专利名称：一种opn基因的克隆、表达与蛋白纯化方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种骨桥蛋白(OPN)基因的克隆、表达与蛋白纯化方法。
背景技术：
骨桥蛋白(osteopontin,0PN)于1983年由Herring等在骨基质中分离出来,是一种具有多种功能分泌型钙结合磷酸化糖蛋白。OPN属于小整合素结合配体N端联接糖蛋白家方矣(small integrin binding ligand, N-Iingked glycoproteins ,SIBLING)中的一员，其相对分子量约为41-75 kD。人类OPN基因定位于4ql3，是一个独立编码基因，由7个外显子和6个内含子组成。已经发现，其外显子有3个单核苷酸多态性(SNPs)区域，其中2个、分别位于6号和7号外显子，另一个位于7号外显子翻译区。人的OPN分子一般由信号肽序列、7-10个连续ASP序列、GRGDS (甘氨酸-精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-丝氨酸)结构域、α 9β I、α 4β I结构域和肝素结合结构域构成。研究表明，OPN参与了胰腺癌，宫颈癌，前列腺癌等癌症的发生、转移，尤其引人关注的是，近年研究发现，OPN在胰腺癌肿瘤细胞中呈高表达，并与胰腺癌的侵袭和转移密切相关，胰腺癌是一种恶性程度很高的肿瘤，在美国占癌症死亡原因的第五位，其发病率和死亡率几乎相同，未经治疗者一年生存率大约20%，5年生存率不到4%。在我国，胰腺癌发病率呈逐步上升趋势，是导致人口死亡的十大恶性肿瘤之一。研究表明，侵袭(invasion)和转移(metastasis)是目前胰腺癌患者治疗失败的主要原因。因此，OPN蛋白的表达纯化用于研究和治疗胰腺癌已成为近年来的热点。由于OPN蛋白主要为分泌型蛋白，在细胞外作用，含量极少，因此从生物体中直接纯化得率低，纯度不高，操作繁琐，成本也较高。
发明内容
本发明提供一种克隆、表达、分离纯化骨桥蛋白(osteopontin, 0ΡΝ)的方法,该方法包括如下步骤
(1)重组克隆载体TA-OPN的构建；
(2)重组表达质粒pET-28a(+)-0PN的构建；
(3)OPN蛋白的诱导表达与鉴定；
(4)OPN蛋白的纯化和鉴定。具体地，上述方法步骤(I)分为如下步骤
(I)OPN的引物设计
以pET28a (+) -OPN为模板，通过拼接PCR扩增0ΡΝ，设计出4条引物OPNp I、0PNp2、0PNpl-G-3，、 0PNp2-G-5，。上游引物OPNpl含有内切酶位点I，下游引物mE7p2含有内切酶位点历·/ (!III,OPNpl :5’ -CGCATATGGCTAGCATGACTGGTGGA-3’
OPNpI-G-3’ 5’ -TAATTGCTCATAACCGTAGAGATCAGTTG-3’
0PNp2-G-5’ 5’ -CAACTGATCTCTACGGTTATGAGCAATT-3’
0PNp2 :5’ -CGAAGCTTTTAGATGGGGCACACAATTC-3>
