专利名称：一种酿酒酵母Rav1p基因的克隆与表达方法
技术领域：
本发明涉及酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中Ravlp基因的克隆与表达，属于微生物基因工程领域。
背景技术：
V-ATP酶通过水解ATP产生的能量将H+从细胞质泵到胞外或者从细胞质泵到一些膜包围细胞器腔内，来维持细胞质的中性pH、囊腔内的酸性pH和胞外的酸性pH。同时也为某些特殊的生化反应提供特殊的PH环境。以酿酒母为例，V-ATP酶由两大结构复合体V1和V0构成。V1暴露在膜表面，是水溶性的呈球状，属于催化ATP水解产生质子的区域，由A、B、C、D、E、F、G和H八种亚基组成'N0包埋于膜内，呈柄状，属于传递质子的区域，由a、c、c’、c”、d和e六种亚基组成。研究表明V-ATP酶在受体介导的内吞作用、分泌蛋白的储存、蛋白降解、细胞内的膜运输、某些细胞器的膜融合、Na+的吸收、肾酸化、男性精子的成熟、破骨细胞的骨重吸收等生理过程中起到了重要的作用。同时许多人类疾病如骨症、肾小管性酸中毒和肿瘤转移等都与V-ATP酶的生理功能有着重要关系。V-ATP酶的调节机制主要包括三种途径=V1和Vtl的可逆分解；V_ATP酶的选择性定位；改变ATP水解与质子转移之间偶联效率。V1从脂双层中的Vtl上的可逆脱落是V-ATP酶重要的调节机制。这种调节机制在酵母细胞和一些昆虫的中肠细胞中比较常见。单独的V1不能水解ATP，单独的Vtl不能旋转转移质子。这种调节机制在葡萄糖水平降低时产生，是对葡萄糖水平降低的一种节能反应。当细胞中葡萄糖水平降低时，V1从Vtl上脱落下来，当细胞中葡萄糖水平回升时，V1又重新与Vtl结合形成有活性的V-ATP酶而不需要重新合成各个小亚基组装成V-ATP酶。这种调控作用是通过Ravlp、Rav2p、Skplp所构成的RAVE复合物与'的可逆相互作用来完成的。在杀灭食品饮料中酿酒酵母细胞的食品加工过程中，如果是利用高压二氧化碳杀灭酿酒酵母活细胞，酿酒酵母的V-ATP酶的活性越高，其二氧化碳耐受性就越高，越难被 杀死。如果将酿酒酵母的Ravlp敲除使其V-ATP酶的活性降低，就可以构建高压二氧化碳敏感性菌株。
发明内容
本发明提供一种酿酒酵母Ravlp亚基的基因克隆与表达。针对酿酒酵母中RAVE复合物的最大亚基Ravlp亚基的基因(4074bp)设计了引物1:5’ -ACCG￡MII￡ATGTCATTGAACTTTCTTCCAGGACGCC-3’ (EcoR I)引物2:5’ -CTACGCGTCGACTACAAAGTCATCTAGTAAGTTCTTG-3’ (Sal I)，建立了酿酒酵母Ravlp基因的克隆方法、酿酒酵母Ravlp基因原核表达载体的构建方法、Ravlp在大肠杆菌中的高效表达的方法和Ravlp的纯化方法。本发明的技术方案:在GenBank中查找酿酒酵母的Ravlp基因序列，设计出特异性引物，以酿酒酵母基因组DNA为模板克隆出Ravlp基因序列。将PCR产物与表达载体pET28a同时进行双酶切，然后将其连接到表达载体上。经过PCR验证、单酶切验证、双酶切验证、测序验证筛选阳性重组质粒，然后转化到BL21(DE3)表达宿主中，实现Ravlp的原核表达。本发明的有益效果:本发明人的方法，采用酶解法提取酿酒酵母BY4742的基因组DNA,以其为模板克隆出Ravlp基因的全序列，并在两端加上了 EcoR I和Sal I限制性内切酶的识别位点，与经同样内切酶处理的pET28a表达质粒相连并转化大肠杆菌BL21 (DE3)表达宿主，从而实现在大肠杆菌中的表达。利用本发明人构建的重组表达质粒可以进一步实现Ravlp在酿酒酵母细胞的基因敲除，从而可以构建高压二氧化碳敏感型的酿酒酵母菌株，此酿酒酵母菌株将在食品饮料发酵后，用高压二氧化碳灭活，既达到了除菌的目的，又不会影响食品饮料的风味物质。
