时，可使一些酶如淀粉酶等恢复其原有的活性，提高了食品和饲料的能量有效性。解决了营养无利用流失和必须营养的“添加浪费”这一困扰食品和饲料工业的大难题。
本领域普通技术人员可以按本发明之方法获得耐热植酸酶基因，并导入本发明所列之生物；也可以对本发明的酶进行各种改造，如用各种化学修饰基因进行修饰，如糖基化，磷酸化，N端氨基化，蛋白内切割等，也可以为改善其表达后的转运而添加信号肽及在耐热植酸酶蛋白前或后加上融合肽等，而不改变本发明酶的基本功能，如酶活性、底物特异性。这些通称为本发明酶的功能衍生物，均包括在本发明的范围内。


图1.Bacillus sp.SD01N在筛选平板上形成的透明水解圈。
图2.耐热植酸酶基因扩增电泳3基因工程菌株表达载体pQE30的物理图谱图4基因工程菌株SDLiuTP01的阳性克隆电泳图1，3 PCR阴性克隆 2，4 PCR阳性克隆图5基因工程菌株SD LiuTP01产生的耐热植酸酶的温度适性具体实施方式
实施例11.材料来源生物酶限制性内切酶、连接酶购于Promega公司，Tag酶、DNA回收kit等购于上海生物工程公司；化学试剂植酸钙、植酸钠购于Sigma公司，IPTG购于联星生物公司；培养基基因供体菌筛选培养基D-glucose 20％，Sodium phytate 0.01％，CaCl20.2％，NH4NO30.5％，KCl 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，FeSO4·7H2O 0.001％，MnSO4·H2O0.001％，琼脂20％；其它引物合成上海基康生物技术公司和上海生工生物公司；DNA序列测定大连宝生物公司和联合基因科技公司；E.coli JM109和pMD18-T，购于大连宝生物公司。
2.产生耐热植酸酶的天然菌株的筛选(1)取土样1克，放入无菌水的三角瓶中，摇匀，稀释，涂布于基因供体菌筛选固体培养基上，37℃培养24小时，挑选单个菌落转接基因供体菌筛选培养基上。
(2)收集各种细菌纯培养菌种，转接基因供体菌筛选培养基斜面培养基上。共203株菌以相同的方法转接于基因供体菌筛选固体培养基上，37℃培养7天，取出，比较水解圈的情况。挑选形成明显水解圈的菌种共4株。得到SD01N，SD01X，SD01B，SD01D见图1。
3.合成引物根据参考资料(《精编分子生物学实验指南》[美]F.奥斯伯等)提供的方法分别提取SD01N，SD01X，SD01B，SD01D菌株的总DNA，设计合成引物P1和P2P15’CTG CAG GAT CCA TGA ATC ATT CAA AAA CAC TTT TGT 3’1P25’TTT AAG CTT CGT TCT TCA CAT GCA AAA AGC3’4.克隆耐热植酸酶基因分别以SD01N，SD01X，SD01B，SD01D菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应参数为94℃ 1分钟，50℃ 1分钟，72℃ 2分钟，30个循环，72℃ 10分钟。由SD01N菌株的基因组DNA扩增出约1.2Kb的DNA片段，见图2。通过琼脂糖凝胶电泳，回收DNA片段，经酶切后连接于载体pMD18-T上，得到pMD18-TP。转化E.coli CompetentCell JM109，筛选阳性克隆，进行DNA全序列测定分析，序列测定结果见S1。耐热植酸酶基因全长1152个核苷酸，编码383个氨基酸，N-端26个氨基酸为信号肽，信号肽的切割位点在+26位的Ala之后，其氨基酸序列见S2。
实施例2耐热植酸酶表达系统的建立选择高效表达系统E.Coli M15作为表达耐热植酸酶的生物反应器。将实施例1得到的耐热植酸酶基因从pMD18-TP上切下，再连接于表达载体的pQE30上形成重组DNA即pQE30-P，见图3。
挑取E.Coli M15单菌落接种于LB(Km50μg/mlAp100μg/ml)培养基中，LB培养基1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，PH7；250rpm，37℃，摇床培养3小时。取出马上冰浴10分钟，转入预冷离心管中，冷冻离心，收集沉淀，用冷CaCl2溶液洗沉淀，并且重悬于CaCl2溶液中，冰浴30分钟，加入pQE30-P，冰浴30分钟，42℃水浴1分30秒，冰浴2分钟，添加新鲜LB培养液，37℃ 250rpm培养1小时，培养物涂于LB平板培养基上，放入37℃温箱培养过夜。
挑选克隆子，以PCR的方法筛选阳性克隆子，电泳结果见图4。将阳性克隆子转接LB斜面培养基。由此，筛选出耐热植酸酶基因工程菌株SDLiuTP01，其微生物分类名为大肠杆菌E.coli。
实施例3耐热植酸酶特性将SDLiuTP01培养于LB(Km25ug/ml，Ap50ug/ml)培养液中，37℃，250rpm，过夜。IPTG诱导产物形成。测定耐热植酸酶的生物活性，反应的温度范围为25-95℃，在这个反应温度范围内耐热植酸酶都具有生物活性，最适反应温度为65℃，见图5。
