专利名称：一种带有免疫标记的流产布鲁氏菌的重组菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种带有免疫标记的流产布鲁氏菌的重组菌及其应用。
背景技术：
布鲁氏菌病是一种人畜共患的传染病，也是大动物传染病中仅次于口蹄疫，具 有重要的政治、经济影响力的疾病，在世界各国的流行形势十分严峻。长期以来全 球防控布鲁氏菌病的策略主要是检疫-扑杀(发达国家)或免疫接种(发展中国家)， 前者通过检疫扑杀患病的牛、羊、猪等动物，耗资巨大、操作困难；后者通过免疫 接种并辅助扑杀措施，虽可阻止疾病在动物群中的传播，但免疫动物和临床患病动 物难以鉴别，使患病动物在自然群体中长期存在，严重威胁人类和动物群的健康， 阻碍动物中布鲁氏菌病的根除和净化。
发明内容
本发明的目的是提供一种流产布鲁氏菌的重组菌。
本发明提供的流产布鲁氏菌的重组菌，是将流产布鲁氏菌(5n^Z/aflZw加) 基因组中的perosamine合成酶(perosamine synthetase)的编码基因灭活后得到的重 组菌。
所述流产布鲁氏菌(^ wceZ/aatoW^)可为现有的菌株，如野生株(包括标准 株和强毒株)、疫苗株。
所述perosamine合成酶(perosamine synthetase)可为任何流产布鲁氏菌(5rwce〃a a6or加)的perosamine合成酶(perosamine synthetase),如为序歹!j 1所示的perosamine 合成酶(perosamine synthetase)。
所述perosamine合成酶(perosamine synthetase)的编码序列为序列表中序列2 所示的核苷酸序列。
可通过任何现有灭活方法灭活所述流产布鲁氏菌(5rwce//aa6w^s)中的 perosamine合成酶(perosamine synthetase)，如缺失基因组中该蛋白的编码序列、 插入外源或内源序列、同源重组、RNA干扰等。
所述同源重组是将DA14的DNA片段导入所述流产布鲁氏菌(5wce/Zfl WoWw) 中实现的；所述DA14的DNA片段，从上游至下游依次为同源臂DA14-1和同源臂
DA14-2;所述同源臂DA14-1和同源臂DA14-2能与所述流产布鲁氏菌基因组中 perosamine合成酶(perosamine synthetase)编码基因的上游序列和下游序列发生同 源重组，灭活所述perosamine合成酶(perosamine synthetase)的编码基因。 所述同源臂DA14-1和同源臂DA14-2的长度均为400-600bp。 所述同源臂DA14-1具体可为以流产布鲁氏菌2308 (5race〃aa6oWz^ 2308)标 准株的基因组DNA为模板，用如下引物进行PCR扩增得到的DNA片段
pWUA393 (上游引物)5， - GGGGTACCACGCTTAGGAACACTG -3，； pWUA394 (下游引物)5， - CTGCAGTGGCTGGATCATAGGTA -3，。 所述同源臂DA14-2具体可为以流产布鲁氏菌2308 (5rwce〃a a6oW"s 2308)标 准菌株的基因组DNA为模板，用如下引物进行PCR扩增得到的DNA片段
pWUA395 (上游弓I物)5 ， - AGCCACTGCAGGAGATTCAGGCGCTCCA -3 ，； pWUA396 (下游弓l物)5， - CGGGATCCCACCTCGCCAAGTGTC -3，。 实验证明，所述重组菌的毒力低于出发菌株，而且具有血清学诊断标记，其免 疫保护效力与现有的疫苗株相当。因此，该重组菌可用于开发流产布鲁氏菌疫苗。
该布鲁氏菌疫苗，其活性成分为上述流产布鲁氏菌的重组菌。 本发明通过对布鲁氏菌基因组中的功能基因进行筛选，发现perosamine合成酶
(perosamine synthetase)编码基因的灭活可使流产布鲁氏菌的毒力显著减低，同时 可以改变菌株免疫后动物血清中的抗体组成。本发明通过将流产布鲁氏菌的 perosamine合成酶(perosamine synthetase)的编码基因灭活，得到了新的菌株，与 出发菌株相比，该新菌株的毒力较小，无需灭活就可以作为疫苗免疫动物，而且可 以使免疫接种动物和临床患病动物通过血清学技术鉴别出来。使用本发明的菌株免 疫小鼠，小鼠体内能够产生与标准菌株、现有疫苗菌株不同的免疫反应状态，通过 动物血清的免疫学检测能够将患病动物从免疫动物群体中鉴别出来。本发明对布鲁 氏菌病疫苗的改进、诊断鉴别试剂的研制，开发布鲁氏菌基因缺失标记疫苗和配套 的鉴别诊断试剂，促进全球动物布鲁氏菌病的净化和根除具有十分重要的意义。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
