专利名称：一种猪链球菌2型免疫保护性抗原的制作方法
技术领域：
本发明涉及家畜传染病中疫苗制备技术领域。具体涉及一种猪链球菌2型保护性抗原制备。针对猪链 球菌2型的防制，本发明设计了编码一种新保护性抗原蛋白基因的克隆、表达及功能验证和应用。所述的 基因表达的抗原蛋白能够提高猪抵抗猪链球菌2型的能力。
背景技术：
猪链球菌(Sfrepfococcussu('s, S. su,'s)是引起猪链球菌病的主要病原，依据细菌表面 的荚膜多糖(CPS)可以将S. su/'s分为35个血清型，分别为1/2型和1 34型，但最近也有 人提出32型和34型应该归于streptococcus orisra忖i,而不应该归于猪链球菌，其中猪链球 菌2型是毒力最强、其中猪链球菌2型(SS2)致病性强、流行广，该型亦是临床分离频率 最高的血清型。SS2是一种重要的人畜共患病病原体，能引起猪脑膜炎(meningitis)、心内 膜炎(endocarditi)、败血症(septicemia)、关节炎(arthritis)、浆膜炎(polyserositis)、 肺炎(pneumonia)等，常引起断奶仔猪或育肥猪突然死亡；人类感染该菌，可导致脑膜炎， 引发永久性耳聋、败血症、心内膜炎，甚至死亡。1991年首次报道在广东省发现猪2型链 球菌疑似病例，1998 - 1999年江苏省部分地区连续2年在盛夏季节暴发该病。目前己有足 够的流行病学资料证实，SS2已经对我国的养殖业和人民健康构成了严重的威胁。
由于缺乏猪链球菌病的流行病学资料，致病机理不清，无有效的疫苗和敏感的诊断方法， 在很多国家猪链球菌病一直未能得到有效地控制。
尽管对猪链球菌2型的致病机理目前仍处在研究和发现阶段，影响了猪链球菌2型疫苗 研究的顺利进行，但该疫苗的研究仍取得了一定的进展。目前研究的猪链球菌2型疫苗主要 有灭活疫苗、活疫苗、基因工程活载体疫苗和亚单位苗，但在实际应用中各有不足之处。灭 活疫苗对同源的猪链球菌具有较好的免疫保护，但由于不同菌株的毒力基因表性存在较大差 异，对于异源菌株的保护力不佳；活疫苗可使猪得到保护,但不能清除定居在扁桃体或关节里 的2型猪链球菌,也不能清除隐性感染猪扁桃体内的细菌；活载体疫苗主要是当今与未来疫苗 研制与开发的主要方向之一，疫苗兼有常规活菌苗和灭活菌苗的优点，但是按照美国食品与 药物管理局(Food and drug administ ration , FDA)的规定,活疫苗中不能存在抗药质粒, 并且在人和动物体内,无法用抗生素来维持重组质粒的稳定性；亚单位苗具有活菌苗的免疫效 力高、及灭活菌苗的安全性好等优点，但是,亚单位苗的抗原成分单一,对其他血清型的保护作 用有限。
鉴于此，本发明着手于猪链球菌2型新型免疫保护性抗原的研究，寻找免疫保护效果好， 并且在猪链球菌2型以外的其它猪链球菌血清型中广泛存在的免疫原性蛋白，进而组合成有 效的猪链球菌疫苗。
发明内容
本发明的第一个目的是获得一株能够分泌猪链球菌2型免疫保护性抗原蛋白的重组大肠 杆菌，利用该重组大肠杆菌获得免疫原性更好的保护性抗原蛋白，利用该保护性抗原蛋白制备一种适用于预防或/和防治猪链球菌2型的亚单位疫苗。
本发明的第2个目的在于将所制备的重组大肠杆菌在制备猪链球菌2型亚单位疫苗中的 应用。
为了实现本发明的目的，申请人通过制备，获得一株能够分泌猪链球菌2型免疫保护性
抗原(基因登录号见附图1)的重组大肠杆菌6Esc/ eric力ia BL21/pET-28a-0197，
该菌株已于2008年10月9日送交湖北省武汉市武汉大学内的保藏在中国典型培养物保藏中
心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO: M208146 。
在本发明的实施例中，申请人提供了这种新的猪链球菌2型免疫保护性抗原0197的详细 制备方法，并描述了该保护性抗原蛋白的可能应用的前景。
