水稻耐热基因tog1及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了水稻耐热基因TOG1及其编码蛋白。TOG1基因是下列核苷酸序列之一：1)SEQ?ID?No：1所示的DNA序列；2)与SEQ?ID?No：1所示的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。TOG1是具有SEQ?ID?No：2所示的氨基酸序列的蛋白质，或者是将SEQ?ID?No：2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ?ID?No：2所示的氨基酸序列相同的活性的由SEQ?ID?No：2衍生的蛋白质。本发明还公开了通过提高TOG1表达量改善植物耐热性状并有效增加产量的方法。
【专利说明】水稻耐热基因TOG1及其应用
发明领域
[0001]本发明属于植物基因工程领域。具体地，本发明涉及一种赋予水稻高温耐受性状的增产基因TOGl (Thermaltolerant Growthl)，该基因的功能片段，该基因所编码的蛋白质及其功能类似物，以及含有所述TOGl基因核苷酸序列的载体和含有该基因核苷酸序列或该载体的宿主细胞；另外，本发明还涉及一种培育具有提高的耐热性的植物的方法。
【背景技术】
[0002]作为广泛种植于热带、亚热带和温带的农作物，水稻的理想生长温度为33摄氏度
[1]。34°C的高温会造成明显的水稻减产[2]，高于理想生长温度5°C的高温会对植物在细胞及代谢水平造成剧烈的负面影响[I]。然而在水稻育种过程中，耐热性状却长期被人们所忽视，从而造成了目前优质耐热种质资源极为有限。由于耐热和增产往往密切相关，耐热品种的培育无疑会在增加水稻适应性的基础上进一步增加亩产量。
[0003]而另一方面，由于植物的耐热机理极为复杂，本领域的研究一直倍受关注。除了生理水平的适应调节，以HSP70为代表的热激蛋白蛋白家族能够作为分子伴侣有效的保护蛋白在高温下正常折叠[3，4，5]。而在另一层面，组蛋白H2A.Z也参与对高温的感知，并介导转录水平的广泛应答[6]。因此，植物对高温逆境的应答及耐受显然受多重途径调控。
[0004]DEAD-box RNA解旋酶家族广泛存在于几乎所有生命体中[7]。该家族在氨基酸序列上具有9个极其保守的功能区[8]，从而赋予其非常保守的基本解旋功能[9]。而另一方面，该家族在长期进化过程中分化出参与多种生命进程的各种功能，包括mRNA的转录、剪接、运输和翻译以及rRNA前体的加工等[7]。所有上述进程都需要保证错误折叠的RNA解旋并正确折叠成特定的构象，DEAD-box RNA解旋酶正是通过其解旋异构活性确保了各种RNA的正确折叠，因此本领域的研究者们越来越倾向于将其定义成RNA伴侣[10]。大量的研究证据已经表明RNA伴侣在细菌的抗逆机制中发挥了关键作用[10]。同样，植物RNA在冷、热、盐及氧化胁迫下的正确折叠高度依赖于RNA伴侣的参与[10]。
[0005]本发明鉴定的水稻耐热因子TOGl为DEAD-box RNA解旋酶中的一种，与已知在酵母rRNA前体加工过程中发挥了关键性作用的Rrp3 [ref.11]有很高的同源性，该基因的正常表达保证了水稻对高温一定程度的耐受性，通过基因工程改造适度提高其表达量能够进一步提高水稻的耐热性，从而达到增产的目的。
【发明内容】
[0006]因此，本发明的一个目的是提供一种水稻耐热基因及其编码的水稻耐热因子。本发明的另一个目的是提供一种培育具有提高的耐热性的植物(例如，水稻品种)的方法。
[0007]本发明人克隆了水稻的耐热基因TOGl，由于该基因编码含DEAD-box结构域的RNA解旋酶，故而其被命名为DEAD-box RNA解旋酶基因。
[0008]由本发明人发现并鉴定的水稻的耐热基因TOGl编码的水稻耐热因子名称缩写为TOGl (命名为DEAD-box RNA解旋酶)，是具有SEQ IDNo:2所示的氨基酸序列的蛋白质，或者是将SEQ ID No:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No:2所示的氨基酸序列相同的活性的由SEQ ID No:2衍生的蛋白质。优选地，其中所述“相同的活性”是指RNA解旋酶活性，具体是指与SEQ ID No:2所示的氨基酸序列的RNA解旋酶活性相同的RNA解旋酶活性。
