用于天然彩色新品种蚕鉴定的丝蛋白肽段及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种用于天然彩色新品种蚕鉴定的丝蛋白肽段，其基因序列包括家蚕丝H链非结晶区基因、H链结晶区与非结晶区的重组基因以及柞蚕、天蚕蚕丝H链基因；还公开了该种丝蛋白肽段的制备方法，具体包括家蚕品种蚕丝非结晶区基因的克隆、表达载体构建与表达，家蚕品种蚕丝结晶区与非结晶区重组基因的克隆、表达载体构建与表达，天然彩色茧品种蚕丝基因的克隆、表达载体构建与表达。该方法简单易行，序列准确无误，构建的表达载体没有发生基因突变或缺失，保证了表达产物不会发生三联码的错配或个别氨基酸错误，获得的产物用于进一步制备高精确度的蚕丝抗体。目前还没有来自于家蚕白色丝品种(丝素非结晶区及结晶区/非结晶区单元的)和柞蚕黄色丝或天蚕绿色丝品种的肽段制备的报导。
【专利说明】用于天然彩色新品种蚕鉴定的丝蛋白肽段及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，具体涉及一种用于蚕品种鉴定抗体制备的丝蛋白肽段 (抗原）及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 蚕丝丝素（以下简称丝素）蛋白属于天然动物蛋白纤维，是一种结构蛋白，由结晶 态和无定形态两大部分组成。丝素蛋白包括家蚕丝和野蚕丝（柞蚕丝、天蚕丝等）。家蚕 丝素是重链（H链）蛋白、丝素轻链（L链）蛋白和糖蛋白P25三个部分组成的复合体，柞蚕 丝、天蚕丝丝素由Η链组成。
[0003] 家蚕丝素由于来源丰富，数十年来也是研究的热点，学者对其结构、性能及生物材 料应用方面进行了大量的研究，然而，有关野蚕丝素方面的研究国内外报道极少，如天蚕丝 素、柞蚕丝素等天然彩色丝素。天蚕丝、柞蚕丝是天然彩色蚕丝的代表，天然彩色丝是一种 绿色产品，对减少环境污染，促进人类健康非常有利。具有天然淡黄色的柞蚕丝在日本市场 及欧洲市场上极受欢迎。目前，国际市场的天然有色昆虫丝十分紧缺，以黄色野蚕丝为例， 价格是白色蚕丝的3-30倍。天然彩色黄茧或绿茧茧丝中含有的黄酮类化合物，来自于食用 的桑叶，因此不仅具有白色蚕丝良好的吸湿性、放湿性、保暖性和透气性丝，还具有良好的 抑菌功效和抗氧化的阻挡紫外线的功能，能有效地防止因环境污染引起人体内发生氧化作 用所造成的危害。除此，天蚕丝素、柞蚕丝素等天然彩色丝素蛋白肽链上含有一种特殊的序 列：精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸（RGD)三肽序列，这种R⑶三肽序列广泛存在于胶原蛋白、 粘着蛋白等细胞外基质中，有助于细胞粘附，促使帖壁细胞粘附生长，可以作为医疗领域组 织修复选用的最佳材料之一。因此，选育彩色茧实用品种，并及时进行大规模生产开发，具 有非常诱人的商业前景，将大大推动新型蚕品种的开发力度和开拓蚕丝业发展的新局面。
[0004] 但由于天蚕、柞蚕等天然彩色茧蚕品种难以饲养，蚕丝来源比较稀少，所以应用极 其稀少，而且目前我们研究的天然黄色家蚕丝的色素主要存在于丝胶中。
[0005] 已经研究证实天蚕、柞蚕等天然彩色丝的色素来自于桑叶，而且摄入家蚕体内的 黄酮物质是否能够从消化管进入血液、从血液进入丝腺，受到消化管和丝腺上皮细胞的透 过性影响，即受到色素生成及运输的基因的控制。目前已有多种色茧基因已被鉴定，我们将 在分子育种时可以导入茧色相关基因，培育出具有稳定遗传的色素生成及运输控制基因的 蚕品种，使合成与分泌的蚕丝具有天然色素。另外色茧基因一经鉴定，可以通过分子生物学 技术克隆可能的相关基因进行遗传杂交品种的筛选，选育出理想的天然彩色茧蚕品种，制 备不含任何化学成分的来自于天然植物并在蚕体内经修饰过的天然彩色蚕丝一新世纪的 绿色纤维及其产品。
[0006] 研究开发基于白色丝家蚕和柞蚕、天蚕等天然彩色丝等品种蚕的优良易饲养、稳 定遗传的天然彩色家蚕品种，品种育成后，我们必须对其产品（茧丝）进行分子鉴定，以 确定合成与分泌的蚕丝具有杂交优势的蛋白质，但目前还没有方法能从分子水平上进行鉴 定。
【发明内容】
[0007] 针对目前的研究现状，本发明主要解决的技术问题是提供一种用于天然彩色蚕品 种鉴定抗体制备的丝蛋白肽段及其制备方法，通过对白色茧丝的家蚕和天然彩色茧丝的柞 蚕、天蚕等丝素蛋白基因的分析，克隆了源于蚕新品种亲本的典型的肽段基因序列，包括家 蚕丝Η链非结晶区基因、Η链结晶区与非结晶区的重组基因；柞蚕、天蚕蚕丝Η链基因；构建 了大肠杆菌表达载体，获得了相应肽段的表达产物（蚕丝蛋白肽段-用于抗体制备相应的 抗原）。获得的产物用于进一步制备高精确度的蚕丝抗体。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：
[0009] -种用于天然彩色蚕品种鉴定抗体制备的丝蛋白肽段，其基因序列包括家蚕丝Η 链非结晶区基因、Η链结晶区与非结晶区的重组基因以及天然彩色茧柞蚕、天蚕蚕丝Η链基 因。
