专利名称：日本血吸虫sdisp基因及其克隆、表达和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因领域，具体涉及日本血吸虫中国大陆株SDISP基因的基因序列及其克隆表达方法和应用。
背景技术：
血吸虫病是一种分布广乏，危害严重的人畜共患寄生虫病。抗血吸虫病疫苗研究是当今血吸虫病防治研究的热点之一。
日本血吸虫未成熟卵可溶性抗原(SIEA)具有明显的抗虫卵胚胎发育、抗雌虫生殖产卵的作用，我们从SIEA中分离出SIEA26-28kDa天然分子抗原，并证明它是诱导宿主产生抗血吸虫病保护性免疫力的主要组分。1999-2000年，卫生部专家组织进行了全国血吸虫疫苗免疫保护统一检测实验，该亚单位分子疫苗(1号疫苗)获得了最佳的动物保护效果53.9％减雌雄合抱率和89.3％肝脏减卵率。随后，我们采用蛋白质组学研究技术，首次建立了SIEA-二维电泳图谱，通过SIEA26-28kDa抗血清免疫识别、肽指纹图谱、质谱分析，获得了3个同源性较高、免疫原性较强的蛋白质斑点(SIEA-2D66，71，73)；分别与日本血吸虫次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT)，琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白(SDISP)，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)相匹配，其中SDISP的同源性较高。有资料证明，SDISP与细胞的核苷酸代谢、血吸虫的生长发育、生理代谢密切相关。以上研究结果表明SDISP可以作为抗日本血吸虫病天然分子基因苗研究的靶标。
我们在结合先前研究的基础上，对编码SIEA26-28kDa分子抗原相关的SDISP基因片段进行全长克隆、表达和保护性免疫效果的研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于
公开日本血吸虫中国大陆株SjSDISP的基因序列。
本发明公开的日本血吸虫中国大陆株SjSDISP的基因具有序列1所示的核苷酸和序列2的氨基酸。序列1的第106个至第939个核苷酸区域为序列2的编码区。
本发明根据基因库中SjSDISP对应的EST(BU804141)以及日本血吸虫成虫cDNA文库载体λgt11多克隆位点邻近核苷酸序列设计引物，以日本血吸虫成虫cDNA文库为模板，采用锚式PCR对SjSDISP基因不完整的3’端和5’端进行扩增、测序，用电子软件进接全长cDNA，DNA序列分析表明该基因的开放阅读框含837bp，编码278个氨基酸，其密码子符合Kozak序列特征。该基因全长序列如下GGTCAGTAAATTTCATTTCATACCTCACAGATTTTCAGTTCGACATCACAGTATTTGTGCGTGTTTAATACCTCGAGAGACAAACCACCTTTATTGAAGTTCAGAATGCTGAAGTCTCTATCTACTTTGCAGTCAGCATCCTTCAAACTTGTTCGTTATGTTTCAACTGCATCAGAGTTAGCACCACGTATTAAAACGTTTTCAATCTACAGATGGAACCCAGACAAACCTGGCGAGAAACCTAGTATGCAGAATTATCAAGTTGACCTCAACGACTGTGGCCCTATGGTCTTGGATGCTCTAATTAAGATAAAAAATGAACAAGACTCCACTTTGACATTTCGACGTTCTTGTCGTGAGGGGATTTGCGGTTCTTGTGCAATGAATATAGGAGGCCGTAATCATCTTGCTTGCATATGGGAAATCGATCAAGATGTTAGCAAACCGACTAAAATATATCCATTACCGCACATGTATGTTATTAAGGATCTAATTCCTGATATGAACAATTTCTATGCTCAATACCGTTTTATTGAGCCTTATTTAAAGAAAAAGAATGTAACTGAAGAAGATATTGGGAAGAAGACTTATTATCAGTCAGTGGAAGACAGAGCAAAACTAGATGGGTTATACGAGTGCATTCTGTGTGCCTGCTGCTCTACTTCATGTCCATCTTATTGGTGGAATGGTGATAAATATTTAGGTCCTGCAGTCCTCCTCCAGGCTTATAGATGGCTAGTTGATTCTCGTGATGACTACACATACGAGCGTCTGTCTGAATTCCAGAACAAATGGTCACTTTATCGATGTCATACTATTATGAACTGCACAGAAACGTGTCCAAAAGGACTGAATCCTGGTTTGGCCATTGGAGAAATTAAGAAAATGTTAATCTATTTTAATCAGTACAAGGACAAAAAGCCGGAGACAAGAACTGTCTGAACTGTGTGACTGTTTCGTCCACATATTCGTCCGAATTTGGATAACTTTTTATTGATTGTTTATAGTGAATTCAGCCATATCTTCTACTTTTTGATTTAACTTATATAAATTCATAGTCAAAAAAAAAAA本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述日本血吸虫中国大陆株SjSDISP基因在大肠杆菌中的表达及重组蛋白纯化的方法。