[0009]SEQ ID No:2所示的氨基酸序列是由472个氨基酸组成的蛋白质。
[0010]本发明人发现并鉴定的水稻耐热因子TOGl的编码基因T0G1，是下列核苷酸序列之一:
[0011]I) SEQ ID No:1 所示的 DNA 序列;
[0012]2)与SEQ ID No:1所示的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能的蛋白质的核苷酸序列。
[0013]优选地,上述“相同功能”是指RNA解旋酶活性,具体是指与SEQID No:1所示的DNA序列编码的DEAD-box RNA解旋酶相同的RNA解旋酶活性。
[0014]序列表中SEQ ID No:1所示的DNA序列由4746个碱基组成。
[0015]优选地，所述水稻耐热基因TOGl是编码如下蛋白质(a)和(b)的基因:
[0016](a)具有SE Q ID No:2所不的氣基酸序列的蛋白质；
[0017](b)将SEQ ID No:2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No:2所示的氨基酸序列相同的活性的由SEQ ID No:2衍生的蛋白质。
[0018]本领域技术人员应该理解，利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的TOGl基因导入植物细胞，或者对SEQ ID No:3所示TOGl基因前导序列区进行改造从而改变TOGl表达量，比如插入增强元件或删除抑制元件，可获得耐热性状改变的细胞系及植株。本发明的基因在构建到植物表达载体中时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入植物可选择性标记或具有抗性的抗生素标记物。携带有本发明TOGl基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导等常规生物技术方法导入植物细胞，被转化的植物宿主既可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，优选禾本科植物，更优选水稻。本发明的基因对培育耐热植物新品种，特别是培育耐热水稻新品种具有重要意义。当本发明的基因被用于改变水稻耐热性状时，可采用以下方法:(I)将本发明的水稻耐热基因TOGl克隆到植物转化载体中；
(2)将所构建的植物转化载体转化可再生水稻组织(或器官)并使本发明的水稻耐热基因在转化的组织中表达；(3)将被转化的组织(或器官)培养成植株。
[0019]更具体地，本发明提供以下各项:
[0020]1、一种赋予水稻耐热性状的DEAD-box RNA解旋酶TOGl，其为具有SEQ ID No:2所示的氨基酸序列的蛋白质，或者是将SEQ ID No:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID No:2所示的氨基酸序列相同的活性的由SEQ IDNo:2衍生的蛋白质。
[0021]2、根据第I项所述的DEAD-box RNA解旋酶T0G1，其特征在于:其是具有SEQ IDNo:2所不的氣基酸序列的蛋白质。
[0022]3, TOGl的编码基因，其是下列核苷酸序列之一:
[0023]I) SEQ ID No:1 所示的 DNA 序列；[0024]2)与SEQ ID No:1所示的核苷酸序列具有90%以上同源性，且编码相同功能的蛋白质的核苷酸序列。
[0025]4、根据第3项所述的基因，其特征在于:所述TOGl的编码基因是SEQ ID No:1所示的核苷酸序列。
[0026]5、一种含有第3或4项所述的基因或其片段的载体。
[0027]6、根据第5项所述的载体,其为植物表达载体,优选为适于在水稻中表达的载体。
[0028]7、根据第6项所述的载体，其为PCAMBIA1300。
[0029]8、一种宿主细胞，该细胞含有第3或4项所述的基因或其片段，或者含有第5-7项任一项所述的载体。
[0030]9、根据第8项所述的宿主细胞，所述细胞选自大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。
[0031]10、一种培育具有提高的耐热性的植物的方法，所述方法包括用第5-7项任一项所述的载体转化所述植物的细胞或组织，并且将转化的植物细胞或组织培育成植株。