[0010] 所述的家蚕丝Η链非结晶区基因的非重复序列肽段的编码基因序列为 SGFGPYVANGGYSGYEYAffSSESDFAG 〇
[0011] 所述的天蚕丝素蛋白重链氨基酸编码基因序列为SGAGGRGDGGYGSGSSG(-RGD-)。
[0012] 所述的丝蛋白肽段的制备方法，具体包括家蚕品种蚕丝非结晶区基因的克隆、表 达载体构建与表达，家蚕品种蚕丝结晶区与非结晶区重组基因的克隆、表达载体构建与表 达，天然彩色茧品种蚕丝基因的克隆、表达载体构建与与表达。
[0013] 一、家蚕品种蚕丝非结晶区基因的克隆、表达载体构建与表达，包括以下步骤：
[0014] A、根据丝素蛋白主要组成部分的重链核心区域非结晶区氨基酸序列（图1)及其 编码基因信息，设计并合成（Invitrogen公司）了非重复序列肽段SGFGPYVANGGYSGYEYAWS SESDFAG(F(1))的编码基因序列。基因序列的5'端和3'端分别含有Hindlll和Bglll的 粘末端碱基，紧接其5'粘末端下游设计了限制性核酸内切酶NgoMIV的识别位点，紧接3' 粘末端上游设计了限制核酸性内切酶Agel的识别位点，后2个酶切位点用于与结晶区基因 进行重组。选择实验室保存的含常用多克隆位点的基础质粒来完成非结晶区基因序列的克 隆，用限制性核酸内切酶Bglll/Hindlll消化pSLFA1180FA(如图1)，插入设计合成的含有 Bglll和Hindlll的粘末端非结晶区基因序列，T4DNA连接酶连接后得到含有完整非结晶区 编码基因的质粒pSL-F(l)。
[0015] B、实验室保存有pGEX-Agel载体，由pGEX-KG经过改造加入了限制性核酸内切酶 Agel 位点（王建南，等。MaterialsScienceandEngineeringC, 2014, 34:429 - 436)。Agel/ HindllI酶切pGEX-Agel载体回收载体片段，Agel/HindllI酶切质粒pSL-F (1)回收插入片 段，T4DNA连接酶连接构建含有非结晶区肽段基因的表达载体表示为pGEX-F(l)。
[0016] C、构建的表达载体表达外源蛋白时具有谷胱甘肽S-转移酶（GST)的标签，表达的 产物融合蛋白记为GST-F(l)。将构建的表达载体pGEX-F(l)转入大肠杆菌BL21菌细胞， 加入0-1. 2mM的诱导剂异丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度转速200rpm/min的 空气摇床中诱导培养0-8小时。然后用4100rpm/min的速度离心收集表达GST融合蛋白的 BL21菌细胞。
[0017] D、菌细胞用适量的磷酸盐缓冲液（4. 3mMNa2HP04,1. 47mMKH2P04,137MmNaCl， 2. 7MmKCl，pH7. 3)重悬，置于冰上超声破碎后13300r/min的速度离心lOmin，收集上清 液。取少量上清液加入蛋白质电泳上样缓冲液，打匀、煮沸5min，13300r/min的速度离心 lOmin，用微量移液器取出10ul的上清液样品注入聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，最后当溴 酚蓝指示剂到达距凝胶底部lcm左右的位置时，结束电泳。
[0018] E、将超声破碎后收集的上清液用GST亲和层析柱纯化，获得了纯度较高的融合蛋 白GST-F(l)。纯化后收集的各管融合蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。
[0019] F、采用葡聚糖G-50分子筛去除GST亲和层析过程中的还原型谷胱甘肽后，融合 蛋白经凝血酶酶切，再经GST亲和层析柱纯化获得设计所需要的源于家蚕蚕丝蛋白的多肽 F(l) (TGSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFAGKLDSS)(由于酶切位点的需要，目的肽段的首末段 增加了几个氨基酸）。
[0020] 二、家蚕品种蚕丝结晶区与非结晶区重组基因的克隆、表达载体构建与表达，包括 以下步骤：
[0021] A、课题组设计并构建保存了四种丝素结晶区的典型肽段[GAGAGX] 16的基因序列 载体（王建南，等.蚕业科学，2006, 32(1) :36-41)。在（GS) 16基因序列的5'有限制性核 酸内切酶Agel的结合位点，前面家蚕丝非结晶区F(l)的基因序列的5'和3'端分别设计 了限制性核酸内切酶NgoMIV和Agel的结合位点。用Agel酶切（GA) 16的质粒插入NgoMIV 和Agel酶切获得的F(l)的基因序列，Agel和NgoMIV是同尾酶，连接后F(l)3'的酶切位 点消失，形成Ala和Gly，是丝素蛋白核心区域中最富有的2种氨基酸。同时完成了家蚕品 种蚕丝结晶区与非结晶区重组基因的克隆，使用的克隆载体为课题组冻存的pCDNA-2(王 建南，等.蚕业科学，2006,32(1):36-41)，构建的质粒为为？〇)嫩1 816€1。
