低免疫原性抗TNF-α全人源单抗及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种低免疫原性的抗TNF-α全人源单抗及其应用。通过对阿达木(adalimumab)单抗氨基酸序列分析，对其中免疫原性高的非抗原结合序列进行改进，构建并筛选出多个免疫原性有效降低的抗TNF-α全人源单抗，其与人TNF-α结合的亲和力和原始adalimumab抗体相近，可特异性地阻断TNF-α与细胞表面TNF受体p55和p75的结合。本发明为针对TNF-α靶标的抗肿瘤及其他疾病如炎症及自身免疫性疾病的预防和治疗提供了免疫原性更低、半衰期更长的抗体药物，该抗体药有望减少其在病人体内产生免疫原性的风险，延长抗体药的半衰期，提高疗效，具有优异的临床应用价值。
【专利说明】低免疫原性抗TNF-α全人源单抗及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及治疗用人源基因工程抗体的制备及应用，主要是涉及特异性针对人 TNF-α的抗体及其应用。
【背景技术】
[0002] TNF-α是一种在炎症和免疫应答中自然出现的细胞因子。研究发现在类风湿性 关节炎（RA)患者的滑膜液中，TNF-α水平升高，并在病理性炎症和关节破坏方面起重要作 用。目前一般采用单克隆IgG抗体或者可溶性的TNF-α受体来中和体内的TNF-α。市售 的单抗有如下：英夫利昔是人源化的TNF-α鼠单克隆抗体，依那西普是由两条人TNF-α受 体（P75)偶联到Fc端的融合蛋白。利用放射性标记的TNF-α进行结合能力测定，结果显 示英夫利昔能结合单体（无活性）及三聚体（有活性）类型的可溶TNF ;依那西普更倾向 于结合有活性的聚体形式的TNF-α及TNF-β。阿达木（adalimumab)单抗是美国雅培公 司研制的一个全人的TNF-α单克隆抗体，其可特异性地与TNF结合并阻断其与p55和p75 细胞表面TNF受体的相互作用。但adalimumab单抗在宿主体内免疫原性较强，高达26% 以上的患者使用该单抗会发生免疫反应，这给临床患者的使用带来了风险和不便，同时药 物半衰期也相对较短，使用的过程中也需要增大药物剂量来弥补该方面的缺陷。基于此，若 能够在不影响抗体亲和力和特异性的前提下，通过将抗体中高免疫原性的非抗原结合位点 换成低免疫原性的同源序列来降低抗体药的免疫原性，则一方面可使单抗的安全性得到提 高；另一方面可增加药物半衰期，在减少其用剂量同时也能起到提高疗效的作用。目前未见 低免疫原性TNF-α的抗体的报道。
【发明内容】
[0003] 本发明的第一个目的在于提供一种低免疫原性的全人源抗TNF-α的单克隆抗 体。
[0004] 本发明的另一个目的在于提供一种制备低免疫原性全人源抗TNF-α的单克隆抗 体的方法。
[0005] 本发明利用商业化的DNAStarTM软件对阿达木单抗（购自美国雅培公司）的原始 序列进行评价，结果显示，阿达木免疫原性系数为16。利用上述软件对抗体的可变区里面的 非抗原结合片段（FR)进行免疫原性评价，找到免疫原性强的相关序列。随后，查找人抗体 基因库中所有涉及轻重链的FR区段，通过比较后选择出一些免疫原性相对较低的区段。将 区段中相应变动的部分分别得同阿达木单抗中对应的区段进行替换，随后用Pymol蛋白分 子模拟软件进行3D建模，选择保持了原有的抗原结合位点的序列进行基因合成，测序，选 择测序正确的序列。
[0006] 本发明的低免疫原性抗TNF-α全人源单克隆抗体，即是在原始阿达木序列的轻 链可变区和重链可变区的FR区进行氨基酸改造，降低其免疫原性，所述原始阿达木序列的 轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQIDNO. 23、24所示。
[0007] 进一步地，本发明提供的低免疫原性抗TNF-α全人源单克隆抗体，其轻链可变区 的氨基酸序列为SEQIDNO. 11?15或SEQIDNO. 23任一所示，其重链可变区的氨基酸序 列为SEQIDNO. 16?20任一所示。
[0008] 更进一步地，本发明提供的低免疫原性抗TNF-α全人源单克隆抗体，其轻链可变 区的氨基酸序列如SEQIDNO. 13所示，其重链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO. 19所示。 编码其的核苷酸序列分别如SEQIDNO. 3和SEQIDNO. 9所示。
[0009] 本发明提供的全人源的抗人TNF-α单克隆抗体，其轻链可变区具有Ll至L5(SEQ IDNOl?5所示）这五条碱基序列所示的任一个轻链可变区序列，重链可变区具有hi至 h5(SEQIDNO. 6?10所示）这五条碱基序列所示的任一个重链可变区序列。