(2)拼接PCR扩增OPN基因片段 以pET28a (+) -OPN为模板，通过拼接PCR扩增OPN基因片段，先扩增Nde I与OPN基因第76碱基中间的片段(138bp，称为I-OPN84)和OPN基因第56-297位碱基序列(称为OPN56^297)ο PCR反应体系(Pyrobest 酶):41. 25 μ L无菌水，5 μ L IOXbuffer(含MgCl2), I μ LIOmM dNTPs,I μ L OPNpl/OPNpl-G-3’，I μ L 0PNp2_G_5，/0ΡΝρ2，0· 5 μ L pET28a(+)-OPN,O. 25 μ L Pyrobest酶，混匀后立即进行扩增，反应条件为94°C预变性3min ;然后进行以下35 个循环94°C 45s, 56°C lmin,72°C 45s ;最后在 72°C延伸 3min。上述PCR产物用1%琼脂糖凝胶90V恒压电泳20min，切胶后用胶回收试剂盒回收目的片段，再拼接PCR扩增I-OPN序列。PCR反应体系(Pyrobest酶)39. 75μ L无菌水，5 μ L IOXbuffer (含 MgCl2), IyL IOmM dNTPs, I μ L OPNpl, I μ L 0PNp2, ImL NdeI-OPN84,1 μ L 0ΡΝ56_297，O. 25 μ L Pyrobest酶，混匀后立即进行扩增。反应条件为94°C预变性3min ;然后进行以下35个循环94°C 45s, 56°C lmin，72°C 45s ;最后在72°C延伸3min。琼脂糖凝胶电泳、胶回收DNA片段，为便于用Taq酶延伸加A，胶回收的洗脱缓冲液使用含MgCl2的Taq酶缓冲液，用25 μ L胶回收洗脱缓冲液洗脱PCR扩增的DNA片段，取13. 7μ L 的胶回收洗脱液，加入 I. 2μ L IOmM dOTl^PO.lyL Taq 酶，72°C 延伸 6min，PCR 产物延伸A。(3) TA克隆连接
取I μ L PMD18-T载体，加入2 μ L延伸过A的OPN片段，再加入5 μ L的连接缓冲液，2 μ L无菌水补足至10 μ L体系，于16°C连接2hr。(4) TA克隆转化
将上述TA连接产物IOyL转移到DH5a感受态细胞中；冰上静置30min ；42 °C热激90s ;冰上再静置5min ;加入800 μ L LB, 37 V摇床120rpm摇lhr ；4000rpm离心3min ;在超净台中移去大部分上清，轻悬沉淀，涂布于含50 μ g/mL氨节青霉素(Amp)的LB (Luria-Bertani)平板中；LB平板倒置于37°C培养箱培养过夜。(5) TA克隆的鉴定
随机挑取4个TA阳性克隆，接入4mL LB (Amp+)中；37°C摇床220rpm摇过夜；抽提质粒ΤΑ-0ΡΝ，保存于-80°C，并进行双酶切和PCR鉴定，选取双酶切和PCR都为阳性的TA克隆质粒测序。具体地，上述方法步骤(2)具体分为如下步骤
(O酶切与回收
OPN基因序列中有I酶切位点(0ΡΝ上游引物中引入)，用I/Hind III双酶切TA-OPN及pET-28a(+)质粒，用1%琼脂糖凝胶电泳，胶回收目标片段。(2 ) T4 DNA连接酶连接及转化
连接体系为=IuL IOX连接酶缓冲液，lμL双酶切pET-28a(+)质粒，7 μ L OPN片段，IuL Τ4 DNA连接酶，16°C连接过夜。
将连接产物转入DH5a感受态，转化后涂布于含50 μ g/mL卡那霉素(Kan)的LB平板上，37 °C倒置培养过夜。(3)阳性克隆鉴定
随机挑取4个阳性克隆，接入4mL的LB (Kan+)中；37°C摇床220rpm摇过夜；抽提质粒进行双酶切(&oR l/Η η III)和PCR鉴定。具体地，上述方法步骤(3)具体分为如下步骤
(I)重组质粒转化大肠杆菌
将上述鉴定为阳性的重组质粒pET_28a(+) -OPN转入感受态Rosetta，涂布于LB平板(Kan+)上，37°C倒置培养过夜。(2)异丙基硫代半乳糖昔(IPTG)诱导蛋白表达
