专利名称：阿加曲班副产物及合成与分离鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种阿加曲班副产物及合成与分离鉴定方法。
背景技术：
1978年日本Mitsubishi化学公司S.Okamoto等首次报导了阿加曲班(Argatroban，1)水合物抗凝血酶活性US 4 101 653。随后20多年期间，众多研究者对Argatroban的生物活性及作为医药的价值进行了深入研究。1981年，S.Okamoto在动物体内与肝素进行了比较Okamoto，S.et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.101，440(1981)；T.Kumoto等对其立体选择活性进行了报导Kumada，T.et al.，Thromb.Res.24，285(1981)；1984年，R.Kumao进行了临床血液透析评价Kikumoto，R.et al.，Biochemistry 23，85(1984)；1986年该作者报导了Argatroban抑制哺乳动物凝血酶活性，可作为治疗和预防血栓药剂和血小板凝聚抑制剂。Argatroban一水合物可作为选择性抗血栓剂、治疗慢性动脉堵塞和脑血栓等JP 61-48829。1992年和1993年，Taparelli和J.A.Jakubowski先后报导了Argatroban抗凝血酶的可逆性Taparelli，C.，Trends Pharmacol.Sci.，1993，14，366，Jakubowski，J.A.et al，Rep.Med.Chem.，1992，27，99；90年代L.R.Buch等多位研究者报导了相关研究Buch，L.R.，Cadiosvasc.Drug Rev.，1991，9，247，Strupcnewski，J.D.et al.，AcademicSan Diego，1991；Vol.26，p299，Brundish，D.et al.，J.Med.Chem.1999；42，4584，Shebuski，R.J.，AcademicSan Diego，1999；Vol.26，p98。1992年日本批准作为非肠道使用抗凝血酶药剂Hijikata-Okunomiya，A.，et al，Thromb.Hemostasis，1992，18，135。
阿加曲班(2R，4R)-1-{(2S)-5-[(氨基亚氨基甲基)氨基]-1-氧代-2-{[(1，2，3，4-四氢-3-甲基-8-喹啉基)磺酰]氨基}戊基}-4-甲基-2-哌啶甲酸其化学成分是21(R)和21(S)的混合物，通常是64-6536-3US 6 440 417，Bioorganic & Medicine Chemistry Letters，11(2001)，1989-1992，Journal of Pharmaceutical Sciences，Vol.82，No.6，672(1993)，化学式
现报导的Argatroban合成路线都是以硝基-L-精氨酸为起始原料，以哌啶羧酸酯或喹啉磺酰氯缩合先后次序不同，构成两条主要路线氨基保护法硝基-L-精氨酸的氨基用t-Boc保护，再与哌啶羧酸酯缩合，去t-Boc保护基，与喹啉磺酰氯缩合、酯水解、氧化去硝基得无结晶水Argatroban(图1，2)EP 8746，US4 258 192，US4 201 863，JP 81-15,267，US6 440 417，特许公报平2-31055，Bioorganic&Medicine Chemistry Letters，11(2001)，1989-1992。
非保护法硝基-L-精氨酸与喹啉磺酰氯缩合后再与哌啶羧酸酯缩合、酯水解、氢化去硝基，亦得无结晶水目标产物(图3)特许公报平1-35000，EP 823 430。
上述的任何路线必经中间体(2R，4R)-1-[NG-硝基-N2-(3-甲基-8-喹啉磺酰基)-L-精氨酰基]-4-甲基-2-哌啶甲酸，氢化还原得Argatroban，同时，都生成一个相同的主要副产物，由于该主要副产物的性质与Argatroban相近，不易分离，提纯难度大，使产品Argatroban杂质量很难达标。因此研究该副产物的性质并且予以合成、分离与鉴定具有重要的实用价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种阿加曲班副产物及合成与分离鉴定方法。本发明是在研究各种合成路线的基础上，对阿加曲班的主要副产物进行了合成与分离鉴定，使产品Argatroban杂质量达标。该方法步骤设计合理，操作简单、条件温和、收率高。