[0022] B、用核酸限制性内切酶Agel/Hindlll消化质粒pGEX-Agel回收条带作为载体片 段，同时用相同的内切酶Agel/Hindlll消化上述构建好的结晶区肽段与非结晶区肽段的 重组质粒，并回收目的肽段编码基因序列作为插入片段，T4DNA连接酶连接后构建pGEX系 列表达载体，即 pGEX-gsl6fl，编码的氨基酸序列为 GAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAG SGAGAGSGAGAGSGAG, AGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGSGFGPYVANGGYSGYEYA WSSESDFAG(GS16F1)。
[0023] C、构建的表达载体表达外源蛋白时具有GST的标签，表达的产物融合蛋白记为 GST-GS16F1。将构建的表达载体pGEX-gsl6f 1转入大肠杆菌BL21菌细胞，加入0-1. 2mM的 诱导剂异丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度转速200rpm/min的空气摇床中诱导培 养0-8小时。然后用4100rpm/min的速度离心收集表达GST融合蛋白的BL21菌细胞。
[0024] D、菌细胞用适量的磷酸盐缓冲液（4. 3mMNa2HP04,1. 47mMKH2P04,137MmNaCl， 2. 7MmKCl，pH7. 3)重悬，置于冰上超声破碎后13300r/min的速度离心10min，收集上清 液。取少量上清液加入蛋白质电泳上样缓冲液，打匀、煮沸5min，13300r/min的速度离心 l〇min，用微量移液器取出10ul的上清液样品注入聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，最后当溴 酚蓝指示剂到达距凝胶底部lcm左右的位置时，结束电泳。
[0025] E、将超声破碎后收集的上清液用GST亲和层析柱纯化，获得了纯度较高的融合蛋 白GST-GS16F1。纯化后收集的各管融合蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。
[0026] F、采用葡聚糖G-50分子筛去除GST亲和层析过程中的还原型谷胱甘肽后，融合蛋 白经凝血酶酶切，再经GST亲和层析柱纯化获得设计所需要的源于蚕丝蛋白的多肽GS16F1 (TGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAG SGAGAGSGAGAGSGAGSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFAGKL)。
[0027] 三、天然彩色茧品种蚕丝基因的克隆、表达载体构建与表达，包括以下步骤：
[0028] A、根据天蚕丝素蛋白重链氨基酸序列特征及其编码基因信息，设计并合成 (Invitrogen公司）了 SGAGGRGDGGYGSGSSG(-RGD-) "的编码基因序列，设计的基因序列具有 以下特点：5'端设计了限制性核酸内切酶Agel，用来把合成的"-RGD-"基序克隆入含多克 隆位点的质粒。5'端下游限制性核酸内切酶Bglll与3'端的BamHI是一对同尾酶，用于 单倍"-RGD-"基序的加倍。选择实验室保存的含常用多克隆位点的基础质粒pSLFA1180FA 来完成"-1?0-"基序的克隆。质粒？51^4118(^4含有4861、88111、8&111!113(3〇1?1等酶切位 点。"-RGD-"基因克隆的具体步骤为：用设计的5'端限制性核酸内切酶Agel和BamHI消 化PSLFA1180FA质粒，然后采用琼脂糖凝胶电泳回收消化产物中的大片段，与设计合成的 "-RGD-"基因混合，用T4连接酶连接得到pSL-AYRl。
[0029] B、用限制性核酸内切酶Bglll/EcoRI消化质粒pSL-AYRl，琼脂糖凝胶电泳回收 的小片段插入到BamHI/EcoRI消化同一质粒pSL-AYRl获得的载体中，T4连接酶连接构建 PSL-AYR2,获得设计的"-RGD-"基因序列加倍。连接后同尾酶的位点Bglll和BamHI均消 失，形成了甘氨酸Gly和丝氨酸Ser的密码子。采用同样的方法加倍获得4倍设计序列的 基因克隆质粒PSL-AYR4。