图1为DA14-1和DA14-2的PCR鉴定结果 图2为DA14片段的PCR连接结果
图3为重组质粒pEX18AP-DA14转化大肠杆菌后的PCR鉴定结果
图4为重组质粒pEX18AP-DA14经BamHI和Kpnl双酶切后产物的PCR鉴定结果 图5为重组载体pEX18AP-DA14的构建流程图 图6为重组菌BIDA14的PCR鉴定结果 图7为重组菌BIDA14接种后小鼠脾脏的重量变化趋势 图8为重组菌BIDA14接种后小鼠脾脏的载菌量变化趋势 图9为重组菌BIDA14在小鼠体内的免疫效力实验结果
具体实施例方式
下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
以下实施例中所用的菌株和质粒如下
流产布鲁氏菌标准菌株2308 (Sn^e//aa6oWt 2308)、流产布鲁氏菌疫苗菌株 S19 (购自中国兽药监察所菌种室)；质粒pEX18AP (构建方法参见文献TungT. Hoang, Gene 1998,212:77-86)。
实施例1、带有免疫标记的流产布鲁氏菌的重组菌的构建
根据布鲁氏菌基因中的perosamine合成酶(perosamine synthetase)序歹(J (GenBank Accession Number: BAB1-0542)，设计两对引物， 一对引物用于扩增同 源臂DA14-1，另一对引物用于扩增DA14-2。同源臂DA14-1和同源臂DA14-2连接 后形成序列DA14，将序列DA14插入pEX18AP质粒，得到重组载体pEX18AP-DA14。 重组载体pEX18AP-M14与流产布鲁氏菌基因组发生同源重组即可得到灭活 perosamine合成酶(perosamine synthetase)编码基因的流产布鲁氏菌重组菌。
一、重组载体pEX18AP-DA14的构建
构建过程示意图见图5。
1、 布鲁氏菌基因组的提取
取300u l灭活的流产布鲁氏菌标准菌株2308，加入lml TNE (每升含有l. 21g Tris，5,84g NaCl，0.37g EDTA)混匀，10000r/min离心，留沉淀弃上清。之后加入 135nl TNE重悬洗涤后的沉淀。再向其中加入135u 1含2% Triton X-100的TNE，混 匀。加30ul新鲜配制的溶菌酶(5mg/ml)，轻弹试管混匀。37。C水浴孵育30min， 之后加入15yl蛋白酶K (20rag/ml)，涡旋混匀。65。C水浴至少孵育2h。
加入RNAse (使RNAse浓度达到10ug/ml)，琼脂糖凝胶电泳鉴定后将提取的 基因组DNA于4'C保存备用。
2、 PCR扩增上游片段DA14-1 (477bp)和下游片段DA14-2 (574bp)
扩增上游片段的引物如下
pWUA393 (上游引物)5， - GGGGTACCACGCTTAGGAACACTG -3，； pWUA394 (下游引物)5， - CTGCAGTGGCTGGATCATAGGTA -3，。 上游引物中加入Kpnl酶切位点，下游引物中加入Pstl酶切位点。 扩增下游片段的引物如下
pWUA395 (上游弓I物)5 ， - AGCCACTGCAGGAGATTCAGGCGCTCCA -3 ，； pWUA396 (下游弓l物)5' - CGGGATCCCACCTCGCCAAGTGTC -3' 上游引物中加入Pstl酶切位点，下游引物中加入BamHI酶切位点。 以步骤1得到的基因组DNA为模板，使用上述两对引物对进行降落PCR。降落 PCR反应的具体条件是先94-C预变性3min;然后94'C变性45s;退火温度从65 X:至5(TC每降rC运行2个循环，每个循环72。C延伸lmin;最后72"C延伸10 min。 扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，见图l。其中，1: DA14-1的PCR扩增产物， 2: M14-2的PCR扩增产物，M: DNA分子量标准。结果表明，成功扩增出了目的片 段。
3、 DA14片段的获得
通过PCR扩增将上游片段M14-l和下游片段M14-2连接，得到片段即为DA14 片段。PCR扩增所用的引物如下
pWUA393 (上游引物)5， -GGGGTACCACGCTTAGGAACACTG -3，； pWUA396 (下游弓l物)5， -CGGGATCCCACCTCGCCAAGTGTC -3， PCR扩增体系
DA14-l片段1ul
DA14-2片段1ul
dNTP (2.5 mM)1ul
T叫酶2ul
10XTaq buffer5ul