[0010] 具备上述轻链可变区和重链可变区的组合中，本发明共筛选得到10个单抗序列， 它们既保持了原有抗原结合位点、又与人TNF-α结合的亲和力和原始adalimumab抗体相 近，可特异性地阻断TNF-α与细胞表面TNF受体p55和p75的结合。
[0011] 这10个单克隆抗体都具有相同的⑶R区域且具有同样的功能，但对这10个抗体 FR区域中某些氨基酸进行了不同的调整，这可使它们的免疫原性得到有效的降低。
[0012] 本发明的提供编码上述10个单克隆抗体轻链可变区和重链可变区的基因。
[0013] 本发明得到的10个低免疫原性的全人源抗TNF-α的单克隆抗体，分别为L3h2、 L3h4、L5h2、L4hl、L4h2、L4h4、Llh3、L2hl、L0h4、L2h5、
[0014] 其中L3h2单抗的轻链的核苷酸序列分别如SEQIDNO. 3所述，重链的核苷酸序列 分别如SEQIDNO. 7所述，其轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO. 13所述，重链的氨基酸 序列分别如SEQIDNO. 17所述。
[0015] 其中L3h4单抗的轻链的核苷酸序列分别如SEQIDNO. 3所述，重链的核苷酸序列 分别如SEQIDNO. 9所述，其轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO. 13所述，重链的氨基酸 序列分别如SEQIDNO. 19所述。
[0016] 其中L5h2单抗的轻链的核苷酸序列分别如SEQIDNO. 5所述，重链的核苷酸序列 分别如SEQIDNO. 7所述，其轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO. 15所述，重链的氨基酸 序列分别如SEQIDNO. 17所述。
[0017] 其中L4hl单抗的轻链的核苷酸序列分别如SEQIDNO. 4所述，重链的核苷酸序列 分别如SEQIDNO. 6所述，其轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO. 14所述，重链的氨基酸 序列分别如SEQIDNO. 16所述。
[0018] 其中L4h2单抗的轻链的核苷酸序列分别如SEQIDNO. 4所述，重链的核苷酸序列 分别如SEQIDNO. 7所述，其轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO. 14所述，重链的氨基酸 序列分别如SEQIDNO. 17所述。
[0019] 其中L4h4单抗的轻链的核苷酸序列分别如SEQIDNO. 4所述，重链的核苷酸序列 分别如SEQIDNO. 9所述，其轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO. 14所述，重链的氨基酸 序列分别如SEQIDNO. 19所述。
[0020] 其中Llh3单抗的轻链的核苷酸序列分别如SEQIDNO. 1所述，重链的核苷酸序列 分别如SEQIDNO. 8所述，其轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO. 11所述，重链的氨基酸 序列分别如SEQIDNO. 18所述。
[0021] 其中L2hl单抗的轻链的核苷酸序列分别如SEQIDNO. 2所述，重链的核苷酸序列 分别如SEQIDNO. 6所述，其轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO. 12所述，重链的氨基酸 序列分别如SEQIDNO. 16所述。
[0022] 其中L2h5单抗的轻链的核苷酸序列分别如SEQIDNO. 2所述，重链的核苷酸序列 分别如SEQIDNO. 10所述，其轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO. 12所述，重链的氨基酸 序列分别如SEQIDNO. 20所述。
[0023] 其中L0h4单抗的轻链的核苷酸序列分别如SEQIDNO. 21所述，重链的核苷酸序 列分别如SEQIDNO. 9所述，其轻链的氨基酸序列分别如SEQIDNO. 23所述，重链的氨基 酸序列分别如SEQIDNO. 19所述。
[0024] 本发明提供了含有上述10个中任一个低免疫原性的全人源抗TNF-α的单克隆抗 体轻链可变区和重链可变区基因的表达载体。含有所述表达载体的宿主菌、宿主细胞或表 达盒也在本发明的保护范围内。
[0025] 本发明提供上述10个低免疫原性的全人源抗TNF-α的单克隆抗体在制备治疗自 身免疫性疾病药物中的应用。
[0026] 所述的疾病为风湿性关节炎，红斑狼疮。