本发明提供一种阿加曲班副产物是(2R，4R)-1-[N2-(3-甲基-8-喹啉磺酰基)-L-精氨酰基]-4-甲基-2-哌啶甲酸(化合物3)，其结构是 所述的阿加曲班副产物化合物3的合成与分离鉴定方法步骤包括1)以硝基-L-精氨酸为原料、经叔丁氧酰基(t-Boc)保护与哌啶羧酸酯缩合、去t-Boc保护基、与喹啉磺酰氯缩合和酯水解得中间体2。
2)中间体2再经过钯碳催化氢化还原或用氯化亚锡还原，得主要产物化合物3。
所说的钯碳催化氢化还原步骤(1)反应器中依次加入化合物2、三苯基膦、5％的钯碳和无水乙醇和冰乙酸混合溶剂。化合物2∶三苯基膦∶5％的钯碳的重量比1∶0.01～0.03∶0.1～0.3；无水乙醇和冰乙酸的体积比3～4∶1。
(2)升温65-70℃，通入氢气，保持压力10MPa，反应20～24小时，HPLC跟踪反应，至反应物消失为反应终点，停止反应。
(3)过滤除去钯碳，蒸馏脱溶，用二氯甲烷溶解，饱和碳酸氢钠调节pH＝7。分出有机层，再用饱和氯化钠洗涤，静置，分出有机层，无水硫酸镁干燥，过滤。
(4)蒸馏脱除二氯甲烷，得产物化合物3；或者所说的用氯化亚锡还原步骤(1)反应器中依次加入化合物2、氯化亚锡和无水乙醇溶剂。化合物2∶氯化亚锡∶无水乙醇溶剂的重量比1∶2～3∶30～40。
(2)20-25℃搅拌反应24小时，HPLC跟踪反应，化合物2含量不再下降，停止反应。
(3)真空蒸馏脱乙醇，用水和二氯甲烷溶解，水层再用二氯甲烷萃取，合并有机层，水洗、饱和氯化钠洗、水洗，无水硫酸镁干燥、过滤。
(4)真空蒸馏脱二氯甲烷，得产物化合物3。
本发明是将混合物经液质联用分析得知，一组分为Argatroban，分子离子峰507，509，另一组分离子峰为503，505。初步判断，后者是喹啉环未氢化的产物。用通常的手段，Argatroban和该副产物很难分离，为了得到副产物样品、进一步鉴定结构，尝试两种方法控制还原化合物2、还原脱硝基而喹啉环不氢化得化合物3。一种方法是用氯化亚锡做还原剂、无水乙醇中室温反应过夜，反应只还原脱硝基得喹啉环未氢化的化合物3，收率约65％。另一方法仍采用钯碳催化氢化，其它条件与制备Argatroban的氢化条件一致，加入少许三苯基膦，使钯碳催化剂适度中毒降低催化强度。实验结果证明，同样得到化合物3，收率≥80％。
本发明是将化合物2经催化氢化制阿加曲班。通过分离、鉴定和合成，确认其中的副产物为化合物3。化合物3进一步氢化得1，证明氢化2时，首先还原脱硝基，然后喹啉1、2、3、4位氢化得1。跟踪2的氢化反应，可使3的含量降到允许范围，成功的解决了分离难的问题。
本发明提供的阿加曲班副产物的合成与分离鉴定方法是在研究各种合成路线的基础上，对阿加曲班副产物进行了合成与分离鉴定，该方法步骤设计合理，操作简单、条件温和、收率高、产物质量好。
图1硝基精氨酸t-Boc保护后与(2R，4R)哌啶甲酸酯缩合反应路线图示。
图2硝基精氨酸t-Boc保护后与反式哌啶羧酸酯缩合、分离、拆分，再与喹啉磺酰氯缩合反应路线图示。
图3非保护法反应路线图示。
具体实施例方式
实例1.
中间体2(化合物2)的制备实例见(US 4 258 192)，反应式见附图1。
实例2，钯碳催化氢化法100ml高压釜中依次加入1g由实例1制备的化合物2、0.02g三苯基膦、0.2g5％的钯碳、13ml无水乙醇和4ml冰乙酸。控制高压釜外温65-70℃，通入氢气，保持压力10MPa，HPLC(高效液相色谱)跟踪反应，反应24小时，停止反应。过滤除去钯碳，脱溶，用20ml二氯甲烷溶解，饱和碳酸氢钠调节pH＝7。分出有机层，再用10ml饱和氯化钠洗涤，静置，分出有机层，无水硫酸镁干燥，过滤，脱除二氯甲烷，得白色固体0.75g，为化合物3，收率82％。
化合物3结构鉴定质谱分子离子峰503，505核磁1HNMR(300MHz，DMSO)；δ0.69(d，3H，piperidine-CH3)，2.53(s，3H，ArCH3)，7.6(m，3H， )，7.7(t，1H，ArH)，8.2(d，2H，ArH)，8.3(s，1H，ArH)，8.9(s，1H，ArH)。
1HNMR(300MHz，D2O)；δ7.6(m，3H， )，几近消失。
HPLC跟踪分析(1)条件色谱柱Agilent(安捷伦科技有限公司)Extend C18250×4.6mm，5μm流动相甲醇∶水＝45∶55(体积，ml)检测波长216nm流速1.2ml/min柱温40℃(2)保留时间分别为R-Argatroban 59.2分钟S-Argatroban 64.3分钟化合物3 8.5分钟合成Argatroban的未知杂质，保留时间为8.5分钟。