pWUA393 (20pmol/ia)1ul
pWUA3恥(20pmol/ul)1ul
双蒸水补足至50 ul38 ul扩增产物进行电泳检测，见图2。结果表明，成功获得了将DA14-l和DA14-2 连接的DA14片段。
4、 pEX18AP-DA14质粒的构建
提取含有AMP抗性基因、SacB基因以及含有多克隆位点的pEX18AP质粒。将经 BamHI和Kpnl双酶切后的pEX18AP质粒与步骤3得到的DA14片段连接。将得到的 重组质粒命名为pEX18AP-DA14。
用pEX18AP-DA14转化到DH5 a大肠杆菌，然后进行蓝白斑筛选。挑取阳性菌 株的单菌落进行摇菌培养，先进行PCR鉴定，鉴定引物如下
pWUA393 (上游引物)5' - GGGGTACCACGCTTAGGAACACTG -3';
pWUA396 (下游引物)5， - CGGGATCCCACCTCGCCAAGTGTC -3'
结果见图3。图3中，M: DNA分子量标准；1:阳性菌株的PCR产物。
然后提取质粒并进行BamHI和KpnI双酶切鉴定。酶切鉴定的结果见图4。图4 中，M: DNA分子量标准；1:重组质粒pEX18AP_DA14双酶切产物的PCR结果。
将得到的含有重组质粒菌株增殖，保存在-8(TC备用。
二、灭活perosamine合成酶(perosamine synthetase)编码基因的布鲁氏重组菌 株获得
在含有25mlTSB液体培养基的离心管中接种流产布鲁氏菌标准菌株2308 50ul， 37 r培养24小时后，离心菌体并用预冷的三蒸水悬浮并转入预冷的L5inl离心 管中，继续离心洗涤3-4次。然后，加入适量的冷三蒸水悬浮菌液，取87ul菌液 和3ul质粒(pEX18AP-DA14)加入lmm的电极杯，将电极杯放入BIORAD电穿孔仪中， 调整仪器至Agr程序后，按Pulse钮进行电击。査询电击参数为2. 22KV。电击后， 向电极杯中加入lml SOC培养液，转入1.5ml离心管，室温下静置10min,置于37 °。摇床复苏12-18h。将转化复苏后的菌液涂布于TSB+Amp (100ug/ul) 。 5-8天后 长出单个菌落。挑取单菌落至TSB液体培养基(无抗生素)37t:增殖48h，再将该 菌液稀释10-100倍后，取100ul涂布于含有5y。蔗糖的TSA平板培养基。经过3-5 天后长出单菌落，将此菌落进行PCR鉴定，阳性菌株即为灭活perosamine合成酶 (perosamine synthetase)编码基因的布鲁氏菌的重组菌，将其命名为带有免疫标记 的流产布鲁氏菌的重组菌BIDA14。 PCR鉴定用的引物如下
pWUA393 (上游引物)5' -GGGGTACCACGCTTAGGAACACTG -3，； pWUA396 (下游弓l物)5， -CGGGATCCCACCTCGCCAAGTGTC -3，。 带有免疫标记的流产布鲁氏菌的重组菌BIDA14的PCR鉴定见图6。图6中，1:DNA分子量标准；2:流产布鲁氏菌标准菌株2308的PCR产物；3:重组菌BIDA14 的PCR产物。
结果表明，获得了通过双交换灭活perosamine合成酶(perosamine synthetase) 编码基因的布鲁氏菌。
实施例2、灭活perosamine合成酶(perosamine synthetase)的布鲁氏菌重组菌 的鉴定
试验动物4-6周龄SPF级Balb,/C雌鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限 公司，许可证编号为SCXK(京)2007-0001。
一、毒力鉴定
将小鼠随机分为三组，每组30只。具体接种方案如下
第一组(试验组)接种实施例l制备的带有免疫标记的流产布鲁氏菌的重组 菌BIDA14，每只小鼠腹腔接种剂量O. lml，内含107细菌。
第二组(对照组l):接种流产布鲁氏菌标准菌株2308，每只小鼠腹腔接种剂 量O. lml，内含107细菌。
第三组(对照组2):接种流产布鲁氏菌疫苗菌株S19，每只小鼠腹腔接种剂 量O. lml，内含107细菌。
分别于接种后第l、 2、 3、 4、 5和10周从每组小鼠中选5只，进行脾脏大小、 脾脏载菌量和血清学检测评价。
脾脏重量随时间的变化见图7。其中，野生株表示接种流产布鲁氏菌标准菌株 2308的实验结果，S19表示接种流产布鲁氏菌疫苗菌株S19的实验结果，BIDA14 表示接种实施例1制备的带有免疫标记的流产布鲁氏菌的重组菌BIDA14的实验结 果。结果表明，带有免疫标记的流产布鲁氏菌的重组菌BIDA14接种后，小鼠的脾 脏与对照组1和2相比早期肿大，但后期迅速下降，与接种流产布鲁氏菌疫苗菌株 S19 (对照组2)相当。脾脏载菌量随时间的变化见图8。结果表明，带有免疫标记 的流产布鲁氏菌的重组菌BIDA14接种后，小鼠的脾脏载菌量与接种流产布鲁氏菌 疫苗菌株S19 (对照组2)相比在早期略有升高，但后期显著下降，甚至比疫苗组 下降还快。