本发明公开的表达方法为
(1)jSDISP基因PCR扩增上游引物为5’GCGGATCCATGCTGAAGTCTCTATCTAC3’下游引物为5’ACGTCGACTCAGTCAGTTCTTGTCTCCG3’(2)重组表达质粒SjSDISP/pGEX-4T-1的构建(3)转化大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达(4)表达产物经SDS-PAGE凝胶电泳、切胶电洗脱及超滤浓缩回收进行回收表达产物经SDS-PAGE电泳分析显示重组蛋白在大肠杆菌BL21中获得准确、高效表达。经SDS-PAGE鉴定，该融合表达产物分子量约为56kDa，Western blot分析表明该重组蛋白能被日本血吸虫成虫抗原免疫血清特异识别，而载体表达蛋白不与抗体反应，表明该融合蛋白具有良好的抗原性。切取融合蛋白区带进行电洗脱、超滤浓缩。
本发明所要解决的另一技术问题在于公开上述日本血吸虫中国大陆株SjSDISP基因在制备防治日本血吸虫病重组疫苗中的应用。
用SDISP基因原核重组蛋白免疫5-6周龄的昆明系小鼠，每次每只小鼠后腿肌肉注射重组质粒100μg。隔2周免疫1次，共3次。末次免疫后第3周以日本血吸虫尾蚴进行攻击感染，攻击后第45天处死小鼠，心脏灌注法收集成虫，肝脏用10％NaOH消化后计算每克肝组织虫荷数(EPG)。结果发现原核重组蛋白免疫小鼠获得了22.8％的减虫率和38.4％的减卵率。
以下结合实施例对本发明作进一步描述。
图1锚式PCR产物琼脂糖凝胶电泳1.SjSDISP5’端锚式PCR扩增产物；2.SjSDISP3’端锚式PCR扩增产物3.蛋白marker图2原核重组质粒pGEX-4T-1/SDISP双酶切鉴定和PCR验证1.DNA marker；2.重组质粒pGEX-4T-1/SDISP的PCR扩增产物；3.重组质粒pGEX-4T-1/SDISP用BamH1和Sal1进行双酶切4.pGEX-4T-1质粒用BamH1和Sal1进行双酶切5.pGEX-4T-1质粒；6.DNA marker
图3pGEX4T-1/SjSDISP原核表达及其纯化产物的SDS-PAGE分析1.纯化后的GST-SjSDISP融合蛋白；2.pGEX4T-1/SjSDISP经IPTG诱导产物；3.蛋白Marker图4Western-blot分析SjSDISP表达产物的免疫活性1.蛋白Marker；2，3.pGEX-4T-1/SjSDISP在大肠杆菌BL21中的表达产物具体实施方式
实施例1日本血吸虫中国大陆株SDISP全长基因的克隆1.试验材料1.1质粒与受体菌质粒pGEX-4T-1和大肠杆菌BL21、Y1090为本室保存，日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库由南京医科大学陈淑贞教授提供。
1.2工具酶与试剂ExTaqDNA聚合酶、限制性核酸内切酶BamH1和Sal1、质粒提取试剂盒及DNA marker均为大连TaKaRa公司产品；Protein marker为Fermentas公司产品；T4DNA连接酶为上海生工生物工程公司产品；1.3引物的设计与合成根据文库载体多克隆插入位点上下游邻近区核苷酸序列设计上下游引物P1、P2；根据序列号为BU804141的EST5’端和3’端核苷酸序列设计特异引物分别为S1、S2；以上引物由大连TaKaRa公司合成。
P15’GGTGGCGACGACTCCTGGAGCCCG3’P25’TTGACACCAGGCCAACTGGTAATG3’S15’AGGGCCACAGTCGTTGAGGTCAAC3’S25’CGTCCACATATTCGTCCGAATTTG3’S35’GCGGATCCATGCTGAAGTCTCTATCTAC3’S45’ACGTCGACTCAGTCAGTTCTTGTCTCCG3’2.试验方法2.1模板准备将适量日本血吸虫中国大陆株成虫cDNA文库包装液与适量过夜培养的大肠杆菌Y1090中，放置37℃预吸附20min，然后加入含有MgSO4、氨苄青霉素、麦芽糖的55℃平衡的顶层琼脂中，快速混均后倒入直径为8cm的LB琼脂培养皿中，42℃培养4h后每皿加3mlSM液放4℃轻摇过夜。收集上清，5000rpm室温离心5min，取上清加入20％PEG，混均室温放置30min后12000g室温离心15min，弃上清，沉淀中加入100μl双蒸水，沸水浴5min，使噬菌体DNA变性，-20℃保存备用。