更详细的技术方案如《具体实施方式
》所述。
图1:本发明使用的抗原基因序列的登录号及其在链球菌98HAH33中所处的位置(括号内显
示为有下划线的为所述的三个抗原基因序列在Genebank的登录号，其后的冒号后的数字
为该登录号所示基因序列在链球菌98HAH33基因组中的位置，该位置后显示的加粗斜体字
为所述的链球菌的菌株号)。
图2:是本发明使用的pET-28a ( + )载体图谱；
图3:是本发明的重组抗原蛋白0197基因PCR (1)及重组质粒双酶切鉴定图(2); 图4:是本发明重组抗原蛋白0197纯化后SDS-PAGE及Western Blot图； 图5:是本发明重组抗原蛋白0197免疫小鼠后的所诱导诱导很高的抗体水平； 图6:是本发明重组抗原蛋白0197免疫小鼠后的所诱导诱导抗体IgG亚类测定； 图7:是本发明重组抗原蛋白0197免疫小鼠后的攻毒(5LD5。)保护力效果显示； 图8:是本发明重组抗原蛋白0197免疫小鼠后的攻毒(20LD5。)保护力效果显示。
具体实施例方式
实施例l:猪链球菌2型重组抗原蛋白0197的克隆及表达
一材料
1) 质粒与菌株
本发明采用的pET-28a(+)质粒(购自Noagen公司)，大肠埃希氏菌BL21 (DE3)感受
态购自中国湖北省武汉生命技术有限公司。该pET-28a(+)质粒图谱如图2所示。
本发明所用菌株为猪链球菌2型CVCC606菌株购自中国北京中国兽医药品监察所，属于 一个商业菌株。
2) 猪链球菌2型抗原基因参见说明书附图1所述。
3) 主要试剂及缓冲液(Buffer)
氯化钠、EDTA二钠盐、乙醇、甲醇、丽春红S、三氯乙酸(TCA)是上海国药公司产品； Tris碱(Tris-HCI)、 二硫苏糖醇(DTT)、甘油、十二烷基磺酸钠(SDS)、丙烯酰胺、过硫酸铵、 四甲基乙二胺(TEMED)，碳酸钠、乙酸钠(购自上海生工生物工程技术有限公司)。甘氨酸、考马斯亮蓝R-250购自AMRESCO公司。牛血清白蛋白(BSA)、胰酶、蛋白酶抑制剂(PMSF)、 甲醛均为Sigma公司产品。蛋白酶K (贮存液浓度为20mg/ml，使用液浓度为lmg/ml) 购自上海华舜生物工程有限公司；氨苄青霉素(Ampcillin)、卡那霉素(Kanamycin)、胎 牛血清、诱导剂IPTG (异丙基-b-d-硫代半乳糖苷)均为lnvitrogen公司产品；吸头与离心 管是AxyGen公司产品。Taq酶及10xTaq酶Bu行er、 BamH I、 Xhol I等核酸内切酶及相关 Buffer、 T4连接酶及10xT4连接酶Buffer、 Rnase、 UNIQ-10柱式离心式DNA凝胶回收试 剂盒、DNA marker (DL-2000、 DL-15000)均为宝生物(大连)有限公司产品。
辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG 、羊抗猪IgG购自Sigma公司。底物液配制 底物液A: 0. 006%H202缓冲液；底物液B:取Na2HP04M2H2014. 2 g，柠檬酸10. 5g，用双蒸 水定容至500raL配成0. 1磷酸盐柠檬酸缓冲液(pH5. 0),然后加上联苯二胺(TMB)。使用时将 A液和B液等体积混合，混合后5分钟内使用，现配现用。
大肠杆菌培养基LB液体培养液及固体培养基(每升含酵母提取物5g，胰蛋白胨10g， NaCl 10g，用10mol/LNa0H调pH至7.5， 121。C高压灭菌20min， 4'C保存备用。在每100 毫升LB液体培养基中加入1.5g琼脂即为固体LB培养基，12rC高压灭菌20min， 4"C保 存备用)。