实施例4作物的培养将表面灭菌的种子置于固体培养基上，培养4天。将无菌的玉米幼苗转移到无菌试管中，试管底部加入无菌培养液(培养液配方Ca(No3)20.88g，NaH2PO40.006g，K2SO40.39g，MgSO40.31g，FeEDTA 0.0031g，微量元素溶液1ml，植酸钠1.25mM，pH6.5)。
各试管中加入SDLiuTP01菌的粗提液20μl，以植酸酶液为对照。不加粗提液，加20μl无离子水的试管为空白对照。将上述试管培养15天。收获植物体，测定植物生长参数。
在含有植酸的磷胁迫培养液中加入20μl SDLiuTP01菌粗提液条件下，根部以上植物体重201mg，根重173mg，根长238mm；在含有植酸的磷胁迫培养液中加入植酸酶的条件下，根部以上植物体重187mg，根重181mg，根长243mm；在含有植酸的磷胁迫培养液中加入无离子水条件下，根部以上植物体重111mg，根重103mg，根长173mm。
实验结果表明，在含植酸的培养液中生长的玉米幼苗在磷胁迫条件下，当加入SDLiuTP01粗提液后，与未加入SDLiuTP01粗提液的对照组比较，植物的生长受到促进。
权利要求
1.一种耐热植酸酶基因，其特征是耐热植酸酶基因全长1152核苷酸，该基因编码383个氨基酸，N端的26个氨基酸为信号肽，信号肽的切割位点在+26位的丙氨酸之后，其基因的DNA序列为S1，由DNA序列推导出氨基酸序列为S2S1NewSequence SequenceATGAATCATT CAAAAACACT TTTGTTAACC GCGGCAGCCG GATTGATGCT 50CACATGCGGT GCGGTTTCTT CCCAGGCCAA GCATAAGCTG TCTGATCCTT100ATCACTTTAC CGTGAATGCG GCGGCGGAAA CGGAGCCGGT TGATACAGCC150GGTGATGCAG CTGATGATCC TGCGATTTGG CTGGACCCCA AGAATCCTCA200GAACAGCAAA TTGATCACAA CCAATAAAAA ATCAGGCTTA GTCGTGTACA250GCCTAGAGGG AAAGACGCTT CATTCCTATC ATACCGGGAA GCTGAACAAT300GTTGATATCC GCTATGATTT TCCGTTGAAC GGAAAAAAAG TCGATATTGC350GGCGGCATCC AATCGGTCTG AAGGAAAGAA TACCATTGAG ATTTACGCCA400TTGACGGGAA AAACGGCACA TTACAAAGCA TTACAGATCC AGACCGCCCG450ATTGCATCAG CAATTGATGA AGTATACGGT TTCAGCTTGT ACCACAGTCA500AAAAACAGGA AAATATTACG CGATGGTGAC AGGGAAAGAA GGCGAATTTG550AACAATACGA ATTAAATGCG GATAAAAATG GATACATATC CGGCAAAAAG600GTAAGGGCGT TTAAAATGAA TTCTCAGACA GAAGGGATGG CAGCAGACGA650TGAATACGGC AGTCTTTATA TCGCAGAAGA AGATGAGGCC ATCTGGAAGT700TCAGCGCTGA GCCGGACGGC GGCAGTAACG GAACGGTTAT CGATCGTGCC750GACGGCAGGC ATTTAACCCC TGATATTGAA GGACTGACGA TTTACTACGC800TGCTGACGGG AAAGGTTATC TGCTTGCATC AAGCCAGGGT AACAGCAGCT850ACGCGATTTA TGAAAGACAG GGACAGAACA AATATGTTGC GGACTTTCAG900ATAACAGACG GGCCTGAAAC AGACGGCACA AGCGATACAG ACGGAATTGA950CGTTCTGGGT TTCGGGCTGG GGCCTGAATA TCCGTTCGGC CTTTTTGTCG 1000CACAGGATGG AGAAAATATA GATCACGGCC AAAAAGTGAA TCAAAATTTT 1050AAAATGGTGC CTTGGGAAAG AATCGCCGAT AAAATCGGCT TTCACCCGCA 1100GGTCAATAAA CAGGTCGACC CGAGAAAACT GACCGACAGA AGCGGAAAAT 1150AAACATGCAA AAAGCAGCTT ATACAAGCTG CTTTTTGCAT GTGAAGAACG1200S2NewSequence SequenceMNHSKTLLLT AAAGLMLTCG AVSSQAKHKL SDPYHFTVNA AAETEPVDTA 50GDAADDPAIW LDPKNPQNDK LITTNKKSGL VVYSLEGKTL HSYHTGKLNN 100VDIRYDFPLN GKKVDIAAAS NRSEGKNTIE IYAIDGKNGT LQSITDPDRP 150IASAIDEVYG FSLYHSQKTG KYYAMVTGKE GEFEQYELNA DKNGYISGKK 200VRAFKMNSQT EGMAADDEYG SLYIAEEDEA IWKFSAEPDG GSNGTVIDRA 250DGRHLTPDIE GLTIYYAADG KGYLLASSQG NSSYAIYERQ GQNKYVADFQ 300ITDGPETDGT SDTDGIDVLG FGLGPEYPFG LFVAQDGENI DHGQKVNQNF 350KMVPWERIAD KIGFHPQVNK QVDPRKLTDR SGK- 383