挑单克隆于LB (Kan+)中，37°C摇床，220rpm培养过夜，以1:50接过夜菌于20 mL LB(Kan+)中，继续培养3hr左右，OD6tltol达到O. 6-0. 8时加入IPTG至ImM诱导蛋白表达，分别于 Ohr、lhr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr 后收集 ImL 菌液。(3)聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定
取ImL菌液12000rpm离心Imin收集菌体,加入100 μ L的I X上样缓冲液,煮沸5min,冷却后12000rpm离心lmin,取10 μ L样品进行12% SDS-PAGE,电泳条件为18mA, I. 5hr。取下凝胶在考马斯亮蓝染液中摇动染色lhr，移入洗脱液中摇动洗脱过夜。观察诱导前后蛋白条带的变化，结果显示诱导4hr后蛋白表达到达高峰。
具体地，上述方法步骤(4)具体分为如下步骤
(I)OPN蛋白的诱导表达
将过夜培养已转入pET-28a(+)-OPN的Rosseta菌液以1:50接于IL LB(Kan+)中，37 °C摇床，220rpm培养2hr左右，OD600nm达到O. 6-0. 8时，加入IPTG至ImM，继续诱导培养4hr，4°C, 7000rpm离心6min，收集菌体，-8CTC保存。(2)细菌蛋白表达形式的分析
-80°C冻存菌体按每克湿菌5-10mL的比例加入细菌裂解液(O. 5M NaCl, 20mM Tris,IOmM巯基乙醇，ImM PMSF,pH7. 9),超声破菌,4°C, 8000rpm离心20min,包涵体沉淀在底部，分别取上清、包涵体做SDS-PAGE，结果显示OPN蛋白主要存在于包涵体中。(3) OPN蛋白的纯化
超声破菌后，4°C，8000rpm离心20min，弃上清，沉淀用50mL溶液(O. 5M NaCl, 20mMTris, O. 5% Triton, ρΗ7· 9)超声洗漆一次；4°C, 8000rpm离心20min,弃上清。沉淀即包涵体加入 30mL 溶液(0.5M NaCl, 20mM Tris，6M 盐酸胍，ρΗ7· 9)，置 37°C溶解 2hr 以上。4°C，16000rpm离心20min，取上清上样至预先用O. 5M NaCl, 20mM Tris，6M盐酸胍，pH7. 9的溶液平衡好的镍柱，分别用溶液A、B、C (溶液A :0. 5M NaCl, 20mM Tris，5mM巯基乙醇，5mM咪唑，6M盐酸胍，ρΗ7· 9 ;溶液B : O. 5Μ NaCl, 20mM Tris，5mM巯基乙醇，5mM咪唑，8M尿素，ρΗ7· 9 ;溶液C :0. 5M NaCl, 20mM Tris，5mM巯基乙醇，20mM咪唑，8M尿素，pH7. 9)洗涤10个柱床体积，再用洗脱缓冲液(O. 5M NaCl, 20mM Tris, 5mM巯基乙醇，200mM咪唑，8M尿素，pH7. 9)洗脱，收集蛋白液，置4°C对I XPBS充分透析，40C，16000rpm离心20min，取上清液。收获的蛋白用SDS-PAGE进行纯度分析，结果显示纯化的蛋白分子量约为20kDa。(4) OPN蛋白的鉴定Western blot鉴定SDS_PAGE电泳结束后取下凝胶，电转到硝酸纤维素膜上(4°C，100V，lhr)，取膜，于室温用5%脱脂奶粉封闭2hr，加入鼠抗人OPN抗体，室温孵育2hr，用PBST洗膜3次，每次lOmin，加入羊抗鼠抗体室温孵育I. 5hr，再用PBST洗膜3次，每次IOmin,加入底物液显色，在暗室内显影、定影，结果显示约40kDa处出现了 OPN的目标条带。本发明还提供利用所述的骨桥蛋白基因的克隆、表达与蛋白纯化方法获得的骨桥蛋白在制备预防或治疗肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌和肝癌药物中的应用。本发明通过建立原核生物基因表达系统，可以大量表达OPN蛋白，并建立高纯度蛋白纯化流程，获得量多纯度高且制备方法简单可行的OPN蛋白。
