一种天然产物中铁螯合物的分离纯化方法
【专利摘要】本发明涉及从一株链霉菌发酵液中分离纯化制备一种铁螯合物的方法，所述方法系采用大孔树脂柱、丙酮洗脱、分子筛及高效液相色谱、乙酸铵-乙腈洗脱制备纯化，铁螯合物可以用于与生物活性小分子耦合，使其靶向特定、高效转运进入细胞，提高活性化合物在体内的活性。
【专利说明】一种天然产物中铁螯合物的分离纯化方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及从链霉菌代谢产物中分离纯化获得一种铁螯合物的方法。
【背景技术】：
[0002] 铁对于几乎所有生物体的生长都是必须的。然而铁离子的不溶性影响生物体对其 的吸收，所以自然界绝大多数情况下铁是以螯合物形式溶解，并被转运到胞浆而被吸收的。 "铁螯合物"均系在三磷酸腺苷（ATP)依赖的转运系统下被主动摄取。"铁螯合物"可分为 儿茶酚型、羟基氧肟酸型、羧酸类型等，它们都有一个或多个多齿配体提供多对电子与中心 体（Fe3)形成配位键。无论在革兰氏阳性或阴性菌中，"铁螯合物"均系在ATP依赖的转运 系统下被主动摄取。该运转系统包含有细胞特异性外膜蛋白FhuA、E，周质蛋白FhuD和一 些内膜协助蛋白FhuB和C，其主动转运过程依赖于三磷酸腺苷（ATP)和TonB蛋白复合体的 参与。这种跨膜内吞的主动转运机制在抗生素药物研究领域一直引起人们重视。
[0003] 白霉素（albomycin)是一个由链霉菌ATCC700974产生的含羟基氧肟酸型铁螯合 物的抗生素，其铁螯合基团是通过丝氨酰肽键与硫代呋喃糖苷胞嘧啶核苷相连，其结构如 (式1)所示。白霉素对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌，包括百日咳杆菌和螺旋体等均有良好 的抗菌活性。白霉素是由FhuA主动转运通过细菌外膜，与周质蛋白FhuD结合，再经ABC运 转蛋白FhuB和C进入胞质。X-衍射晶体结构研究表明，与FhuA蛋白结合的部分主要是羟基 氧肟酸型铁螯合基团，后者构型的变化将影响其与FhuA蛋白的结合，而其配体分子结构的 变化与蛋白结合力的影响较少，所以白霉素的抗菌活性取决于核苷部分，但其进入细菌细 胞发挥作用则完全依赖于铁螯合基团的存在，脱去铁离子的白霉素完全丧失抗菌活性。这 种通过特异铁运载系统进入细胞发挥生物活性的含铁螯合物抗生素被称为"木马"（Trojan horse)抗生素。除白霉素以外，链霉菌还产生如萨尔霉素（Salmycin)[Vertesy L等 1995，Helvetica Chimica Acta 78(1)，46]、高铁霉素（Ferrimycin)[Bickel Η 等 1965, Antimicrob Agents Chemother (Bethesda) 5, 951] ·和达诺霉素（Danomycin)等[Tsukiura H 等 1964，Journal of AntibioticsliOjg]'。"木马"(Trojan horse)抗生素中的"铁 螯合"基团不同，与其结合的分子结构也各异，它们新颖的结构和独特的作用机制在人们克 服"多重耐药细菌"的战役中，受到了极大的关注。
[0004]
【权利要求】
1. 一种链霉菌代谢产物中分离纯化获得铁螯合物的方法，其特征是，所述方法涉及的 链霉菌选自白霉素产生菌，具体方法包括以下步骤： 白霉素产生菌ATCC700974的培养； 所述培养液的初步处理； 铁螯合物的初步分离； 所述螯合物的纯化； 所述螯合物纯品的检测鉴定。
2. 权利要求1所述的方法，其特征是，白霉素产生菌ATCC700974经平板培养，接种到液 体培养基，28°C摇床培养72h，pH值至7. 0,添加一定量FeS04 · 7H20,继续培养72h。
3. 权利要求1所述的方法，其特征是，白霉素产生菌ATCC700974培养液经离心、上清 过大孔树脂，冲洗后，再用40%丙酮洗脱，收集呈红棕色洗脱液，将收集液进行旋蒸，去除丙 酮，然后将其冷冻干燥。
4. 权利要求1所述的方法，其特征是，铁螯合物的初步分离，是将冻干粉末用少量水溶 解，采用分子筛色谱柱，用水洗脱，收集〇D435nm值为最大的洗脱液部分，冷冻干燥得粗品。
5. 权利要求1所述的方法，其特征是，铁螯合物的纯化，是将冻干粗粉末，用少量水溶 解，用制备液相，95% 2mM乙酸铵-70%乙腈流动相，收集保留时间为6. 7?6. 9min，435nm 吸收峰的洗脱液，进行旋蒸、除去乙腈，再冷冻干燥，获得铁螯合物纯品。
6. 权利要求1所述的方法，其特征是，铁螯合物纯品的检测鉴定，是采用HPLC、紫外光 谱和质谱，分别检测铁螯合物纯品的HPLC435nm吸收峰，保留时间为8. 7min左右，紫外吸收 435nm，质谱分析显示其分子量为587m/z。
【文档编号】C07K7/06GK104232711SQ201410352810
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年7月23日 优先权日:2014年7月23日
【发明者】杨兆勇, 刘娟娟, 生宁, 田喜凤, 冯晓洲, 孙婉, 李亚东, 汪康游, 金媛媛 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所