链球菌培养基TSB、 TSA培养基、RPMI-1640培养基及弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂均购 自Sigma公司。
纯化三个猪链球菌2型抗原蛋白采用Ni Sepharose 6 Fast Flow纯化柱(GE Healthcare公司产品)。
美国艾克森美孚白油购自东莞市行兴行石化有限公司(埃克森美孚总代理) PBS缓冲液NaC18.0g， KC10.2g， KH2P04 0.24g， Na2HP04X 12H20 3.628g，溶于800ml蒸 馏水中，用盐酸调pH值为7.4，蒸馏水定容至1000ml， 121。C高压灭菌20min，室温保存。 Western-blotting缓冲液
电转缓冲液39mmol/L甘氨酸，48 mmol/LTris碱，0.037% SDS (电泳级)，20%甲醇。
配制lOOOmL转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸，5.8gTris碱，0.37gSDS,加200mL
甲醇，力卩ddH20至总量为1000 mL。
TBS (pH8.0)缓冲液10腿ol/LTris隱HCl， 150 mmol/LNaCl。 TBST缓冲液在上述TBS中加入终浓度为0.05%Tween-20即可。 丽春红S (10x)贮存液2g丽春红S， 30g三氯乙酸，30g磺基水杨酸，加ddH2〇 至100 mL。 质粒抽提相关溶液
溶液l:含0.05mol/L葡萄糖，0.025mol/L Tris HCI (pH8.0), 0.01 mol/L EDTA， 121
'C高压灭菌20min后置室温备用。 溶液ll:含0.2mol/L NaOH， 1%SDS，现配现用。
溶液lll:取5mol/L乙酸钠60mL，冰乙酸11.5mL，水28.5 mL，调pH至5.0。2mol/LNaOH: 8g NaOH力口入100mL ddH20。
10%SDS: 10g SDS加入80mL ddH2〇中，加热搅拌溶解，定容至100mL。
5 mol/L NH4Ac: 327.7g NH4AC加入ddH2〇中溶解，定容至500mL。
10mol/LNH4Ac: 655.4g NH4AC溶于ddH2〇，定容至500mL。
13% PEG8000 (1.6 mol/L NaCI): 13gPEG8000， 9.35g NaCI，溶于ddH2〇，定
lOOmL， 121。C高压灭菌20min。
3mol/LNaAc: 80mL ddH2〇中加入40.81 g醋酸钠，定容至lOOmL， 12rc高压灭菌 20min。
酚:氯仿:异戊醇(体积比为25:24:1):取饱和酚25mL、氯仿24mL、异戊醇lmL，充分混 匀后，用TE (pH8.0)覆盖，于棕色瓶中保存。
氯仿:异戊醇(体积比24:1):取氯仿48 mL、异戊醇2mL，充分混匀后，TE (pH8.0) 覆盖，棕色瓶中保存。
TE溶液1mmol/LEDTA， 10mmol/L Tris-CI pH值为8.0。 引物设计与合成
应用引物设计软件Primer 5.0，设计了用于扩增朋W7W基因的引物对，该引物由上海 生工生物技术有限公司合成。引物序列如下 正向引物为5-GCTGAATTCACGACAGAGACTTCMCA ( EcoRl);
反向引物为5-TAGCTCGAGGCGCTGTTCACCTGT (XhoI)。 试验动物采用7周龄雌性BALB/c小白鼠，购自湖北省疾病预防控制中心。 2、抗原蛋白制备方法
猪链球菌2型(SS2)基因组DNA的提取
1) 猪链球菌2型(SS2)菌培养
将CVCC606株菌种接种于含有10%灭活新生牛血清的TSA培养基上(见上所述)，挑取 单个菌落接种于TSB液体培养基中，置于摇床中(150r/min) ， 37°C震荡培养过夜。
2) 猪链球菌2型(SS2)基因组DNA的提取