[0030] C、用核酸限制性内切酶Agel/BamHI消化质粒PSL-AYR4回收AYR4的基因片段， 插入Agel/BamHI消化的课题组保存的pCDNA-2质粒中pCDNA-AYR4,构建，然后采用Agel/ Hindlll消化pGEX-Agel回收条带作为载体片段，同时用相同的内切酶Agel/Hindlll消化 p⑶NA-AYR4,并回收目的肽段编码基因序列作为插入片段，T4DNA连接酶连接后构建pGEX 系列表达载体，即 PGEX-AYR4,编码的相应肽段为 SGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSGS GAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSG(RGD4)。
[0031] D、构建的表达载体表达外源蛋白时具有GST的标签，表达的产物融合蛋白记为 GST-RGD4。将构建的表达载体pGEX-AYR4转入大肠杆菌BL21菌细胞，加入0-1. 2mM的诱导 剂异丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度转速200rpm/min的空气摇床中诱导培养 0-8小时。然后用4100rpm/min的速度离心收集表达GST融合蛋白的BL21菌细胞。
[0032] E、菌细胞用适量的磷酸盐缓冲液（4. 3mMNa2HP04,1. 47mMKH2P04,137MmNaCl， 2. 7MmKCl，pH7. 3)重悬，置于冰上超声破碎后13300r/min的速度离心lOmin，收集上清 液。取少量上清液加入蛋白质电泳上样缓冲液，打匀、煮沸5min，13300r/min的速度离心 lOmin，用微量移液器取出10ul的上清液样品注入聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，最后当溴 酚蓝指示剂到达距凝胶底部lcm左右的位置时，结束电泳。
[0033] F、将超声破碎后收集的上清液用GST亲和层析柱纯化，获得了纯度较高的融合蛋 白GST-RGD4。纯化后收集的各管融合蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定。
[0034] G、采用葡聚糖G-50分子筛去除GST亲和层析过程中的还原型谷胱甘肽后，融合蛋 白经凝血酶酶切，再经GST亲和层析柱纯化获得设计所需要的源于蚕丝蛋白的多肽RGD4(G STGRSGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSGS)(由 于加倍策略的需要设计了相应的限制性核酸内切酶位点，所以RGD4的第一个氨基酸出现 在全部序列的最后，其余部分与设计的基序完全相同）。
[0035] 本发明的有益效果是：设计了源于家蚕亲本之一蚕丝的典型肽段基因，源于另一 亲本天蚕或柞蚕等天然彩色蚕丝的典型肽段基因，基因片段两端设计与选择的表达载体相 适的限制性内切酶位点，克隆并采用原核表达系统制备了相应的各亲本蚕丝的抗原。方法 简单易行，序列准确无误，构建的表达载体没有发生基因突变或缺失，保证了表达产物不会 发生三联码的错配或个别氨基酸错误，获得的产物用于制备精确度高的蚕丝抗体进行天然 彩色新品种蚕的鉴定。
【专利附图】
【附图说明】
[0036] 图1是本发明用的基础质粒PSLFA1180FA示意图。
[0037] 图2是家蚕品种蚕丝非结晶区基因表达载体融合蛋白GST-F⑴表达情况。
[0038] 其中，laneM:蛋白质分子量标准；lanel :不含有表达载体的BL21菌细胞总蛋白； lane2 :含有表达载体但不携带外源蛋白基因的BL21菌细胞总蛋白；lane3 :含有GST-F1的 BL21菌细胞总蛋白。图中的泳道3出现的一条宽且色深的条带即为表达获得的融合蛋白 GST-F ⑴。
[0039] 图3是家蚕品种蚕丝非结晶区基因表达载体纯化后的融合蛋白GST-F(l)的
[0040] 表达情况。
[0041] 图4是家蚕品种蚕丝结晶区与非结晶区重组基因表达载体融合蛋白
[0042] GST-GS16F1 表达情况。
[0043] 其中laneM:蛋白质分子量标准；lanel :不含有表达载体的BL21菌细胞总蛋 白；lane2 :含有表达载体但不携带外源蛋白基因的BL21菌细胞总蛋白；lane3 :含有 GST-GS16F1的BL21菌细胞总蛋白.图中的泳道3出现的一条宽且色深的条带即为表达获 得的融合蛋白GST-GS16F1。
[0044] 图5是家蚕品种蚕丝结晶区与非结晶区重组基因的表达载体纯化后融合蛋白 GST-GS16F1表达情况。
[0045] 图6是天然彩色茧品种蚕丝基因的表达载体融合蛋白GST-RGD4表达情况。
[0046] 其中，laneM:蛋白质分子量标准；lanel :含有GST-RGD4的BL21菌细胞总蛋白。 图中的泳道1出现的一条宽且色深的条带即为表达获得的融合蛋白GST-RGD4。
[0047] 图7是天然彩色茧品种蚕丝基因的表达载体纯化后融合蛋白GST-RGD4表达情况。
【具体实施方式】
[0048] 实施例