具体实施例方式以下通过具体的实施例对本发明作进一步阐述。实施例I OPN某闵克降、表汰与蛋白钝化
I.重组克隆载体TA-OPN的构建
(1)OPN的引物设计
以pET28a (+) -OPN为模板，通过拼接PCR扩增0ΡΝ，设计出4条引物OPNp I、0PNp2、0PNpl-G-3，、 0PNp2-G-5，。上游引物OPNpl含有内切酶位点I，下游引物mE7p2含有内切酶位点历·/ (!III,
OPNpl :5’ -CGCATATGGCTAGCATGACTGGTGGA-3，
0PNpl-G-3’ 5’ -TAATTGCTCATAACCGTAGAGATCAGTTG-3’
0PNp2-G-5’ 5’ -CAACTGATCTCTACGGTTATGAGCAATT-3’
0PNp2 :5’ -CGAAGCTTTTAGATGGGGCACACAATTC-3>
(2)拼接PCR扩增OPN基因片段
以pET28a (+) -OPN为模板，通过拼接PCR扩增OPN基因片段，先扩增Nde I与OPN基因第76碱基中间的片段(138bp，称为I-OPN84)和OPN基因第56-297位碱基序列(称为OPN56^297)ο PCR反应体系(Pyrobest 酶):41. 25 μ L无菌水，5 μ L IOXbuffer(含MgCl2), I μ LIOmM dNTPs, I μ L OPNpl/OPNpl-G-3’，I μ L 0PNp2_G_5，/0ΡΝρ2，0· 5 μ L pET28a (+) -OPN,
O.25 μ L Pyrobest酶，混匀后立即进行扩增。反应条件为94°C预变性3min ;然后进行以下35 个循环94°C 45s, 56°C lmin,72°C 45s ;最后在 72°C延伸 3min。上述PCR产物用1%琼脂糖凝胶90V恒压电泳20min，切胶后用胶回收试剂盒回收目的片段，再拼接PCR扩增I-OPN序列。PCR反应体系(Pyrobest酶)39. 75μ L无菌水，5 μ L IOXbuffer (含 MgCl2), IyL IOmM dNTPs, I μ L OPNpl, I μ L 0PNp2, ImL NdeI-OPN84,1 μ L 0ΡΝ56_297，O. 25 μ L Pyrobest酶，混匀后立即进行扩增。反应条件为94°C预变性3min ;然后进行以下35个循环94°C 45s, 56°C lmin，72°C 45s ;最后在72°C延伸3min。琼脂糖凝胶电泳、胶回收DNA片段，为便于用Taq酶延伸加A，胶回收的洗脱缓冲液使用含MgCl2的Taq酶缓冲液。用25 μ L胶回收洗脱缓冲液洗脱PCR扩增的DNA片段，取13. 7μ L 的胶回收洗脱液，加入 I. 2μ L IOmM dOTl^PO.lyL Taq 酶，72°C 延伸 6min，PCR 产物延伸A。(3) TA克隆连接取I μ L PMD18-T载体，加入2 μ L延伸过A的OPN片段，再加入5 μ L的连接缓冲液，
2μ L无菌水补足至10 μ L体系，于16°C连接2hr。(4) TA克隆转化