[0032]11、根据第10项所述的方法，其中所述转化通过农杆菌介导法或基因枪法进行。
[0033]12.根据第10或11项所述的方法，其中所述植物为禾本科植物，优选水稻。
[0034]13.根据权利要求10所述的方法，其中所述方法还提高转基因植物的产量。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]从下面结合附图的详细描述中，本发明的上述特征和优点将更明显，其中:
[0036]图1、togl与野生型中籼3037的表型比较。
[0037]水稻材料分别种植于北京和扬州的5月至9月以及海南的12月至4月。
[0038]标尺:20厘米。
[0039]图2、不同温度下togl与野生型中籼3037的种子萌发与幼苗生长。
[0040]标尺:3厘米。
[0041]图3、TOGl基因的定位及候选基因确定。
[0042]图4、TOGl 基因的 DNA 序列(SEQ ID No:1)。
[0043]图5、TOGl基因编码的氨基酸序列(SEQ ID No:2)。
[0044]图6、包含TOGl基因启动子的前导序列(SEQ ID No:3)。
[0045]图7、TOGl基因功能互补及过表达载体图谱。
[0046]图8、T0G1基因功能互补实验验证，左图为野生型(WT)水稻植株，右图为互补突变体(togl+TOGl)。
[0047]标尺:20厘米。
[0048]图9、TOGlRNAi植株与野生型比较。
[0049]植株种植于北京的5月至9月。
[0050]标尺:20厘米。
[0051]图10、 T0G1RNA解旋活性体外验证。
[0052]泳道I为双链RNA底物，泳道2为与TOGI孵育后的RNA底物。
[0053]图11、TOGl过表达植株与野生型比较。
[0054]a、过表达型(TOGl-ox)与野生型幼苗(WT)在37°C高温下的生长情况。[0055]标尺:5厘米。
[0056]b、过表达型与野生型在北京5月至9月的自然生长情况。
[0057]标尺:20厘米。
[0058]C、北京自然环境生长(5月至9月，平均日最高温度约为30°C)的过表达型(TOGl-ox)与野生型(WT)的单株结实。
[0059]图12、北京自然环境生长的过表达型(TOGl-ox)与野生型(WT)的单株结实⑷和分蘖数目⑶统计。
[0060]图13、北京自然环境生长的过表达型(TOGl-ox)与野生型(WT)中TOGl的表达量。【具体实施方式】
[0061]以下通过实施例来进一步阐明本发明。但是应该理解，所述实施例只是举例说明的目的，并不意欲限制本发明的范围和精神。
[0062]一、水稻耐热基因的分离和遗传分析
[0063]本发明中进行图位克隆研究的高温敏感矮化水稻togl来自籼型水稻品种中籼3037自发突变。当togl种植于日最高温低于30°C的凉爽环境时，其形态特征与野生型无异；而当生长于较多天数日最高温高于30°C的夏季天气时，togl叶片变细，明显矮于野生型，结实率大幅降低；生长于更加炎热的扬州一带夏季天气时，togl更加矮化并失去结实能力(图1)。保持其它条件相同，对比不同温度下的种子萌发和幼苗生长的实验进一步确定了 togl为温度敏感突变体(图2)。togl和正常水稻品种进行正交和反交，所有Fl植株均不表现高温矮杆。而在杂交组合的F2代分离群体中，正常的和高温矮杆植株呈典型的3:1分离(320: 96)。这一结果表明togl突变体性状受单隐性基因控制。
[0064]二、图位克隆水稻耐热基因TOGl
[0065]为了克隆TOGl基因，本发明人首先将纯合的高温敏感突变体togl和中花11进行杂交，获得的F1代自交得到F2群体，对其中645个F2隐性个体(具有高温敏感表型的F2代个体)进行TOGl基因的初步定位。如图3所示,应用Sequence Tagged Site(STS,序列标签位点)分子标记，利用PCR的方法，发现位于第3号染色体上的STS标记PU P2、P3、P4、P5、P6、P7(表1)与突变位点在位置上具有明显的连锁性。突变位点和P4之间的交换单株，绝大多数在突变位点和P1、P2、P3之间也进行交换，而突变位点和P5之间的交换单株，绝大多数包含在突变位点和P6、P7之间的交换单株中。同时突变位点和P4之间的交换单株与突变位点和P5之间的交换单株不同，因此推断突变基因可能位于标记P4和标记P5之间的区域。