[0049] 家蚕品种蚕丝非结晶区基因的克隆、表达载体构建与表达，包括以下步骤：
[0050] A、根据丝素蛋白主要组成部分的重链核心区域非结晶区氨基酸序列（图1)及其 编码基因信息，设计并合成（Invitrogen公司）了非重复序列肽段SGFGPYVANGGYSGYEYAWS SESDFAG(F(1))的编码基因序列。基因序列的5'端和3'端分别含有Hindlll和Bglll的 粘末端碱基，紧接其5'粘末端下游设计了限制性核酸内切酶NgoMIV的识别位点，紧接3' 粘末端上游设计了限制核酸性内切酶Agel的识别位点，后2个酶切位点用于与结晶区基因 进行重组。选择实验室保存的含常用多克隆位点的基础质粒来完成非结晶区基因序列的克 隆，用限制性核酸内切酶Bglll/Hindlll消化pSLFA1180FA(如图1)，插入设计合成的含有 Bglll和Hindlll的粘末端非结晶区基因序列，T4DNA连接酶连接后得到含有完整非结晶区 编码基因的质粒pSL-F(l)。
[0051] B、实验室保存有pGEX-Agel载体，由pGEX-KG经过改造加入了限制性核酸内切 酶Agel位点。Agel/Hindlll酶切pGEX-Agel载体回收载体片段，Agel/Hindlll酶切质粒 pSL-F(l)回收插入片段，T4DNA连接酶连接构建含有非结晶区肽段基因的表达载体表示为 pGEX-F ⑴。
[0052] C、构建的表达载体表达外源蛋白时具有谷胱甘肽S-转移酶（GST)的标签，表达的 产物融合蛋白记为GST-F(l)。将构建的表达载体pGEX-F(l)转入大肠杆菌BL21菌细胞，力口 入0. 5mM的诱导剂异丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度转速200rpm/min的空气摇 床中诱导培养5小时。然后用4100rpm/min的速度离心收集表达GST融合蛋白的BL21菌 细胞。
[0053] D、菌细胞用磷酸盐缓冲液（4. 3mMNa2HP04,1. 47mMKH2P04,137MmNaCl，2. 7MmKCl， pH7. 3)重悬，置于冰上超声破碎后13300r/min的速度离心lOmin，收集上清液。取少量上 清液加入蛋白质电泳上样缓冲液，打勻、煮沸5min，13300r/min的速度离心lOmin，用微量 移液器取出l〇ul的上清液样品注入聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，最后当溴酚蓝指示剂到 达距凝胶底部lcm左右的位置时，结束电泳。如图2。
[0054] E、将超声破碎后收集的上清液用GST亲和层析柱纯化，获得了纯度较高的融合蛋 白GST-F(l)。纯化后收集的各管融合蛋白进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定如图3。
[0055] F、采用葡聚糖G-50分子筛去除GST亲和层析过程中的还原型谷胱甘肽后，融合 蛋白经凝血酶酶切，再经GST亲和层析柱纯化获得设计所需要的源于家蚕蚕丝蛋白的多肽 F(l)(TGSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFAGKLDSS)〇
[0056] 家蚕品种蚕丝结晶区与非结晶区重组基因的克隆、表达载体构建与表达，包括以 下步骤：
[0057] A、课题组设计并构建保存了四种丝素结晶区的典型肽段[GAGAGX] 16的基因序列 载体。在（GS) 16基因序列的5'有限制性核酸内切酶Agel的结合位点，前面家蚕丝非结晶 区F(l)的基因序列的5'和3'端分别设计了限制性核酸内切酶NgoMIV和Agel的结合位 点。用Agel酶切（GA) 16的质粒插入NgoMIV和Agel酶切获得的F(l)的基因序列，Agel和 NgoMIV是同尾酶，连接后F(l)3'的酶切位点消失，形成Ala和Gly，是丝素蛋白核心区域中 最富有的2种氨基酸。同时完成了家蚕品种蚕丝结晶区与非结晶区重组基因的克隆，使用 的克隆载体为课题组冻存的P⑶NA-2,构建的质粒为为p⑶NA-g S16fl。
[0058] B、用核酸限制性内切酶Agel/Hindlll消化质粒pGEX-Agel回收条带作为载体片 段，同时用相同的内切酶Agel/Hindlll消化上述构建好的结晶区肽段与非结晶区肽段的 重组质粒，并回收目的肽段编码基因序列作为插入片段，T4DNA连接酶连接后构建pGEX系 列表达载体，即 pGEX-gsl6fl，编码的氨基酸序列为 GAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAG SGAGAGSGAGAGSGAG, AGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGSGFGPYVANGGYSGYEYA WSSESDFAG(GS16F1)。