四
图1.表达质粒pET28a的不意图。图2.重组表达质粒pET_28a_Ravl的示意图。图3.pET28a_Ravl重组质粒的双酶切以及PCR鉴定。1，2:PCR鉴定结果；3 =EcoRI 和 Sal I 酶切重组质粒；M1:Ikb DNA Ladder Marker。图4.pET28a-Ravl重组质粒的单酶切鉴定。4 =EcoR I酶切重组质粒；5 =Xho I酶切重组质粒；M2:lkb DNA Marker P。图5.Ravlp诱导表达纯化后的SDS-PAGE电泳图。M:蛋白质分子量标准；1:40mmol/L咪唑的洗脱 蛋白样品；2，3:60mmol/L咪唑的洗脱蛋白样品；4，5:150mmol/L咪唑的洗脱蛋白样品；6:300mmol/L咪唑的洗脱蛋白样品；7，8:500mmol/L咪唑的洗脱蛋白样品。
权利要求
1.一种酿酒酵母中Ravlp的基因的克隆方法。其特征是:针对酿酒酵母中RAVE复合物中的Ravlp亚基的基因，设计了引物引物 1:5’ ACCGeMII￡ATGTCATTGAACTTTCTTCCAGGACGCC-3’ (EcoR I)引物 2:5’ -CTACGCGTCGACTACAAAGTCATCTAGTAAGTTCTTG-3’ (Sal I)， 以提取的基因组DNA为模板，用引物I和引物2扩增出长4074bp的目的基因，然后连接到表达载体pET28a上，从而构建Ravlp基因的重组原核表达载体。具体操作方法见实例1
2.一种酿酒酵母Ravlp在大肠杆菌中的表达方法，其特征是:以权利要求1所述的表达载体，转化到大肠杆菌BL21(DE3)表达宿主中，用IPTG进行诱导表达，实现Ravlp的高效表达。具体操作见实例2。
3.一种纯化含HisTag标签的Ravlp的方法，其特征是:用权利2所述的经诱导表达的菌体，用超声破碎仪破碎细胞，高速离心后取上清用0.45 ii m的滤膜过滤，然后用His TrapHP Iml亲和层析柱,利用GEHealthcare公司的蛋白纯化仪AKTAavant纯化Ravlp。具体操作方法 见实例3。
全文摘要
一种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中Rav1p基因的克隆与表达方法，本发明设计了一对特异性引物，引物15’-ACCGGAATTCATGTCATTGAACTTTCTTCCAGGACGCC-3’(EcoR I)引物25’-CTACGCGTCGACTACAAAGTCATCTAGTAAGTTCTTG-3’(Sal I)，构建了酿酒酵母Rav1p的克隆方法和高效表达方法。RAVE复合物是调节酿酒酵母V-ATP酶活性的蛋白复合体，而Rav1p是RAVE复合物中分子量最大的一个亚基，利用本发明人构建的重组质粒可以实现Rav1p在酿酒酵母细胞内的基因敲除，从而构建高压二氧化碳敏感型酿酒酵母菌株。在食品饮料发酵后，可用高压二氧化碳灭活此酵母菌，既达到了除菌的目的，又不会影响食品的风味。
文档编号C12R1/865GK103160517SQ20111042276
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月16日 优先权日2011年12月16日
发明者张震宇, 徐灿 申请人:江南大学