取1.0ml菌液于1.5ml的离心管中，8000r/min离心5min，弃上清。沉淀悬于500 u 1 TE(PH8.0)中，加10%的SDS，使其终浓度为1°/。，然后加3yl蛋白酶K (20mg/ml) ， 37 。C作用2h。离心取上清，用等体积的酚/氯仿抽提1次，上清用二倍体积的无水乙醇在-20 。C沉淀10min， 12000r/min离心20min，沉淀用70%的乙醇洗两次，室温放置20min，让酒 精挥发干净。沉淀用20 yl灭菌的去离子水溶解，-2CTC保存。
3) 目的基因的扩增
以上述方法提取的CVCC606株菌的基因组作为PCR模板。使用表1所示的引物进行PCR 扩增。PCR反应体系如下
ddH20 10XTaq Buffer dNTP (2. 5raM each)
37.5p1 5. Oii 1 4. On 1
上游引物 下游引物
1. Op 1DNA模板 1 u 1
Taq酶(5U/ti 1) 0.5H 1
反应程序为94。C预变性5min; 94°C lmin; 55°C lmin; 72°C 5min; 30个循环，延伸72°C 10 min。
4) PCR产物回收
采用海生工生物工程技术有限公司的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收DNA片段，按照 UNIQ-10柱式离心式DNA凝胶回收试剂盒的说明书的步骤进行，具体操作如下
1) 用0. 8%的琼脂糖胶电泳，使目的DNA片段与其它DNA尽可能分开，在长波紫外灯下， 用在酒精灯火焰上烧过的手术刀片切下含有目的DNA片段的琼脂块，放入1. 5ml灭菌离心 管中。
2) 按每lOOmg琼脂糖胶加入400W Binding Buffer,置50-60。C水浴中10min,使琼脂 糖凝胶彻底融化(加热溶胶时，每2min混匀一次)。
3) 将UNIQ-IO柱放入收集管中，将融化的胶溶液转移到UNIQ-10柱中，室温静置2min， 室温8000rpm离心lmin。
4) 取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一个收集管中，加入 500)4 Wash Solution,室温8000rpm离心lmin。
5) 重复步骤4，取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-IO柱放入同一个收集 管中，室温12000rpm离心15 sec。
6) 将UNIQ-10柱放入一个灭菌的1. 5ml离心管中，根据PCR产物量的相对多少，在柱子 底部的膜中央加10-20W Elution Buffer或ddH20，室温或37°C
放置2min室温12000rpm离心lmin，离心管中的液体即为回收的DNA片段，可立即使用
或保存于-2(TC备用。 重组表达质粒的构建
利用EcoRl + XholI (购自宝生物(大连)有限公司产品)同时酶切PCR扩增的战W/97 基因片段和pET-28a(+)，回收PCR扩增片断以及表达载体，将酶切后报^^7基因片段与酶 切后pET-28a(+)连接，构建出pET-28a-0197质粒。上述酶切位点在本发明所用质粒 pET-28a(+)中均为单一酶切位点(插入位置在EcoRl与Xholl酶切位点之间)。 连接产物的转化
取感受态细胞DH5 a 100 iU加入到1. 5mlEP管中，将连接后的重组质粒pET-28a-0197 各5-10ii 1加入并混匀。置冰上30min后，42。C热激90sec,冰浴3min-5min。加入400 u 1 LB， 于37t;200rpm振荡培养45min使其复苏。复苏后的重组大肠杆菌悬液于4'C5000rpm离心 10min，弃去400lU上清，用剩余的100y 1重悬沉淀涂布于含有25u g/ml Kna的LB琼脂平 板。37。C增殖lh，再将平板翻过来，倒置37。C培养14h-16h至菌落出现。 重组质粒的酶切鉴定