[0059] C、构建的表达载体表达外源蛋白时具有GST的标签，表达的产物融合蛋白记为 GST-GS16F1。将构建的表达载体pGEX-gsl6f 1转入大肠杆菌BL21菌细胞，加入ImM的诱导 剂异丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度转速200rpm/min的空气摇床中诱导培养6 小时。然后用4100rpm/min的速度离心收集表达GST融合蛋白的BL21菌细胞。
[0060] D、菌细胞用磷酸盐缓冲液（4. 3mMNa2HP04,1. 47mMKH2P04,137MmNaCl，2. 7MmKCl， pH7. 3)重悬，置于冰上超声破碎后13300r/min的速度离心lOmin，收集上清液。取少量上 清液加入蛋白质电泳上样缓冲液，打勻、煮沸5min，13300r/min的速度离心lOmin，用微量 移液器取出l〇ul的上清液样品注入聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，最后当溴酚蓝指示剂到 达距凝胶底部lcm左右的位置时，结束电泳。如图4。
[0061] E、将超声破碎后收集的上清液用GST亲和层析柱纯化，获得了纯度较高的融合蛋 白GST-GS16F1。纯化后收集的各管融合蛋白进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定如图5。
[0062] F、采用葡聚糖G-50分子筛去除GST亲和层析过程中的还原型谷胱甘肽后，融合蛋 白经凝血酶酶切，再经GST亲和层析柱纯化获得设计所需要的源于家蚕蚕丝蛋白的多肽GS 16F1(TGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSG AGAGSGAGAGSGAGAGSGAGSGFGPYVANGGYSGYEYAWSSESDFAGKL)〇
[0063] 天然彩色茧品种蚕丝基因的克隆、表达载体构建与表达，包括以下步骤：
[0064] A、根据天蚕丝素蛋白重链氨基酸序列特征及其编码基因信息，设计并合成 (Invitrogen公司）了 SGAGGRGDGGYGSGSSG(-RGD-) "的编码基因序列，设计的基因序列具有 以下特点：5'端设计了限制性核酸内切酶Agel，用来把合成的"-RGD-"基序克隆入含多克 隆位点的质粒。5'端下游限制性核酸内切酶Bglll与3'端的BamHI是一对同尾酶，用于 单倍"-RGD-"基序的加倍。选择实验室保存的含常用多克隆位点的基础质粒pSLFA1180FA 来完成"-RGD-"基序的克隆。质粒pSLFAl 180FA含有Agel、Bglll、BamHI、EcoRI等酶切位 点。"-RGD-"基因克隆的具体步骤为：用设计的5'端限制性核酸内切酶Agel和BamHI消 化PSLFA1180FA质粒，然后采用琼脂糖凝胶电泳回收消化产物中的大片段，与设计合成的 "-RGD-"基因混合，用T4连接酶连接得到pSL-AYRl。
[0065] B、用限制性核酸内切酶Bglll/EcoRI消化质粒pSL-AYRl，琼脂糖凝胶电泳回收 的小片段插入到BamHI/EcoRI消化同一质粒pSL-AYRl获得的载体中，T4连接酶连接构建 PSL-AYR2,获得设计的"-RGD-"基因序列加倍。连接后同尾酶的位点Bglll和BamHI均消 失，形成了甘氨酸Gly和丝氨酸Ser的密码子。采用同样的方法加倍获得4倍设计序列的 基因克隆质粒PSL-AYR4。
[0066] C、用核酸限制性内切酶Agel/BamHI消化质粒pSL-AYR4回收AYR4的基因片段， 插入Agel/BamHI消化的课题组保存的pCDNA-2质粒中pCDNA-AYR4,构建，然后采用Agel/ Hindlll消化pGEX-Agel回收条带作为载体片段，同时用相同的内切酶Agel/Hindlll消化 p⑶NA-AYR4,并回收目的肽段编码基因序列作为插入片段，T4DNA连接酶连接后构建pGEX 系列表达载体，即 PGEX-AYR4,编码的相应肽段为 SGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSGS GAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSG(RGD4)。
[0067] D、构建的表达载体表达外源蛋白时具有GST的标签，表达的产物融合蛋白记为 GST-RGD4。将构建的表达载体pGEX-AYR4转入大肠杆菌BL21菌细胞，加入1. 2mM的诱导剂 异丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度转速200rpm/min的空气摇床中诱导培养4小 时。然后用4100rpm/min的速度离心收集表达GST融合蛋白的BL21菌细胞。