[0027] 本发明提供了上述全人源抗TNF-α单克隆抗体在制备以TNF-α为靶标的疾病治 疗药物中的应用。
[0028] 所述的药物为抗肿瘤药、抗炎药物或治疗自身免疫性疾病的药物。
[0029] 本发明提供了含有上述全人源抗TNF-α单克隆抗体的药物或检测试剂。
[0030] 本发明提供了制备上述全人源抗TNF-α单克隆抗体的方法，包括以下步骤：
[0031] (1)对NCBI数据库里的人源抗体的FR序列进行分析（详见图2、3)，根据上述结 果同时利用商业化的DNAstar软件对抗体的可变区里面的4个非抗原结合片段（FR)进行 免疫原性评价，找到免疫原性强的片段。然后通过对已知的人抗体基因库里面找出所有重 链的FR3段，挑选出一些免疫原性低的相应区段。将阿达木单抗上相应的重链及轻链区段 进行替换，随后用Pymol蛋白分子模拟软件进行3D建模，结果发现大部分替换排列组合导 致抗体的抗原结合位点构象变动很大，但是也有部分基本保持了原有的抗原结合位点；
[0032] (2)根据以上信息，本发明对相应修改后的序列进行全基因合成，对合成的基因 进行测序同时选择测序正确的序列进行下一步操作，将轻链可变区设计酶切位点为Kpn I+BamHI，重链可变区设计酶切位点为KpnI+Agel，分别与表达载体pJH16载体连接，同时 转化大肠杆菌DH5ci，得到重链、轻链嵌合抗体表达载体，结果详见图1。同时对构建的抗体 进行测序和序列对比；
[0033] (3)对上述表达的载体进行质粒大提工作，选取Qiagen的无内毒素质粒大提试剂 盒（详见该质粒试剂盒说明书）；
[0034] (4)对选取的质粒进行优化组合，同时利用293F细胞进行瞬时转染表达，对表达 的抗体进行亲和力和EC50检测（详见图4)根据检测结果来选定哪些组合进行稳定转染；
[0035] (5)根据上述检测结果，本发明选取相应的组合利用电转染方式构建稳定株，同时 利用MTX进行抗体表达程度的筛选，对于加压后的稳定株进行单克隆筛选，最终挑选出抗 体产量较高的稳定株，用于后续实验所用；
[0036] (6)本发明生产的单克隆抗体在小鼠体内的免疫反应比adalimumab低，同时半衰 期明显延长。
[0037] 本发明提供的全人源抗TNF-α抗体和adalimumab针对的是TNF-α相同位点，但 其免疫原性和抗体构象同adalimumab不同，同adalimumab相比其药物半衰期延长，有望成 为非常理想的生物祀向治疗抗体。本发明通过对adalimumab单抗进行免疫原性改造，使抗 体中部分氨基酸序列改变，将显著降低该抗体药在病人体内产生免疫原性的风险。本发明 实施例显示本发明的改进型adalimumab抗体与TNF-α结合的亲和力和原始adalimumab 相近，并延长抗体药的半衰期，提高疗效。
【专利附图】
【附图说明】：
[0038] 图1为质粒及合成基因酶切结果；其中a图为pJH16质粒双酶切结果（kpnI和 AgeI)，1:质粒双酶切结果。b图为pJH16质粒双酶切结果（kpnI和BamHI)，1:质粒双 酶切结果。c图为阿达木原始重链（kpnI和AgeI)及轻链（KpnI+BamHI)基因双酶切 结果，1 :重链双酶切结果，2 :轻链双酶切结果；其中M为DL15000marker。
[0039] 图2人源化轻链氨基酸序列BLAST比对结果；其中，图2a、图2b、图2c三个图均为 该BLAST比对结果。
[0040] 图3人源化重链氨基酸序列BLAST比对结果；其中，图3a、图3b、图3c三个图均为 该BLAST比对结果。
[0041] 图4改进型阿达木亲和力EC50。
[0042] 图5改进型阿达木抑制TNF- α诱导L929细胞毒性实验。其中，图5a代表TNF- α 诱导L929细胞毒性实验，作为实验的阳性对照；图5b代表改进型阿达木抗体抑制TNF-α 诱导L929细胞毒性。
[0043] 图6改进型阿达木抗体药代动力学检测。
【具体实施方式】
[0044] 以下实施实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不 背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本 发明的范围。
[0045] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0046]实施例1降低免疫原性阿达木序列的分析及设计
[0047] 利用商业化DNAStar?软件对阿达木原始序列进行评价，评价结果显示，阿达木免 疫原性系数为16,针对此本发明需要进行下一步免疫原性的降低工作。