2.根据权利要求1所述的耐热植酸酶基因，其特征是所述耐热植酸酶基因构建的基因工程菌株为SDLiuTP01，其微生物分类名为大肠杆菌E.coli。
3.根据权利要求2所述的耐热植酸酶基因，其特征在于该基因的重组表达产物----是在25---95℃温度范围内具有生物活性，最适反应温度为65℃的耐热植酸酶。
4.根据权利要求1-3中任一权利要求所得到的耐热植酸酶，它用于研制植物生长促进剂、堆肥添加剂、生物肥料、生物菌肥、有机肥料、复合肥料，饲料、食品添加剂。
5.一种耐热植酸酶基因的克隆方法，其特征是它包括如下步骤(1)菌株的筛选a)取土样少许，放入无菌水的三角瓶中，摇匀，稀释，涂布于基因供体菌筛选固体培养基上，37℃培养24小时，挑选单个菌落转接基因供体菌筛选培养基上；b)收集各种细菌纯培养菌种，转接基因供体菌筛选培养基斜面培养基上。蒋株菌以相同的方法转接于基因供体菌筛选固体培养基上，37℃培养7天，取出，比较水解圈的情况，挑选形成明显水解圈的菌种，得到SD01N，SD01X，SD01B，SD01D。(2)设计合成引物P1和P2根据参考资料(《精编分子生物学实验指南》[美]F.奥斯伯等)提供的方法分别提取SD01N，SD01X，SD01B，SD01D菌株的总DNA，设计合成引物P1和P2P15’CTG CAG GAT CCATGAATC ATT CAAAAA CAC TTT TGT 3’1P25’TTT AAG CTT CGT TCT TCA CAT GCAAAAAGC 3’(3)克隆耐热植酸酶基因分别以SD01N，SD01X，SD01B，SD01D菌株的基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应参数为94℃ 1分钟，50℃ 1分钟，72℃2分钟，30个循环，72℃ 10分钟，由SD01N菌株的基因组DNA扩增出约1.2Kb的DNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳，回收DNA片段，经酶切后连接于载体pMD18-T上，得到pMD18-TP，转化E.coli Competent CellJM109，筛选阳性克隆，进行DNA全序列测定分析，序列测定结果为S1，耐热植酸酶基因全长1152个核苷酸，编码383个氨基酸，其氨基酸序列为S2；N-端26个氨基酸为信号肽，信号肽的切割位点在+26位的Ala之后。
6.一种耐热植酸酶基因的工程菌株制备方法，其特征是它包括如下步骤(1)将耐热植酸酶基因从pMD18-TP上切下，再连接于表达载体的pQE30上形成重组DNA即pQE30-P；(2)挑取E.Coli M15单菌落接种于LB(Km50μg/mlAp100μg/ml)培养基中，LB培养基1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，PH7；250rpm，37℃，摇床培养3小时，冰浴10分钟，转入预冷离心管中，冷冻离心，收集沉淀，用CaCl2溶液洗沉淀，并且重悬于CaCl2溶液中，冰浴30分钟，加入pQE30-P，冰浴30分钟，42℃水浴1分30秒，冰浴2分钟，添加新鲜LB培养液，37℃ 250rpm培养1小时，培养物涂于LB平板培养基上，放入37℃温箱培养过夜；(3)挑选克隆子，以PCR的方法筛选阳性克隆子，将阳性克隆子转接LB斜面培养基；由此，筛选出耐热植酸酶基因工程菌株SDLiuTP01。
全文摘要
本发明公开了一种耐热植酸酶及其基因的克隆和表达。解决了现有植酸酶耐温性较差及营养无利用流失和必须营养的“添加浪费”等问题。技术方案筛选耐热性植酸酶天然菌株，利用分子生物学的手段，将编码此产物的基因进行基因克隆；该基因全长1152核苷酸，编码383个氨基酸；N端的26个氨基酸为信号肽，信号肽的切割位点在+26位的丙氨酸之后；构建耐热植酸酶基因的工程菌株SDLiuTP01，表达基因产物。本发明的耐热植酸酶在较宽温度范围内具有生物活性、能促进植物生长、增加土壤肥力、不破坏农作物品质；降解食品和饲料中的不溶性磷、提高磷的利用、减少有机磷对环境的污染。
文档编号C12N15/55GK1552872SQ0312998
公开日2004年12月8日 申请日期2003年6月3日 优先权日2003年6月3日
发明者刘丽丽, 陈立新, 杨文博 申请人:天津师范大学, 天津市农业生物技术研究中心