将上述TA连接产物1(^1^转移到0册(1感受态细胞中；冰上静置30min ;42°C热激90s ;冰上再静置 5min ;加入 800 μ L LB, 37°C摇床 120rpm 摇 lhr ；4000rpm 离心 3min ;在超净台中移去大部分上清，轻悬沉淀，涂布于含50 μ g/mL氨节青霉素(Amp)的LB平板中；LB平板倒置于37°C培养箱培养过夜。
(5) TA克隆的鉴定
随机挑取4个TA阳性克隆，接入4mL LB (Amp+)中；37°C摇床220rpm摇过夜；抽提质粒ΤΑ-0ΡΝ，保存于-80°C，并进行双酶切和PCR鉴定，选取双酶切和PCR都为阳性的TA克隆质粒测序。2.重组表达质粒pET_28a(+)-OPN的构建 (O酶切与回收
OPN基因序列中有I酶切位点(0ΡΝ上游引物中引入)，用I/Hind III双酶切TA-OPN及pET-28a(+)质粒，用1%琼脂糖凝胶电泳，胶回收目标片段。(2 ) T4 DNA连接酶连接及转化
连接体系为=IuL IOX连接酶缓冲液，lμL双酶切pET-28a(+)质粒，7 μ L OPN片段，I μ L Τ4 DNA连接酶，16°C连接过夜；
将连接产物转入DH5 α感受态，转化后涂布于含50 μ g/mL卡那霉素(Kan)的LB平板上，37 °C倒置培养过夜。(3)阳性克隆鉴定
随机挑取4个阳性克隆，接入4mL的LB (Kan+)中；37°C摇床220rpm摇过夜；抽提质粒进行双酶切(&oR Ι/Η η III)和PCR鉴定。3. OPN蛋白的诱导表达与鉴定 (I)重组质粒转化大肠杆菌
将上述鉴定为阳性的重组质粒pET_28a(+) -OPN转入感受态Rosetta，涂布于LB平板(Kan+)上，37°C倒置培养过夜。(2) IPTG诱导蛋白表达
挑单克隆于LB (Kan+)中，37°C摇床，220rpm培养过夜，以1:50接过夜菌于20 mL LB(Kan+)中，继续培养3hr左右，OD6tltol达到O. 6-0. 8时加入IPTG至ImM诱导蛋白表达，分别于 Ohr、lhr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr 后收集 ImL 菌液。(3) SDS-PAGE 鉴定
取ImL菌液12000rpm离心Imin收集菌体,加入100 μ L的I X上样缓冲液,煮沸5min,冷却后12000rpm离心lmin,取10 μ L样品进行12% SDS-PAGE,电泳条件为18mA, I. 5hr。取下凝胶在考马斯亮蓝染液中摇动染色lhr，移入洗脱液中摇动洗脱过夜。观察诱导前后蛋白条带的变化，结果显示诱导4hr后蛋白表达到达高峰。4. OPN蛋白的纯化和鉴定 (I) OPN蛋白的诱导表达
将过夜培养已转入pET-28a(+)-OPN的Rosseta菌液以1:50接于IL LB(Kan+)中，37 °C摇床，220rpm培养2hr左右，OD600nm达到O. 6-0. 8时，加入IPTG至ImM，继续诱导培养4hr，4°C, 7000rpm离心6min，收集菌体，-8CTC保存。(2)细菌蛋白表达形式的分析
-80°C冻存菌体按每克湿菌5-10mL的比例加入细菌裂解液(O. 5M NaCl, 20mM Tris,IOmM巯基乙醇，ImM PMSF,pH7. 9),超声破菌,4°C, 8000rpm离心20min,包涵体沉淀在底部，分别取上清、包涵体做SDS-PAGE，结果显示OPN蛋白主要存在于包涵体中。(3) OPN蛋白的纯化
