专利名称：一种定向克隆方法及载体的改造方法及t载体的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域，尤其涉及一种定向克隆方法及载体的改造方法及T载体。
背景技术：
PCR是目前体外基因扩增最常用的方法，对PCR产物进行快速有效的克隆，是开展基因保存、扩增，测序以及表达的有效方法。为此，国内外许多学者探索了很多不同的克隆方法。常用的方法有非定向克隆和定向克隆，这两种方法都建立了相应载体，不过这些现有的克隆载体虽然都能够达到克隆的目的，但是也各有一定的不足之处。
T载体快速高效克隆PCR产物的明显优势显示了其在构建各种基因文库中的应用前景，由于载体3 ’端各有一个突出的3 ’ dT残基，恰好可与PCR产物末端由于Taq DNA聚合酶非模板依赖的末端转移酶活性而添加的dA(脱氧腺苷)互补配对，这种以粘性互补配对连接到载体上，称为T-A克隆，具有操作简单、快速高效、阳性克隆比例高等优点，从而大大提高PCR产物的连接效率。然而，T载体也有一定的不足之处，由于载体与PCR产物两端均是T-A连接，因此PCR产物可能正向连接或反向连接载体，无法实现定向克隆，需经送样测序后方可知产物与载体连接方向。目前商业化的T载体如pMD-18T，pGEM-T等均是是克隆型载体，仅能克隆扩增DNA片段，测序等功能，不能用于表达蛋白，另外还存在载体易发生自连，阳性克隆难以筛选等问题。
T载体按照功能可分为克隆型T载体与表达型T载体，目前市场上供应的T载体主要是克隆型T载体，具有克隆目的基因的功能，仅满足扩增和测序的需要。若要表达目的基因，还需要将目的基因重组至表达载体中。表达型T载体同时满足基因克隆和表达的需要，可直接连接目的基因进行蛋白质表达分析，操作简便，避免过多操作步骤影响目的基因的序列。但是制备高效表达型T载体有很多难点。克隆型T 载体无需顾及目的DNA片段的连接方向，只需有复制起点、筛选标记即可，而表达型T载体除了上述要素外，还需要转录/翻译的必要元件-启动子，终止子等，另外必须顾及上下游的表达调控元件，它们均需要严格的方向次序排列。由于表达型T载体与目的基因PCR片段连接两端仍然是是同样的 T-A连接，同样目的基因PCR片段与载体可发生正向或反向连接的情况，不能以确定的方式连接，基因表达要求目的基因必需以正确的方向连接方可表达出目的蛋白，所以，基因PCR 片段与载体连接后必需先转入细胞，挑取一批单克隆菌株进行培养，表达前必须送样测序， 等待测序结果时间较长，不仅拖延实验的进度，而且耗费大量的人力物力，需要从众多测序结果中经过序列比对确认目的基因的连接方向，方能进行表达，这大大增加了研究开发的困难。由于上述的问题限制了表达型T载体应用范围，目前市面上仅有少数的几种表达型 T载在售，并且因为上述各种原因导致极少人愿意采用。
因此，现有技术有待于完善和发展。发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种定向克隆方法及载体的改造方法及T载体，利用可变限制性内切酶Xcm I制备出可进行高效快捷的能定向克隆T载体，旨在解决现有T载体不能进行定向克隆的问题。
为了解决上述技术问题，本发明的技术方案如下
在本发明中，提供一种定向克隆的方法，是一种T-A定向克隆方法，其具体包括以下步骤
设计并合成酶切盒所述酶切盒的两端带有Xcm I内切酶酶切位点，并在所述酶切盒的两端分别添加其他酶切位点；
构建T载体将所述酶切盒构建到载体上，得到带有两个Xcm I内切酶酶切位点的 T载体；
形成两端带有突出的dT的线性化的T载体采用Xcm I内切酶对所述第二表达载体进行单酶切，形成两端带有突出的dT的线性化的T载体；