2.2锚式PCR扩增基因不完整的5’端和3’末端(1)SjSDISP5’端锚式PCR扩增，PCR反应体系(100μl)。PCR条件为96℃预变性3min，94℃变性40S，56℃退火20S，72℃延伸40S，共35个循环；10×ExTaq buffer10μl10mMdNTP2μl引物P1 2μl引物S1 2μl文库模板6μlExTaq酶 1μl25mMgCl 10μl双蒸水 67μl(2)SjSDISP3’末端锚式PCR扩增，PCR反应体系(100μl)。PCR条件为96℃预变性3min，94℃变性1min，61℃退火1min，72℃延伸2min，共35个循环。
10×ExTaq buffer10μl10mMdNTP2μl引物S2 2μl引物P2 2μl文库模板6μlExTaq酶 1μl25mMgCl 10μl双蒸水 67μl
PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定分子量大小，根据同源基因估计，对符合目的条带大小的片段进行回收，对回收产物1∶100稀释后用作模板再进行PCR扩增、回收后进行DNA测序。
2.3全长编码基因的克隆与鉴定根据全长序列编码阅读框起始密码子和终止密码子附近的核苷酸序列再设一对引物S3和S4为引物，以cDNA文库为模板进行全长编码基因的PCR扩增，用BamH1和Sal1同时双酶切目的片段及原核表达质粒，用凝胶回收试剂盒对双酶切产物进行回收后，将已双酶切的目的片段与质粒在T4 DNA连接酶作用下16℃连接16h，然后转化感受态大肠BL21，转化产物涂布于含氨苄青霉素的LB琼脂平皿，37℃培养过夜，挑取菌落接种至含氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃摇床培养过夜，抽提质粒，双酶切鉴定和测序。
3结果3.1SjSDISP 5’端和3’末端锚式PCR扩增以成虫cDNA文库为模板，分别以P1/S1和S2/P2为引物进行锚式PCR，扩增SjSDISP5’端和3’末端，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，5’锚式PCR获得一条约350bp的条带(图1)，回收该条带送大连TaKaRa公司进行测序，得一个335bp的序列，有效长度为284bp。该序列3’末端与原琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白EST(BU804141)5’端有24bp碱基重叠，表明是所要的目的片断；EST(BU804141)3’端锚式PCR获得一条约150bp的条带(图1)，回收该条带送大连TaKaRa公司进行测序，得一个143bp的序列，有效长度为114bp。该序列5’末端与原琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白EST(BU804141)3’端有27bp碱基重叠，表明是所要的目的片断。三者连接后得到一个1071bp的总序列。该序列的开放阅读框为837bp，编码278个氨基酸，起始密码子符合Kozak序列特征，起始密码子前有105bp；终止密码子后有129bp，终止密码子后还有一强终止子TGA。
3.2全长编码基因的克隆、重组子构建与鉴定根据全长ORF设计一对内含BamaH1和Sal1酶切位点的引物S3和S4，以成虫cDNA文库为模板进行PCR扩增，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，可见一条约850bp大小的DNA条带，与预期大小一致(图2)。插入SjSDISP全长编码基因的质粒表达载体pGEX-4T-1/SjSDISP，经BamaH1、Sal1双酶切和PCR鉴定，证明原核表达质粒构建成功。原核表达载体pGEX-4T-1/SjSDISP质粒测序结果与全长ORF完全一致。SjSDISP基因全长序列已登录GenBank数据库，登录号为AY841892。
实施例2日本血吸虫(中国大陆株)SDISP基因在大肠杆菌中的表达和纯化1.试验材料氨苄青霉素、IPTG、DTT等为Sigma公司产品；硝酸纤维素膜(NC膜)为上海四青生化材料厂产品；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG为晶美公司产品。