血清学检测结果表明，接种流产布鲁氏菌标准菌株2308的小鼠血清通过布鲁 氏菌虎红平板凝集试验抗原(中国兽医药品监察所制造，批号200801)检测时，均 能够在2分钟内出现明显的凝集反应，通过试管凝集试验抗原(中国兽医药品监察
所制造，批号200603)检测到的抗体效价达到l: 100以上，而接种带有免疫标记 的流产布鲁氏菌的重组菌株BIDA14的小鼠血清的检测结果均为阴性。 二、疫苗效力评价
将上述健康小鼠随机分为三组，每组5只。三组小鼠分别注射带有免疫标记的 流产布鲁氏菌的重组菌株BIDA14、流产布鲁氏菌疫苗菌株S19和PBS，具体如下
第一组(试验组)接种实施例l制备的带有免疫标记的流产布鲁氏菌的重组 菌株BIDA14,每只小鼠腹腔接种剂量O. lml，内含107细菌。
第二组(疫苗对照组)接种流产布鲁氏菌疫苗菌株S19，每只小鼠腹腔接种 剂量O. lml，内含107细菌。
第三组(空白对照组)接种0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)，每只小鼠 腹腔接种剂量O. lml。
上述三组小鼠接种8周后，用流产布鲁氏菌标准菌株2308进行攻毒保护试验，攻 毒后两周剖杀小鼠并采血，取脾脏称重并计算脾脏载菌量变化，评价免疫效力。实 验设三次重复，平均脾脏载菌量变化的结果如图9所示。图中，未接种对照表示空 白对照组的实验结果，S19表示疫苗对照组的实验结果，BIDA14表示接种实施例1 制备的带有免疫标记的流产布鲁氏菌的重组菌株BIDA14的实验结果。小鼠体内攻 毒实验结果表明，perosamine合成酶(perosamine synthetase)编码基因缺失的带有 免疫标记的流产布鲁氏菌的重组菌BIDA14的免疫保护效力明显优于疫苗株S19。说 明与流产布鲁氏菌疫苗菌株S19相比，perosamine合成酶(perosamine synthetase) 编码基因缺失的带有免疫标记的流产布鲁氏菌的重组菌BIDA14的毒力较小，无需 灭活就可以作为疫苗免疫动物，而且可以使免疫接种动物和临床患病动物通过血清 学技术鉴别出来。
<160〉 2
<210〉 1
〈211〉 252
<212〉 PRT 〈213〉人工序列
<400> 1
<image>image see original document page 10</image>Gly Leu Tyr Pro lie Ser Ser Gly Thr Leu Lys Val Thr Gly Thr Val 85 90 95
Arg Ser Leu Phe Asp lie Gly Leu Gly Phe Glu Pro Asp Ala Thr Gly 100 105 110
Arg Glu Asn lie Leu Tyr Arg Gly Leu Leu Leu Gly Leu Thr Pro Arg 115 120 125
Phe Met Arg Glu lie Glu Asp Glu lie lie Glu Phe Ala Asp Leu Gly 130 135 140
Asp Phe lie Asp Tyr Pro lie Lys Thr Tyr Ser Ala Gly Met Gin Val 145 150 155 160
Arg Leu Ala Phe Ala lie Ser Thr Ala Val Ala Gly Asp lie Leu Leu 165 170 175
Leu Asp Glu Val lie Gly Ala Gly Asp Ala Ala Phe Met Thr Lys Ala 180 185 190
Lys Ala Arg lie Met Asn Met Val Glu Lys Ala Glu lie Met Val Leu 195 200 205
Ala Ser His Asp Leu Ala Asn Val Arg Gin Leu Cys Thr Arg Ala Leu 210 215 220
Val Phe Lys Ala Gly Thr lie Ala Phe Asp Gly Arg Val Glu Asp Ala 225 230 235 240
lie Ser Phe Tyr Asn Ser Gly Met Gly Ala lie Ala 245 250
<210> 2 <211> 759 <212> 腿 <213〉人工序列
〈400〉 2