在此基础上，进一步扩大突变体togl和中花11的杂交组合，获得了包含1272株突变单株的F2分离群体用于TOGl精细定位。参照已经完成的水稻基因组序列(http://WWW.tigr.0rg/tdb/e2kl/osal/ 和 http://btn.genomics, org.cn)，对粳稻和籼稻的序列进行比较，利用序列差异发展了 3个新的STS分子标记(表1)。最终将TOGl精细定位于BAC克隆BAC5:AC133930标记P8和PlO之间，这两个标记之间的物理距离约为25kb。利用水稻基因组注解数据库 RiceGAAS(http://ricegaas.dna.affrc.g0.jp/rgadb)分析表明，25kb区域内有4个功能注释的基因，我们将这4个基因进行DNA序列测定，比较了突变体和野生型序列，发现其中三个基因在突变体中的序列都与野生型的一致，只有一个编码DEAD-boxRNA解旋酶的基因即0s03g46610发生了突变，该基因在第一个外显子的第140位的核苷酸处发生了一个单碱基的置换即G — T，导致该处的氨基酸由一个甘氨酸转变成一个缬氨酸。因此，我们将DEAD-box RNA解旋酶基因确定为目标基因，命名为TOGl。利用水稻基因组注解数据库RiceGAAS信息表明，该基因全长为4746bp，mRNA的全长为1817bp，共有13个外显子，12个内含子，⑶S区长度为1419bp，共编码472个氨基酸。该基因在KOME (http://cdnaOl.dna.affrc.g0.jp/cDNA)水稻日本晴的cDNA数据库有完整的cDNA序列，登录号为AK067769。包含该基因完整的ORF序列，编码的氨基酸序列和包含该基因启动子序列的2kb前导序列分别见附图4、5、6。
[0066]表1用于TOGl定位的分子标记
[0067]
【权利要求】
1.一种赋予水稻耐热性状的DEAD-box RNA解旋酶TOGl，其为具有SEQ ID No:2所示的氨基酸序列的蛋白质，或者是将SEQ ID No:2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸的取代、缺失或添加且具有与SEQID No:2所示的氨基酸序列相同的活性的由SEQ ID No:2衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的DEAD-boxRNA解旋酶T0G1，其特征在于:其是具有SEQ IDNo:2所不的氣基酸序列的蛋白质。
3.TOGl的编码基因，其是下列核苷酸序列之一: 1)SEQ ID No:1所示的DNA序列； 2)与SEQID No:1所示的核苷酸序列具有90%以上同源性，且编码相同功能的蛋白质的核苷酸序列。
4.根据权利要求3所述的基因，其特征在于:所述TOGl的编码基因是SEQID No:l所示的核苷酸序列。
5.一种含有权利要求3或4所述的基因或其片段的载体。
6.权利要求5所述的载体，其为植物表达载体，优选为适于在水稻中表达的载体。
7.根据权利要求6所述的载体，其为PCAMBIA1300。
8.一种宿主细 胞，所述细胞含有权利要求3或4所述的基因或其片段，或者含有权利要求5-7任一项所述的载体。
9.根据权利要求8所述的宿主细胞，所述细胞选自大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。
10.一种培育具有提高的耐热性的植物的方法，所述方法包括用权利要求5-7任一项所述的载体转化所述植物的细胞或组织，并且将转化的植物细胞或组织培育成植株。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述转化通过农杆菌介导法或基因枪法进行。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中所述植物为禾本科植物，优选水稻。
【文档编号】C12N5/10GK103898078SQ201210574391
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2012年12月26日 优先权日:2012年12月26日
【发明者】薛勇彪, 王冬, 程祝宽, 覃宝祥, 张玉娥 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所