2.试验方法2.1目的基因的诱导表达将经双酶切和测序鉴定正确的重组菌接种至含氨苄青霉素的LB液体培养基中，按常规方法诱导表达，37℃摇床培养至A600为0.6，加IPTG至终浓度为1mM，28℃摇床轻摇4-5h，按常规方法提取菌体蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。
2.2基因表达产物的分离与纯化先将经IPTG诱导的重组菌体蛋白用大胶进行SDS-PAGE凝胶电泳，用预冷的0.25M KCl染色10-20min，根据标准蛋白分子带准确切取融合蛋白区带，将胶块切成小块，装入含0.5倍电泳缓冲液的透析袋中，200mA恒流电渗2h，收集透析袋中液体，500rpm离心10min，取上清于0.01M pH7.2透析过夜，超滤浓缩，测定蛋白浓度后-20℃贮存备用。
2.3 Western-blot检测表达产物抗原性为了避免血清中抗大肠杆菌蛋白抗体所引起的假阳性，必须去除这些非特异性抗体，将一抗做如下初步纯化挑取一个以pGEX-4T-1质粒转化的BL21单菌落，接种到含有氨苄青霉素的5ml液体LB中，37℃振摇过夜，将过夜培养的菌液按1∶100接种到含氨苄青霉素的500ml LB液体培养基中，37℃振摇增菌。收集菌液于4000rpm冷冻离心10min，弃上清后加入6ml PBS悬浮沉淀物。将悬浮液置超声粉碎仪中粉碎(功率400，超声4S，间隔3S，循环50次)，制成BL21裂解液。按1ml血清加3ml裂解液混匀，再用4倍PBS稀释，4C吸附过夜。然后12000rpm离心15min，收集上清，-20℃冻存备用。
将高表达融合蛋白进行SDS-PAGE(12％)电泳，然后以100mA电转移2h，将融合蛋白转移到NC膜上，丽春红染色检查转印效果。加入5％脱脂奶粉-PBS-Tween204℃封闭过夜；0.05％PBST洗膜5min×3，PBS洗3-5min，加入吸附后的SIEA26-28kDa免疫兔血清(1∶40)室温孵育2h，0.05％PBST洗膜5min×3，加入二抗HRP-SPA(1∶30)室温孵育2h，0.05％PBST洗膜5min×3，晾干后，DAB底物显色15-30min，水洗终止反应，扫描记录。
3.结果3.1SjSDISP在大肠杆菌中表达和表达产物的纯化用终浓度为1mM IPTG诱导SjSDISP在大肠杆菌中获得表达，并用SDS-PAGE对不同表达时相进行结果分析，发现该融合蛋白表达产物分子量大小约为56kDa，与推测的大小相符(图3)，4-5h表达达高峰。表达蛋白经SDS-PAGE凝胶电泳、0.25M KCl染色、切胶、电渗和超滤等处理，最后得到单一蛋白条带(图3)3.2表达产物的抗原性测定将高表达融合蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳，经电转印到硝酸纤维膜上，用经pGEX-4T-1载体转化的大肠杆菌BL21裂解液吸附过的日本血吸虫成虫兔免疫血清作一抗体进行Western-blot，结果在56kDa处有一明显的识别条带(图4)实施例3日本血吸虫SDISP基因原核重组蛋白免疫小鼠的保护性效果观察1试验材料昆明系小鼠，雄性，5-6周龄，由中南大学湘雅医学院动物学部提供。阳性钉螺由江苏省血吸虫病防治研究所提供。
2方法2.1SDISP基因原核重组蛋白的大量制备将重组菌体蛋白(经IPTG诱导)进行多次SDS-PAGE凝胶电泳，用预冷的0.25M KCl染色10-20min，根据标准蛋白分子量和表达产物的考马斯亮蓝染色结果，准确切取融合蛋白区带，将胶块切成小块，置入电洗脱回收装置中进行电洗脱，200mA恒流电渗2h，收集洗脱液，5000rpm离心10min，取上清于0.01M pH7.2透析过夜，超滤浓缩，测定蛋白浓度后-20℃贮存备用。
2.2实验动物分组将实验小鼠随机分为A、B、C三组，A组为注射SDISP基因原核重组蛋白组，B组为佐剂免疫组，C组为注射PBS组，各组分别为10、10、9只昆明系小鼠。
2.3免疫途径和方法按常规免疫方法进行，分别于免疫前一天进行预处理，即每只小鼠后腿肌肉注射50μl盐酸布比卡因(0.5mg/ml)，第二天在该部位按分组要求注射原核重组蛋白100μg/100μl或生理盐水100μl。每间隔2周免疫1次，共3次。
2.4免疫小鼠攻击感染实验及保护性效果评价末次免疫后第3周，按常规方法经小鼠腹部人工感染40±1条日本血吸虫尾蚴，感染后第45天处死小鼠，采用心脏灌注法收集血吸虫成虫，并计算减虫率。同时，每鼠取1g肝研磨，加10％NaOH于37℃消化过夜，取50μl混悬液涂片镜检全部虫卵数，计算每克肝虫卵数(EPG)。运用SPSS统计软计进行单因素方差分析(ANOVA)计算其保护效果，经统计学处理得出P＜0.05，表示有显著性差异。减虫率和减卵率的计算公式如下。
减虫率(％)＝(1-实验组检获成虫均数/对照组检获成虫均数)×100减卵率(％)＝(1-实验组检获肝虫卵均数/对照组检获肝虫卵均数)×100
3.结果表1.SDISP基因原核重组蛋白免疫小鼠的减虫率