超声破菌后，4°C，8000rpm离心20min，弃上清，沉淀用50mL溶液(O. 5M NaCl, 20mMTris, O. 5% Triton, ρΗ7· 9)超声洗漆一次；4°C, 8000rpm离心20min,弃上清。沉淀即包涵体加入 30mL 溶液(0.5M NaCl, 20mM Tris，6M 盐酸胍，ρΗ7· 9)，置 37°C溶解 2hr 以上。4°C， 16000rpm离心20min，取上清上样至预先用O. 5M NaCl, 20mM Tris，6M盐酸胍，pH7. 9的溶液平衡好的镍柱，分别用溶液A、B、C (溶液A:0. 5M NaCl, 20mM Tris，5mM巯基乙醇，5mM咪唑，6M 盐酸胍，ρΗ7· 9 ;溶液 B: O. 5Μ NaCl, 20mM Tris，5mM 巯基乙醇，5mM 咪唑，8M 尿素，ρΗ7· 9 ;溶液C: O. 5Μ NaCl, 20mM Tris，5mM巯基乙醇，20mM咪唑，8M尿素，pH7. 9)洗涤10个柱床体积，再用洗脱缓冲液(O. 5M NaCl, 20mM Tris，5mM巯基乙醇，200mM咪唑，8M尿素，pH7. 9)洗脱，收集蛋白液，置4°C对I XPBS充分透析，40C，16000rpm离心20min，取上清液。收获的蛋白用SDS-PAGE进行纯度分析，结果显示纯化的蛋白分子量约为20kDa。(4) OPN蛋白的鉴定
Western blot鉴定SDS_PAGE电泳结束后取下凝胶，电转到硝酸纤维素膜上(4°C，100V，lhr)，取膜，于室温用5%脱脂奶粉封闭2hr，加入鼠抗人OPN抗体，室温孵育2hr，用PBST洗膜3次，每次lOmin，加入羊抗鼠抗体室温孵育I. 5hr，再用PBST洗膜3次，每次IOmin,加入底物液显色，在暗室内显影、定影，结果显示约40kDa处出现了 OPN的目标条带。实施例2 =OPN蛋白预防免疫抗肿瘤作用
I.5nmol蛋白(0ΡΝ蛋白，PBS组为对照)皮下免疫C57BL/6小鼠，两周后腹腔加强免疫I次，一周后皮下接种IXIO5PANc-I细胞(人胰腺癌细胞)(接种前，经胰酶消化，PBS洗涤2次)。之后每天观察肿瘤生长状况，12d后用游标卡尺测量肿瘤长径和垂直径(每3d测量I次)，持续观测直至对照组小鼠开始死亡为止，继续观察直到荷瘤小鼠全部死亡，记录其荷瘤情况及存活时间，结果全部PBS组小鼠长出了肿瘤，而OPN蛋白免疫组则有效地保护了小鼠不生成肿瘤。植瘤40d时未长瘤小鼠皮下再接种2 X IO5 PANC-I细胞，以未免疫小鼠作为对照组，之后每天观察肿瘤生长状况，直到对照组小鼠全部死亡，记录其荷瘤情况及存活时间，结果显示对照组小鼠6d后全部长瘤，而OPN蛋白免疫组50d后仍无瘤体生长。用同样的方法分别接种CCL_227(人结肠癌细胞)、0VCAR3 (人卵巢癌细胞)、NCI-H226 (人肺癌细胞系)，并观测和评估结果，发现对照组小鼠6d全部长瘤，而OPN蛋白免疫组30 50d后仍无瘤体生长。上述实验结果表明，用OPN蛋白免疫机体，可以有效预防肿瘤的发生。应当说明的是，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用于限制本发明的范围，凡在本发明的精神和原则之内所作出的任何修改、等同的替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种骨桥蛋白基因的克隆、表达与蛋白纯化方法，其特征在于，该方法包括如下步骤 (1)重组克隆载体TA-OPN的构建； (2)重组表达质粒pET-28a(+)-0PN的构建； (3)OPN蛋白的诱导表达与鉴定； (4)OPN蛋白的纯化和鉴定。