atgatccagc catcgattac cctgtcaaat gttcatctgc actacgctgc atcagcgttc 60
aaagaacgct cagtcaaaac tctagtaaac gccttattga gtatgcggcg cagcgcagga 120
gcaaacattg aagacatcca tgccctaaag ggtatttctg tagatatagc gcggggcgaa 180
cgcgttgccc tgataggtca caacggggct ggcaaaagta cgttcttgaa aactatagcc 240
ggtctctacc ctatatcatc tgggacatta aaagtgacgg gtaccgtaag atccctgttc 300
gatattggtc ttgggtttga gcctgatgca actggccgtg agaatattct ttaccgtggg 360
ttgcttctcg gactaacgcc acgtttcatg cgagagatcg aggatgagat catcgagttc 420
gcggatctcg gcgattttat cgattatcca atcaaaactt attctgccgg catgcaagtt 480
cggctcgcct tcgcgatttc gacagcagtc gccggcgaca tactccttct agacgaagtt 540
ataggtgcag gtgatgcggc attcatgact aaggcgaagg cccgcataat gaatatggtc 600
gagaaggctg agataatggt tctagcaagc catgaccttg cgaacgtccg tcagctttgc 660
acacgagcat tggttttcaa agccggcaca attgcatttg atggcagggt agaagacgcg 720
atttccttct ataactcggg aatgggagct atagcatga 759
权利要求
1、流产布鲁氏菌的重组菌，是将流产布鲁氏菌(Brucella abortus)中的perosamine合成酶(perosamine synthetase)的编码基因灭活得到的菌株。
2、 如权利要求1所述的重组菌，其特征在于所述perosamine合成酶(perosamine synthetase)是由序列表中的序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
3、 如权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于所述灭活是通过同源重组 实现的。
4、 如权利要求3所述的重组菌，其特征在于所述同源重组是将DNA片段DA14 导入所述流产布鲁氏菌(5n/ceWa a力or^ )实现的；所述DNA片段DA14从上游 至下游依次为同源臂DA14-1和同源臂DA14-2;所述同源臂DA14-1和同源臂DA14-2 能与所述流产布鲁氏菌基因组中perosamine合成酶(perosamine synthetase)编码基 因的上游序列和下游序列发生同源重组，灭活所述perosamine合成酶(perosamine synthetase)的编码基因。
5、 如权利要求4所述的重组菌，其特征在于所述同源臂DA14-l和同源臂 DA14-2的长度均为400-600bp。
6、 权利要求1至5中任一所述重组菌在制备布鲁氏菌疫苗中的应用。
7、 一种布鲁氏菌疫苗，其活性成分为权利要求1至5中任一所述的流产布鲁 氏菌的重组菌。
全文摘要
本发明公开了一种带有免疫标记的流产布鲁氏菌的重组菌。本发明提供的带有免疫标记的流产布鲁氏菌的重组菌，是将流产布鲁氏菌(Brucella abortus)中的perosamine合成酶的编码基因灭活得到的菌株。与出发菌株相比，本发明得到的菌株的毒力更小，无需灭活就可以作为疫苗免疫动物。使用本发明的菌株免疫小鼠，小鼠体内能够产生与标准菌株、现有疫苗菌株不同的免疫反应状态，通过动物血清的免疫学检测能够将患病动物从免疫动物群体中鉴别出来。本发明对布鲁氏菌病疫苗的改造、诊断鉴别试剂的研制，开发布鲁氏菌基因缺失标记疫苗和配套的鉴别诊断试剂，促进全球动物布鲁氏菌病的根除和净化具有十分重要的意义。
文档编号A61P31/04GK101386831SQ200810224818
公开日2009年3月18日 申请日期2008年10月22日 优先权日2008年10月22日
发明者婕 任, 刘文娟, 刘文晓, 吴清民, 张春燕, 娜 李, 羽 杨, 牛建蕊, 真 王, 王晓夏, 茜 赵 申请人:中国农业大学