rSjSDISP是以GST融合蛋白的形式表达表2.SDISP基因原核重组蛋白免疫小鼠的减卵率
权利要求
1.一种编码日本血吸虫中国大陆株SDISP基因的核苷酸序列，其特征在于它具有如下核苷酸序列ggtcagtaaa tttcatttca tacctcacag attttcagtt cgacatcaca gtatttgtgc 60gtgtttaata cctcgagaga caaaccacct ttattgaagt tcagaatgct gaagtctcta120tctactttgc agtcagcatc cttcaaactt gttcgttatg tttcaactgc atcagagtta180gcaccacgta ttaaaacgtt ttcaatctac agatggaacc cagacaaacc tggcgagaaa240cctagtatgc agaattatca agttgacctc aacgactgtg gccctatggt cttggatgct300ctaattaaga taaaaaatga acaagactcc actttgacat ttcgacgttc ttgtcgtgag360gggatttgcg gttcttgtgc aatgaatata ggaggccgta atcatcttgc ttgcatatgg420gaaatcgatc aagatgttag caaaccgact aaaatatatc cattaccgca catgtatgtt480attaaggatc taattcctga tatgaacaat ttctatgctc aataccgttt tattgagcct540tatttaaaga aaaagaatgt aactgaagaa gatattggga agaagactta ttatcagtca600gtggaagaca gagcaaaact agatgggtta tacgagtgca ttctgtgtgc ctgctgctct660acttcatgtc catcttattg gtggaatggt gataaatatt taggtcctgc agtcctcctc720caggcttata gatggctagt tgattctcgt gatgactaca catacgagcg tctgtctgaa780ttccagaaca aatggtcact ttatcgatgt catactatta tgaactgcac agaaacgtgt840ccaaaaggac tgaatcctgg tttggccatt ggagaaatta agaaaatgtt aatctatttt900aatcagtaca aggacaaaaa gccggagaca agaactgtct gaactgtgtg actgtttcgt960ccacatattc gtccgaattt ggataacttt ttattgattg tttatagtga attcagccat 1020atcttctact ttttgattta acttatataa attcatagtc aaaaaaaaaa a1071。
2.一种如权利要求1所述的日本血吸虫中国大陆株HGPRT基因全长序列的克隆方法，其特征在于以日本血吸虫成虫cDNA文库为模板，采用锚式PCR对SjSDISP基因不完整的3’端和5’端进行扩增、测序，用电子软件进接得到全长序列。
3.一种如权利要求1所述的日本血吸虫中国大陆株SDISP基因的核苷酸编码序列在原核生物中的表达方法，其特征在于所使用的宿主菌为大肠杆菌BL21，原核表达质粒为pGEX-4T-1。
4.一种防治日本血吸虫病的重组疫苗，其特征在于它是由重组质粒pGEX-4T-1/SjSDISP转化大肠杆菌BL21，用IPTG诱导表达，再经SDS-PAGE凝胶电泳、切胶、电洗脱及超滤浓缩回收得到的重组蛋白产物。
全文摘要
本发明具体涉及日本血吸虫中国大陆株SDISP基因的基因序列及其克隆表达方法和应用。根据基因库中该基因对应的EST及日本血吸虫成虫cDNA文库载体λgt11多克隆位点邻近核苷酸序列设计引物，以成虫cDNA文库为模板，采用锚式PCR对SjSDISP基因不完整的3’端和5’端进行扩增、测序，用电子软件拼接全长序列。该基因的开放阅读框含834bp，编码278个氨基酸。将该基因亚克隆入原核表达载体pGEX－4T－1中，构建成重组质粒pGEX－4T－1/SjSDISP，转化大肠杆菌BL21后用IPTG诱导表达，以纯化的重组蛋白免疫昆明系小鼠，获得22.8％的减虫率和38.4％的减卵率。
文档编号C12N15/10GK1962868SQ20051003234
公开日2007年5月16日 申请日期2005年11月8日 优先权日2005年11月8日
发明者汪世平, 余俊龙, 周松华, 何卓, 吕志跃, 徐绍锐 申请人:余俊龙, 汪世平