质粒的提取使用碱裂解法(参照《分子克隆实验指南》第三版.黄培唐等译，北京，科学出版社，2002版介绍的方法)进行，具体操作步骤如下
1) 用灭菌牙签在LB平板上随机挑取数个单菌落，分别接种于3ml 25ixg/ml卡那霉素 的LB液体培养基中，37'C振荡培养过夜。
2) 将菌液转入1. 5ml离心管内，于4"8000rpm离心3min，弃上清，再将剩余的1. 5ml 菌液重复离心，倒立离心管于吸水纸上，使液体流尽。
3) 加入100 u 1冰预冷的溶液I ，涡旋使菌体充分悬浮，再加入200 u 1新配制的溶液 II，反复颠倒离心管数次，冰浴5min，最后加入150.0tU冰预冷的溶液ni，温和颠 倒离心管数次，冰浴10min。
4) 于4。C以12000rpm离心10min，吸取上清至另一支1. 5ral离心管中，加入等体积的 异丙醇，混和均匀，室温静置5min。
5) 室温12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用75W令乙醇漂洗后，按照常规真空千燥 或自然干燥方法干燥。
6) 沉淀用200ul含20ul Rnase (20ng/ml)的TE (pH8. 0)溶解，56。C水浴30min 或37。C水浴lh以除去RNA。
7) 加7. 5mol/L NH4Ac 100y 1，室温静置5min，再于室温12000rpm离心5min。
8) 吸取上清到另一1.5ml的EP管中，加入2倍体积的冷无水乙醇，冰浴置10min。
9) 于4。C12000rpm离心10min，弃上清，沉淀用75%冷乙醇漂洗后，真空干燥后溶于20 u 1 ddH20或TE (pH8.0)，置-2(TC冰箱保存备用。
重组质粒的双酶切鉴定利用EcoRl+XholI酶切PET-28a-0197表达质粒，酶切后应出现预
期大小的外源片段和载体片断即为正确的重组质粒。
重组表达菌株的构建取感受态细胞BL-21 (DE3) 100n 1加入到1.5mlEP管中，将重组质粒 pET-28a-0197各0. 5 y 1加入并混匀。置冰上30min后，42。C热激90秒，冰浴3min-5min。 将其涂布于含有25 u g/ml Kna的LB琼脂平板。37匸正置lh，再将平板翻过来，倒置37。C培 养14h-16h至菌落出现。 目的基因在大肠杆菌中的表达及纯化
目的基因的诱导表达:将含重组抗原蛋白0197的表达菌株接种于含有25ug/ml Kna的3mL LB液体培养基，于37'C摇床培养。从培养好的菌液中取100uL接种于10mL含有25(jg/ml Kna的新鲜LB液体培养基中，于37t:振荡培养约3h，至〇0600达到0.6-1.0时，加IPTG 至终浓度为0.8 mmol儿，继续培养3h后收集菌体。 表达产物的SDS-PAGE电泳分析 SDS-PAGE电泳样品的制备
将诱导后的重组大肠杆菌于8000r/min离心15min。沉淀用1/10体积的50mMTris-cl (pH8.0)重悬，并加入溶菌酶至终浓度lmg/ml，冰浴30min。冰浴条件下进行超声碎破，直至菌液不再粘稠，IO00Or/min，离心30min。分别取少量裂解后的上清和沉淀，加入Zx蛋白电泳上样缓冲液125pl,oTT25pl及TE液100pl，震荡混匀，100℃煮沸IOmin,1200Or/min离心smin，进行SDS一PAGE电泳分析。SDS聚丙烯酞胺凝胶的配制及电泳