通过质谱、核磁鉴定和HPLC对比，证明Argatroban中未知杂质就是化合物3。当合成的化合物3进一步钯碳氢化，跟踪反应，当3完全消失停止氢化，得最终产物Argatroban。实验证明合成Argatroban时化合物3含量高的原因是氢化不彻底。跟踪反应，强化氢化，可以使中间体3含量降到允许范围，解决了化合物3分离难，即Argatroban纯化难的一个关键问题。
实例3.氯化亚锡法100ml四口瓶中加入1g由实例1制备的化合物2、2.4g氯化亚锡和40ml无水乙醇，20-25℃搅拌反应24小时，HPLC跟踪反应，化合物2含量不再下降，停止反应。真空脱除乙醇，加水和二氯甲烷，水层再用二氯甲烷萃取，合并有机层，水洗、饱和氯化钠洗、水洗，无水硫酸镁干燥、过滤、脱溶，得0.6g化合物3。收率65％。HPLC保留时间为8.5分钟。
实例4.Argatroban的制备100ml高压釜中加入1g化合物2、0.2g5％的钯碳、13ml无水乙醇和4ml冰乙酸，控制外温65-70℃，通氢压力10MPa，HPLC跟踪反应，反应24小时。提纯方法同实例2。HPLC归一法分析保留时间分别为R-Argatroban 59.2分钟含量48.8％S-Argatroban 64.3分钟含量44.9％化合物3 8.5分钟 含量6.3％。
权利要求
1.一种阿加曲班副产物，其特征在于它是化合物3(2R，4R)-1-[N2-(3-甲基-8-喹啉磺酰基)-L-精氨酰基]-4-甲基-2-哌啶甲酸，其结构是
2.权利要求1所述的阿加曲班副产物化合物3的合成与分离鉴定方法，其特征是包括下述步骤1)以硝基-L-精氨酸为原料、经叔丁氧酰基(t-Boc)保护与哌啶羧酸酯缩合、去t-Boc保护基、与喹啉磺酰氯缩合和酯水解得中间体2(2R，4R)-1-[NG-硝基-N2-(3-甲基-8-喹啉磺酰基)-L-精氨酰基]-4-甲基-2-哌啶甲酸；2)中间体2再经过钯碳催化氢化还原或用氯化亚锡还原，得主要产物化合物3；所说的钯碳催化氢化还原步骤(1)反应器中依次加入化合物2、三苯基膦、5％的钯碳和无水乙醇和冰乙酸混合溶剂；(2)升温65-70℃，通入氢气，保持压力10MPa，反应20～24小时，HPLC监测，至反应物消失为反应终点，停止反应；(3)过滤除去钯碳，蒸馏脱溶，用二氯甲烷溶解，饱和碳酸氢钠调节pH＝7，分出有机层，再用饱和氯化钠洗涤，静置，分出有机层，无水硫酸镁干燥，过滤；(4)蒸馏脱除二氯甲烷，得产物化合物3；或者所说的用氯化亚锡还原步骤(1)反应器中依次加入化合物2、氯化亚锡和无水乙醇溶剂；(2)20-25℃搅拌反应24小时，高效液相色谱(HPLC)跟踪反应，化合物2含量不再下降，停止反应；(3)真空蒸馏脱乙醇，用水和二氯甲烷溶解，水层再用二氯甲烷萃取，合并有机层，水洗、饱和氯化钠洗、水洗，无水硫酸镁干燥、过滤；(4)真空蒸馏脱二氯甲烷，得产物化合物3。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述的化合物2∶三苯基膦∶5％的钯碳的重量比1∶0.01～0.03∶0.1～0.3；无水乙醇和冰乙酸的体积比3～4∶1。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述的化合物2∶氯化亚锡∶无水乙醇溶剂的重量比1∶2～3∶30～40。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征是所述的高效液相色谱跟踪分析(1)条件色谱柱Agilent Extend C18250×4.6mm，5μm流动相甲醇∶水＝45∶55(体积，ml)检测波长216nm流速1.2ml/min柱温40℃(2)保留时间分别为R-Argatroban 59.2分钟S-Argatroban 64.3分钟化合物3 8.5分钟。
全文摘要
本发明涉及阿加曲班副产物及合成与分离鉴定方法。经催化氢化制阿加曲班时，同时生成一个分离困难的副产物，本发明通过分离、鉴定和合成，确认该副产物为化合物3。化合物3进一步氢化得阿加曲班1，证明氢化中间产物时，首先还原脱硝基，然后喹啉1、2、3、4位氢化得1。跟踪中间产物的氢化反应，可使化合物3的含量降到允许范围，成功的解决了化合物3分离难、即阿加曲班纯化难的问题。
文档编号G01N30/00GK101033223SQ20071005691
公开日2007年9月12日 申请日期2007年3月14日 优先权日2007年3月14日
发明者宋洪海 申请人:天津市炜杰科技有限公司