[0068] E、菌细胞用磷酸盐缓冲液（4. 3mMNa2HP04,1. 47mMKH2P04,137MmNaCl，2. 7MmKCl， pH7. 3)重悬，置于冰上超声破碎后13300r/min的速度离心10min，收集上清液。取少量上 清液加入蛋白质电泳上样缓冲液，打勻、煮沸5min，13300r/min的速度离心10min，用微量 移液器取出lOul的上清液样品注入聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳，最后当溴酚蓝指示剂到 达距凝胶底部lcm左右的位置时，结束电泳。如图6。
[0069] F、将超声破碎后收集的上清液用GST亲和层析柱纯化，获得了纯度较高的融合蛋 白GST-RGD4。纯化后收集的各管融合蛋白进行了聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定如图7。
[0070] G、采用葡聚糖G-50分子筛去除GST亲和层析过程中的还原型谷胱甘肽后，融合蛋 白经凝血酶酶切，再经GST亲和层析柱纯化获得设计所需要的源于天然彩色茧蚕丝蛋白的 多肽 RGD4 (GSTGRSGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYG SGSSGS)。
[0071] 将制备好的丝蛋白肽段用于天然彩色新品种蚕鉴定。
[0072] 利用制备好的丝蛋白肽段，对经过基因突变产生的新品种蚕进行鉴定，对其突变 的基因进彳丁标记。
[0073] 对鉴定完毕的新品种，如果发现具有良好的遗传特性，还可以用于新品种蚕的选 育。
【权利要求】
1. 用于天然彩色新品种蚕鉴定的丝蛋白肽段，其特征在于，其基因序列包括家蚕丝H 链非结晶区基因、H链结晶区与非结晶区的重组基因以及天然彩色茧蚕柞蚕、天蚕蚕丝H链 基因片段。
2. 根据权利要求1所述的丝蛋白肽段，其特征在于，所述的家蚕丝H链非结晶区基因构 建的表达载体为PGEX-F(I)，所述的H链结晶区与非结晶区的重组基因构建的表达载体为 pGEX-gsl6fl，所述的天然彩色茧蚕柞蚕、天蚕蚕丝H链基因片段的表达载体为pGEX-AYR4。
3. -种制备如权利要求1或2所述的丝蛋白肽段的方法，其特征在于，包括家蚕品种蚕 丝非结晶区基因的克隆、表达载体构建与表达，家蚕品种蚕丝结晶区与非结晶区重组基因 的克隆、表达载体构建与表达，天然彩色茧品种蚕丝基因的克隆、表达载体构建与表达。
4. 如权利要求3所述的丝蛋白肽段的制备方法，其特征在于，所述的家蚕品种蚕丝非 结晶区基因的克隆、表达载体构建与表达，包括以下步骤： A、 对Invitrogen公司合成的家蚕品种蚕丝非结晶区基因的非重复序列肽段F(I)的编 码基因序列，基因序列的一端设计有限制性核酸内切酶HindIII-Ng 0MIV位点，另一端设计 有AgeI-BglII位点，用已经保存的含多克隆位点的基础质粒来完成非结晶区基因序列的 克隆，用限制性核酸内切酶Bglll/Hindlll消化pSLFA1180FA，插入设计合成的含有BglII 和HindIII的粘末端非结晶区基因序列，T4DNA连接酶连接后得到含有完整非结晶区编码 基因的质粒PSL-F(I); B、 由pGEX-KG经过改造加入限制性核酸内切酶AgeI位点得pGEX-Agel，Agel/Hindlll 酶切的PGEX-AgeI载体回收载体片段，Agel/Hindlll酶切质粒[pSl^F (1)回收插入片段， T4DNA连接酶连接构建含有非结晶区肽段基因的表达载体表示为pGEX-F(l); C、 将构建的表达载体pGEX-F (1)转入大肠杆菌BL21菌细胞，加入0-1. 2mM的诱导剂异 丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度转速200rpm/min的空气摇床中诱导培养0-8小 时，然后用4100rpm/min的速度离心收集表达GST融合蛋白的BL21菌细胞； D、 菌细胞用适量的磷酸盐缓冲液重悬，置于冰上超声破碎后13300r/min的速度离心 IOmin,收集上清液； E、 将超声破碎后收集的上清液用GST亲和层析柱纯化，获得了纯度较高的融合蛋白 GST-F(I)； F、 采用葡聚糖G-50分子筛去除GST亲和层析过程中的还原型谷胱甘肽后，融合蛋白经 凝血酶酶切，再经GST亲和层析柱纯化获得设计所需要的源于家蚕蚕丝蛋白的多肽F (1)。