12％的分离胶配制纯化水1.6ml,30％丙烯酞胺溶液2.0ml,1.smol/LTris一Base溶液(pHS.8)1.3ml,10%SDS0.Osml,10％过硫酸钱0.Osml和TEMED0.003ml。将各成分加入后迅速混合，加入制胶板中，上面加纯化水。5％积层胶配制纯化水2.lml,300k丙烯酞胺溶液0.5ml,1.omol/LTris一Base溶液(pH6.8)0.38ml,10%SDS0.O3ml,10％过硫酸按0.O3ml,TEMED0.003耐；将各成分加入后迅速混合，加入制胶板的分离胶的上面，灌满后插入加样梳。待积层胶凝固后，取下梳子；将凝胶固定于电泳装置上，加入足够量的TriS一甘氨酸电泳缓冲液，在加样孔中分别加入各样品电泳电压200V，电流在20mA一40mA范围内，电泳1h,至澳酚蓝泳出胶底面，终止电泳。聚丙烯酞胺凝胶染色与脱色
卸下凝胶，用考马斯亮蓝R25O染色液(45％甲醇，45q0纯化水，10％冰乙酸，0.25％的考马斯亮蓝R250)染色3Omin，再用脱色液(45％甲醇，45％纯化水，10W0冰乙酸)进行脱色lmin,观察结果。重组蛋白的纯化
将收集的重组抗原蛋白表达菌使用Bindingbuffer(20InMTris一HCIpH7.9,smMImidazole,0.5MNaCI)重悬，超声波破碎，4oC12,0009离心15min取上清上样。分别使用Bindingbuffer和Washingbuffer(20mMTris一HCIpH7.9,15InMImidazole,0.5MNaCI)洗柱直至OD值达到基线附近，换用Elutionbuffer(20mMTris一毗1pH7.9,40mMIm主daZole,0.5MNaCI)洗脱结合的重组抗原蛋白，收集波峰部分蛋白作为纯化的重组抗原蛋白用于进一步分析。
本实施例的效果见图3所示。重组抗原蛋白居刃／夕7纯化SDS一队GE电泳分析见图4。实施例2重组抗原蛋白的特性分析1.用western一blot方法分析重组抗原蛋白的抗原性将上述纯化的重组抗原蛋白0197按照常规方法进行SDS一PAGE电泳。其步骤是1)转移切出6张Whatman3M滤纸和1张硝酸纤维膜(NC膜)，滤纸和膜的大小要和凝胶的大小完全相等或略小于凝胶，用铅笔在滤膜一角作标记，确保转印后膜与凝胶的相对方向；将硝酸纤维膜在纯化水中浸泡5min；在另一浅托盘中加入少量转移缓冲液，将6张Whatman3M滤纸浸泡于其中。然后按照如下步骤安装转移电泳槽平放石墨电极的底座(阳极)，依次放3层3M滤纸、硝酸纤维膜、聚丙烯酞胺凝胶和3层3M滤纸。彻底排除各层间的气泡；将转移电泳槽的上盖扣到石墨电极一转移膜胶复合体上；连接电源， 根据凝胶板面积按照0.65 mA/cm2-1.0raA/cm2的参数接通电流，电泳转移0. 5h-2h。
2) 丽春红染色转移结束后，取下NC膜，于去离子水中漂洗2次-3次后，转移至丽春 红染色液中染色5min-10min，观察转印效果，并用铅笔标出蛋白Marker位置；室温下 用去离子水漂洗硝酸纤维膜直至颜色褪去；
3) 将NC膜置于5%的脱脂奶粉中，室温封闭2h;
4) 洗膜弃封闭液，用1XTBST洗NC膜3遍，每次5min;
5) —抗孵育将NC膜放入用5%的脱脂奶粉稀释的兔抗SS2型菌阳性血清(体积比1:50)， 37。C孵育2h;
6) 洗膜取出NC膜，用1XTBST洗膜3次，每次10min;
7) 二抗孵育:将膜转入5%的脱脂奶粉稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体(体积比1:5000)， 37。C孵育2h;
8) 洗膜取出NC膜，用 1XTBST洗膜3次，每次10min;
9) 显色将NC膜置于新配置的DAB显色液中，置暗处显色，待蛋白带的颜色深度达到要 求后，用1XTBST冲洗以终止反应。
2.重组蛋白抗血清的制备
1) 重组蛋白浓度的测定