2.根据权利要求I所述的骨桥蛋白基因的克隆、表达与蛋白纯化方法，其特征在于，步骤(I)具体分为如下步骤 (1)OPN的引物设计 以pET28a (+) -OPN为模板，通过拼接PCR扩增0ΡΝ，设计出4条引物OPNp I、0PNp2、0PNpl-G-3，、 0PNp2-G-5，； 上游引物OPNpl含有内切酶位点I，下游引物mE7p2含有内切酶位点历id III， OPNpl :5’ -CGCATATGGCTAGCATGACTGGTGGA-3，0PNpl-G-3’ 5’ -TAATTGCTCATAACCGTAGAGATCAGTTG-3’0PNp2-G-5’ 5’ -CAACTGATCTCTACGGTTATGAGCAATT-3’0PNp2 :5’ -CGAAGCTTTTAGATGGGGCACACAATTC-3> ； (2)拼接PCR扩增OPN基因片段 以pET28a(+)-OPN为模板，通过拼接PCR扩增OPN基因片段，先扩增I与OPN基因第76碱基中间的片段和OPN基因第56-297位碱基序列； 上述PCR产物用琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，再拼接PCR扩增Nde I-OPN序列； (3)TA克隆连接 取I μ L pMD18-T载体，加入2 μ L延伸过A的OPN片段，再加入5 μ L的连接缓冲液，2 μ L无菌水补足至10 μ L体系，于16°C连接2hr ； (4)TA克隆转化 将上述TA连接产物10 μ L转移到DH5a感受态细胞中，冰上静置30min，42°C热激90s，冰上再静置5min ;加入800 μ L LB, 37。。摇床120rpm摇lhr, 4000rpm离心3min ;在超净台中移去大部分上清，轻悬沉淀，涂布于含50 μ g/mL氨苄青霉素的LB平板中，LB平板倒置于37 °C培养箱培养过夜； (5)TA克隆的鉴定 随机挑取4个TA阳性克隆，接入4mL含氨苄青霉素LB中；37°C摇床220rpm摇过夜；抽提质粒ΤΑ-0ΡΝ，保存于-80°C，并进行双酶切和PCR鉴定，选取双酶切和PCR都为阳性的TA克隆质粒测序。
3.根据权利要求I所述的骨桥蛋白基因的克隆、表达与蛋白纯化方法，其特征在于，步骤(2)具体分为如下步骤 (1)酶切与回收 OPN基因序列中有&oR I酶切位点，用&oR I/Nind III双酶切ΤΑ-0ΡΝ及pET_28a(+)质粒，用1%琼脂糖凝胶电泳，胶回收目标片段； (2)T4 DNA连接酶连接及转化 将OPN片段和T4 DNA连接酶在连接体系中16°C连接过夜，将连接产物转入DH5 α感受态，转化后涂布于含50 μ g/mL卡那霉素的LB平板上，37°C倒置培养过夜； (3)阳性克隆鉴定 随机挑取4个阳性克隆，接入4mL的含卡那霉素LB板中，37°C摇床220rpm摇过夜，抽提质粒进行双酶切I/Hind III和PCR鉴定。
4.根据权利要求I所述的骨桥蛋白基因的克隆、表达与蛋白纯化方法，其特征在于，步骤(3)具体分为如下步骤 (1)重组质粒转化大肠杆菌 将上述鉴定为阳性的重组质粒pET_28a(+) -OPN转入感受态Rosetta，涂布于含卡那霉素的LB平板上，37 °C倒置培养过夜； (2)IPTG诱导蛋白表达 挑单克隆于含卡那霉素LB中，37°C摇床，220rpm培养过夜，以1:50接过夜菌于20 mL含卡那霉素LB板中，继续培养3hr左右，OD6tltol达到O. 6 O. 8时加入IPTG至ImM诱导蛋白表达，分别于Ohr、lhr、2hr、3hr、4hr、5hr、6hr后收集ImL菌液；(3)SDS-PAGE 鉴定 取ImL菌液12000rpm离心Imin收集菌体,加入100 μ L的I X上样缓冲液,煮沸5min,冷却后12000rpm离心lmin，取10 μ L样品进行12%聚丙烯酰胺凝胶电泳，取下凝胶在考马斯亮蓝染液中摇动染色lhr，移入洗脱液中摇动洗脱过夜，观察诱导前后蛋白条带的变化，结果显示诱导4hr后蛋白表达到达高峰。