5. 如权利要求3所述的丝蛋白肽段的制备方法，其特征在于，所述的家蚕品种蚕丝结 晶区与非结晶区重组基因的克隆、表达载体构建与表达，包括以下步骤： A、 用AgeI酶切（GA) 16的质粒插入NgoMIV和AgeI酶切获得的F(I)的基因序列，筛选 F(I) 3'端AgeI与NgoMIV粘末端的连接进行克隆，连接后酶切位点消失，形成Ala和Gly， 同时完成了家蚕品种蚕丝结晶区与非结晶区重组基因的克隆，所使用的克隆载体为冻存的 pCDNA-2,构建的质粒为 pCDNA-gsl6fl ; B、 用核酸限制性内切酶Agel/Hindlll消化质粒pGEX-Agel回收条带作为载体片段， 同时用所述的核酸限制性内切酶Agel/Hindlll消化上述构建好的结晶区肽段与非结晶区 肽段的重组质粒，并回收目的肽段编码基因序列作为插入片段，T4DNA连接酶连接后构建 pGEX系列表达载体，S卩pGEX-gsl6fl，编码的氨基酸序列为GAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAG SGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGAGSGAGSGFGPYVANGGYS GYEYAffSSESDFAG(GS16F1)； C、 将构建的表达载体pGEX-gsl6f 1转入大肠杆菌BL21菌细胞，加入0-1. 2mM的诱导剂 异丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度转速200rpm/min的空气摇床中诱导培养0-8 小时，然后用4100rpm/min的速度离心收集表达GST融合蛋白的BL21菌细胞； D、 菌细胞用适量的磷酸盐缓冲液重悬，置于冰上超声破碎后13300r/min的速度离心 IOmin,收集上清液； E、 将超声破碎后收集的上清液用GST亲和层析柱纯化，获得了纯度较高的融合蛋白 GST-GS16F1 ； F、 采用葡聚糖G-50分子筛去除GST亲和层析过程中的还原型谷胱甘肽后，融合蛋 白经凝血酶酶切，再经GST亲和层析柱纯化获得设计所需要的源于家蚕蚕丝蛋白的多肽 GS16F1。
6.如权利要求3所述的丝蛋白肽段的制备方法，其特征在于，所述的天然彩色茧品种 蚕丝基因的克隆、表达载体构建与表达，包括以下步骤： A、 对Invitrogen公司设计并合成的SGAGGRGDGGYGSGSSG(-RGD-) "天蚕丝素蛋白重 链氨基酸序列的编码基因序列，5'端设计有限制性核酸内切酶AgeI和BglII的位点， 3'端设计有限制性核酸内切酶BamHI的位点，用实验室保存的含多克隆位点的基础质粒 PSLFA1180FA来完成"-RGD-"基序的克隆，具体步骤为：用限制性核酸内切酶AgeI和BamHI 消化PSLFA1180FA质粒，然后采用琼脂糖凝胶电泳回收消化产物中的大片段，与设计合成 的"-RGD-"基因混合，用T4连接酶连接得到pSL-AYRl ; B、 用限制性核酸内切酶Bglll/EcoRI消化质粒pSL-AYRl，琼脂糖凝胶电泳回收的 小片段插入到BamHI/EcoRI消化同一质粒pSL-AYRl获得的载体中，T4连接酶连接构建 PSL-AYR2,获得设计的"-RGD-"基因序列加倍，连接后同尾酶的位点BglII和BamHI均消失， 形成了甘氨酸Gly和丝氨酸Ser的密码子，采用同样的方法加倍获得4倍设计序列的基因 克隆质粒PSL-AYR4 ; C、 用核酸限制性内切酶Agel/BamHI消化质粒pSL-AYR4回收AYR4的基因片段，插 入Agel/BamHI消化的课题组保存的pCDNA-2质粒中pCDNA-AYR4,构建，然后采用AgeI/ HindIII消化pGEX-Agel回收条带作为载体片段，同时用相同的内切酶Agel/Hindlll消化 p⑶NA-AYR4,并回收目的肽段编码基因序列作为插入片段，T4DNA连接酶连接后构建pGEX 系列表达载体，即 PGEX-AYR4,编码的相应肽段为 SGAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSGS GAGGRGDGGYGSGSSGSGAGGRGDGGYGSGSSG(RGD4)； D、 将构建的表达载体PGEX-AYR4转入大肠杆菌BL21菌细胞，加入0-1. 2mM的诱导剂异 丙基-β -D-硫代半乳苷糖（IPTG)，在37度转速200rpm/min的空气摇床中诱导培养0-8小 时，然后用4100rpm/min的速度离心收集表达GST融合蛋白的BL21菌细胞； E、 菌细胞用适量的磷酸盐缓冲液重悬，置于冰上超声破碎后13300r/min的速度离心 IOmin,收集上清液； F、 将超声破碎后收集的上清液用GST亲和层析柱纯化，获得了纯度较高的融合蛋白 GST-RGD4 ； G、采用葡聚糖G-50分子筛去除GST亲和层析过程中的还原型谷胱甘肽后，融合蛋白经 凝血酶酶切，再经GST亲和层析柱纯化获得设计所需要的源于天然彩色茧蚕蚕丝蛋白的多 肽R⑶4。
【文档编号】C07K19/00GK104232665SQ201410353375
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年7月23日 优先权日:2014年7月23日
【发明者】王建南, 裔洪根, 褚永兴 申请人:湖州南浔恒岳农业科技有限公司