参照《分子克隆实验指南》第三版，黄培唐等译，北京，科学出版社，2002年版介绍的 方法，将牛血清白蛋白用PBS缓冲液溶解，然后按体积进行倍比稀释。分别取每个浓度的蛋 白标准液lOOul,加入到5ral的考马斯亮兰染料液中，反应10min后，在波长595nm处 测吸光度，根据测得的OD值与相应浓度的关系，绘制标准曲线，并推导出换算公式。
2) 疫苗的制备及免疫试验
重组抗原蛋白疫苗的制备将重组抗原蛋白0197与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，使 疫苗中抗原蛋白终浓度为500wg/ml。第二次免疫用疫苗采用弗氏不完全佐剂。
免疫方法给所述的试验小鼠腹腔接种弗氏完全佐剂乳化的重组蛋白疫苗(接种量为
100ul/只)；2周后腹腔接种弗氏不完全佐剂乳化的重组蛋白疫苗(接种量为100ul/只)；间
隔10天后于眼眶放血，收集血清。
本实施例中采用Western-blot方法分析重组抗原蛋白，发明效果见图4。
实施例3:重组抗原蛋白小鼠免疫保护力试验 1.重组蛋白的表达及纯化
将含pET-28a-0197质粒的表达菌株接种于含0. 25p g/ml卡那霉素的3 mL LB液体培养基，于37'C摇床培养。从培养好的菌液中取100 n L接种于10 mL含2. 5 y g卡那霉素的新鲜 LB液体培养基中，于37。C振荡培养约3h，至OD卿达到0.6-1.0时，加IPTG至终浓度为0. 8 mmol/L，继续培养3h后收集菌体。
将以上收集的重组抗原蛋白表达菌用Binding buffer(20 mMTris-HC1 pH7.9， 5 mM Imidazole, 0.5腦aCl)重悬，超声波破碎，4'C12,000g离心15min取上清上样。分别使用 Binding buffer和Washing buffer(20 mMTris-HCl pH7.9， 15 mM Imidazole, 0.5 MNaCl) 洗柱直至0D值达到基线附近，换用Elution buffer (20 mMTris-HCl pH7. 9， 40mM Imidazole, 0.5 MNaCl)洗脱结合的重组蛋白，收集波峰部分蛋白作为纯化的重组蛋白。
2. 重组蛋白浓度的测定(Bradford法)
具体操作见实施例2。
3. 重组抗原蛋白疫苗制备及免疫方法
1) 重组抗原蛋白疫苗的制备
将重组抗原蛋白0197与弗氏完全佐剂等体积混合乳化，使疫苗中抗原蛋白终浓度为500 yg/ml用于首次免疫，第二次免疫使用弗氏不完全佐剂，其余组分与首免相同。
灭活疫苗制备将猪链球菌2型CVCC606株菌经纯培养后，挑取单个菌落8 10个， 涂于TSA平板上(含10%灭活牛血清)。37。C培养16h 18h后，用灭菌的0. 01mol/L PBS 将平板上的菌苔洗下，稀释至7.5X109cfu/ml，用甲醛灭活(3%。) 24h 48h，然后与弗氏
佐剂按1:1体积混合乳化，终浓度达到3. 0 X 103cfu/ml 。
2) 免疫方法
试验小鼠腹腔免疫弗氏完全佐剂乳化的抗原蛋白100p1 /只；2周后腹腔免疫弗氏不完 全佐剂乳化的抗原蛋白100yl /只。
3) 半数致死量(LD5 )的测定
(1) 预试验在预试中求得8周龄雌性BALB/c小鼠全死亡或90%以上死亡的剂量和动 物不死亡或10%以下死亡的剂量，分别作为正式试验的最高与最低剂量。
(2) 注射方式腹腔注射。
(3) 动物分组设立4个剂量组，每组6只BALB/c小鼠。
(4) 剂量将由预试验得出的最高、最低剂量均换算为常用对数，然后将最高、最低 剂量的对数差，按所需要的组数，分为几个对数等距(或不等距)的剂量组。
(5) 试验结果的计算与统计。
4) 试验分组及免疫
7周龄，体重18土2g雌性BALB/c小白鼠30只，平均分为3组、疫苗I组(0197)、 弗氏佐剂对照组和PBS对照组，每组20只。腹腔注射，每2周免疫1次，共2次，免疫剂 量为0. lml/只，期间每周断尾取血，用于血清特异性抗体的监测。