5.根据权利要求I所述的骨桥蛋白基因的克隆、表达与蛋白纯化方法，其特征在于，步骤(4)具体分为如下步骤 (1)OPN蛋白的诱导表达 将过夜培养已转入pET_28a (+) -OPN的Rosseta菌液以1:50接于IL含卡那霉素LB中，37°C摇床，220rpm培养2hr左右，OD6tltlnm达到O. 6-0. 8时，加入IPTG至ImM，继续诱导培养4hr, 4°C, 7000rpm离心6min,收集菌体，-8CTC保存； (2)细菌蛋白表达形式的分析 -80°C冻存菌体按每克湿菌5-10mL的比例加入细菌裂解液，超声破菌，4°C，8000rpm离心20min，包涵体沉淀在底部，分别取上清、包涵体做SDS-PAGE，结果显示OPN蛋白主要存在于包涵体中； (3)OPN蛋白的纯化 超声破菌后，4°C，8000rpm离心20min，弃上清，沉淀用50mL溶液超声洗涤一次；4°C，8000rpm离心20min，弃上清，沉淀即包涵体加入30mL溶液，置37°C溶解2hr以上；4°C，16000rpm离心20min，取上清上样至预先用O. 5M NaCl, 20mM Tris，6M盐酸胍，pH7. 9的溶液平衡好的镍柱，分别用三种溶液洗涤10个柱床体积，再用洗脱缓冲液洗脱，收集蛋白液，置4°C对I XPBS充分透析，40C，16000rpm离心20min，取上清液；收获的蛋白用SDS-PAGE进行纯度分析； (4)OPN 蛋白的 Western blot 鉴定 SDS-PAGE电泳结束后取下凝胶，电转到硝酸纤维素膜上，取膜，于室温用5%脱脂奶粉封闭2hr，加入鼠抗人OPN抗体，室温孵育2hr，用PBST洗膜3次，每次lOmin，加入羊抗鼠抗体室温孵育I. 5hr，再用PBST洗膜3次，每次lOmin，加入底物液显色，在暗室内显影、定影。
6.根据权利要求5所述的骨桥蛋白基因的克隆、表达与蛋白纯化方法，其特征在于，步骤(3)中所述的三种溶液分别为，溶液A :0. 5M NaCl, 20mM Tris，5mM巯基乙醇，5mM咪唑，6M盐酸胍，ρΗ7· 9 ;溶液B : O. 5Μ NaCl, 20mM Tris，5mM巯基乙醇，5mM 咪唑，8M尿素，ρΗ7· 9 ;溶液 C:0. 5M NaCl, 20mM Tris，5mM 巯基乙醇，20mM 咪唑，8M 尿素，ρΗ7· 9。
7.利用权利要求I 6中任一项所述的骨桥蛋白基因的克隆、表达与蛋白纯化方法制得的骨桥蛋白在制备预防或治疗肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌或肝癌药物中的应用。
全文摘要
本发明提供一种用原核细胞表达系统表达了OPN蛋白的方法首先构建OPN的克隆载体TA-OPN和表达载体pET-28a(+)-OPN，并原核表达、分离纯化了OPN蛋白。利用该方法制备骨桥蛋白具有产量高、纯度好、成本较低的优点。本发明还提供利用所述的骨桥蛋白基因的克隆、表达与蛋白纯化方法获得的骨桥蛋白在制备预防或治疗肠癌、胰腺癌、卵巢癌、肺癌和肝癌药物中的应用。
文档编号C07K1/36GK102719470SQ20121023573
公开日2012年10月10日 申请日期2012年7月10日 优先权日2012年7月10日
发明者张峰, 梁静, 蒋晟, 陈爱萍, 顾传虎 申请人:南京新港医药有限公司