[0048] 通过利用上述软件对抗体的可变区里面的非抗原结合片段（FR)进行免疫原性评 价，找到免疫原性强的相关序列。随后，查找人抗体基因库中所有涉及轻重链的FR区段，通 过比较后选择出一些免疫原性相对较低的区段。基于上述信息，将区段中相应变动的部分 分别得同阿达木单抗中对应的区段进行替换，初步得到的全人源的抗人TNF-α单克隆抗 体，其轻链可变区选自Ll?L5、LO(SEQIDNO. 1?5、所示SEQIDNO. 21)任一个碱基序 列组成的轻链可变区序列，重链可变区选自hi?h5(SEQIDNO. 6?10)所不任一个碱基 序列组成的重链可变区序列。
[0049] 随后用Pymol蛋白分子模拟软件进行3D建模，结果发现大部分替换排列组合导致 抗体的抗原结合位点构象变动很大，但是也有部分基本保持了原有的抗原结合位点；因此 对保持原有抗原结合位点的修改后的所有序列进行全基因合成（委托金唯智公司合成）， 对合成的基因进行测序（委托金唯智公司进行测序工作），根据测序比对结果选择正确的 序列。
[0050] 实施例2阿达木单抗表达载体的构建
[0051] 根据实施例1测序得到的改进型阿达木重链、轻链可变区碱基序列，设计轻链序 列两侧的酶切位点为KpnI+BamHI，设计重链序列两侧的酶切位点为KpnI+Agel，以上序列 送交金唯智公司合成全基因序列，合成所用的连接载体为PUC57。以pJH16为表达载体，合 成基因返回后，将它们分别与金唯智公司合成的序列进行酶切后（见图1)，16°C过夜连接。 将酶切后得到的目的基因和表达载体（PJH16)进行琼脂糖凝胶电泳分离，随后切下目的条 带并用QiagenGelExtractionKit回收，按T4DNA连接体系连接过夜，然后转化大肠杆菌 DH5α，对相应的菌株进行质粒提取和序列测定工作，测序结果表明二者序列完全一致，这 表明抗体表达载体构建成功。
[0052] 实施例3改进型阿达木单抗的瞬时表达与纯化
[0053] 用实施例2构建的pJH16重链、轻链表达载体转染大肠杆菌DH5a。接种于IOOml LB培养基中，按照常规方法进行培养。收获培养物，用Qiagen公司的UltraPure质粒DNA 纯合试剂盒抽提纯化质粒DNA。将上述纯化的质粒DNA采用Invitrogen公司的脂质体法试 剂盒转染293F细胞，操作参照厂家的说明书进行。
[0054] 首先对293F细胞进行不同轻、重链质粒组合的转染，组合见表1，共31组293F瞬 时表达，需要从这31组中筛选出免疫原性降低的组合。培养3天后，取培养上清液，进行抗 体表达量检测，结果如下表1所示：
[0055] 表1 :原始及改进型阿达木抗体表达量检测结果（ng/ml)
[0056]
【权利要求】
1. 一种低免疫原性抗TNF-a全人源单克隆抗体，其特征在于，在原始阿达木序列的轻 链可变区和重链可变区的FR区进行氨基酸改造，降低其免疫原性，所述原始阿达木序列的 轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO. 23、24所示。
2. 如权利要求1所述的低免疫原性抗TNF-a全人源单克隆抗体，其特征在于，其轻链 可变区的氨基酸序列为SEQ ID NO. 11?15或SEQ ID NO. 23任一所示，其重链可变区的氨 基酸序列为SEQ ID NO. 16?20任一所示。
3. 如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，其轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 13所示，其重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO. 19所示。
4. 编码权利要求1?3任一所述单克隆抗体的基因。
5. 含有权利要求4所述的基因的表达载体。
6. 权利要求4所述的基因或权利要求5所述的表达载体在制备治疗以人TNF-a为靶 标的疾病药物中的应用。
7. 权利要求1?3任一所述单克隆抗体在制备治疗以人TNF-a为靶标的疾病药物中 的应用。
8. 权利要求1?3任一所述单克隆抗体在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用。
9. 如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的疾病为风湿性关节炎、红斑狼疮。
10. 含有权利要求1?3任一所述单克隆抗体的药物或检测试剂。
【文档编号】A61K39/395GK104341502SQ201410390493
【公开日】2015年2月11日 申请日期:2014年8月8日 优先权日:2013年8月9日
【发明者】孙乐, 张小刚, 李茂华, 樊贵宝, 孙哲, 张翠娟 申请人:北京天成新脉生物技术有限公司