5) 血清特异性抗体的检测使用纯化的重组抗原蛋白0197 250 ng/100u 1于4。C过夜包被酶联板，1% BSA 37。C封 闭lh，洗涤液洗板1次后封装于-2(TC保存。将加强免疫一周后的小鼠采血分离血清，倍比 稀释后取100yl加入酶联板，同时设弗氏佐剂对照和空白对照。37X:反应30niin。洗板3次 后加入体积比l:5,000稀释的羊抗鼠IgG (H+L) - HRP，37。C反应30min。洗板5次后加入100u 1 底物液，避光显色10min后加入0.25WHF终止反应，于630nm读数。取OD值大于0. 3的血清
最大稀释倍数作为血清抗体滴度。
6) 重组抗原蛋白诱导小鼠抗体IgG亚类测定
将加强免疫2周后的小鼠采血分离血清，倍比稀释后取100ul加入酶联板，37'C反应 30min。洗板3次后每个稀释度的血清分别加入体积比1:5， 000稀释的羊抗鼠IgGl - HRP、 IgG2a -服P， 37。C反应30min。洗板5次后加入100 u 1底物液，避光显色10min后加入0. 25%HF 终止反应，于630nm读数。取OD值大于0. 3的血清最大稀释倍数作为该IgG亚类的滴度。
7) 免疫鼠攻毒后保护情况
对加强免疫两周后的小鼠进行攻毒试验。攻毒试验分为两批进行，每组10只，每个蛋白 免疫的小鼠分别接种5LD5o和20LD5o剂量的CVCC606株菌。连续观察一周，记录小鼠的 临床特征及死亡情况。
本实施例中重组抗原蛋白的表达、纯化效果见图4; CVCC606株菌半数致死量(LDs。)为 4Xl(fCFU;对重组抗原蛋白0197进行血清特异性抗体的检测发现能诱导很高的抗体水平， 效果见图5;重组抗原蛋白诱导小鼠抗体IgG亚类测定，结果见图6。将纯化的重组抗原蛋白 0197免疫小鼠，以5 LDs。和20 LDs。攻毒评价重组抗原蛋白的免疫保护力，结果如图7所示。。
本发明通过克隆表达猪链球菌2型抗原蛋白0197，对0197的特性经行实验分析，证明 了该抗原蛋白具有较好的免疫原性，免疫小鼠后能诱导较高抗体水平，并主要诱导Th2型免 疫。攻毒保护力实验表明该蛋白能够明显增强小鼠对SS2的抵抗力，是一种很好的免疫保护 性抗原，可以作为猪链球菌2型亚单位疫苗的候选抗原。
权利要求
1、一种能够分泌猪链球菌2型抗原蛋白的重组大肠杆菌(Escherichia coli)BL21/pET-28a-0197，保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NOM208146。
2、 一种由权利要求1所述重组大肠杆菌分泌的猪链球菌2型抗原蛋白。
3、 一种由权利要求2所述重组大肠杆菌分泌的猪链球菌2型抗原蛋白制备的 亚单位疫苗。
4、 权利要求1所述的重组大肠杆菌在制备猪链球菌2型抗原蛋白中的应用。
5、 权利要求1所述的重组大肠杆菌在制备猪链球菌2型亚单位疫苗中的应用。
全文摘要
本发明属于家畜传染病技术领域。具体涉及一种猪链球菌2型免疫保护性抗原及其制备方法与应用。涉及本发明的核心技术是制备了能够分泌猪链球菌2型抗原蛋白0197的表达菌株Escherichia coli BL21/pET-28a-0197，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NOM208146。本发明还公开了适用于猪链球菌2型的亚单位疫苗的抗原蛋白的制备方法及用途。
文档编号A61P31/04GK101418275SQ20081022534
公开日2009年4月29日 申请日期2008年10月30日 优先权日2008年10月30日
发明者张安定, 慕小凤, 冉 李, 金梅林, 博 陈, 陈焕春 申请人:华中农业大学