生成目标基因PCR片段将目标基因片段用PCR扩增方法在5’或3’端加入一个与T载体的3’或5’端所对应相同的限制性内切酶位点，得到目标基因PCR片段，所述所对应相同的限制性内切酶位点在目标PCR片段中与T载体中均有且仅有一个；
构建含有目标基因的重组载体用T4连接酶把目标基因PCR片段与T载体连接起来构成含有目标基因的重组载体。
所述定向克隆的方法，还包括以下步骤
转化和鉴定将所述含有目标基因的重组载体转入大肠杆菌感受态细胞中，通过涂抗性平板得到单克隆菌落，挑取单克隆菌落进行扩大培养，然后提取质粒，再用限制性内切酶进行单酶切鉴定，确定目标基因的连接方向；
其中，转化和鉴定步骤中所述的限制性内切酶为生成目标基因PCR片段步骤中所述的限制性内切酶位点所对应的限制性内切酶。
具体地，所述设计并合成酶切盒步骤中，包括以下步骤
合成标记基因，所述标记基因用于鉴定和筛选所述酶切盒是否成功地扩增出所述酶切盒；
在所述标记基因的两端添加多个酶切位点；其中，所述标记基因的两端均添加有一 Xcm I内切酶酶切位点；
扩增所述酶切盒片段，并进行鉴定通过PCR扩增所述酶切盒片段，并进行电泳鉴定。
所述构建T载体步骤中，包括以下步骤
将所述酶切盒片段与pMD-19T载体相连，得到带有所述酶切盒的第一重组载体；
将所述第一重组载体转化到感受态细胞中，培养后挑取单菌落，进行扩大培养，从菌液中提取所述第一重组载体；
对载体和所述第一重组载体分别用同样的限制性内切酶进行双酶切；其中，进行双酶切所采用的限制性内切酶不是Xcm I内切酶；
回收所述第一重组载体切出的酶切盒片段和酶切后的载体；
将所述重组载体切除的酶切盒片段和酶切后的载体进行连接，形成第二重组载体；
将第二重组载体转化至感受态细胞，培养后挑取单菌落，进行扩大培养，从菌液中提取所述第二重组载体；
对所述第二重组载体用同样的限制性内切酶进行双酶切酶切鉴定，经鉴定正确后，得到带有两个Xcm I内切酶酶切位点的T载体。
其中，所述载体可以为克隆型以及表达型载体。所述载体可以原核表达载体或真核表达载体。
所述生成目标基因PCR片段步骤中，具体地为
将目标基因片段用PCR扩增方法在5’端加入一个与T载体的3’端所对应相同的限制性内切酶位点，或是，将目标基因片段用PCR扩增方法在3’端加入一个与T载体的5’ 端所对应相同的限制性内切酶位点，得到目标基因PCR片段，所述所对应相同的限制性内切酶位点在目标PCR片段中与T载体中均有且仅有一个。
本发明中还提供一种载体的改造方法，其具体包括以下步骤
设计并合成酶切盒所述酶切盒的两端带有Xcm I内切酶酶切位点，并在所述酶切盒的两端分别添加其他酶切位点；
构建T载体将所述酶切盒构建到载体上，得到带有两个Xcm I内切酶酶切位点的 T载体。
所述载体的改造方法还包括以下步骤
将所述T载体用Xcm I内切酶进行单酶切，形成两端带有突出的dT的线性化的T 载体。
另外，本发明中还提供一种T载体，所述T载体为具有定向克隆功能的T载体，是采用上述的表达载体的改 造方法对现有表达载体进行改造得到的。其中，所述现有表达载体包括克隆型载体以及表达型载体。
本发明所提供的T-A定向克隆技术能广泛用于PCR产物的直接定向克隆，具有很高的应用价值，有以下几方面的积极效果1、PCR产物无需酶切、纯化，连接载体后用单酶切确定连接方向，以简单快捷的方法实现定向克隆，然后直接进行表达，节省宝贵的研究时间。而且，本发明所构建T载体无需事先进行双酶切，纯化回收等各种步骤，制备方法简单一步到位，与传统的定向克隆和T-A克隆方法相比具有明显优势。2、操作简化，重组载体经单酶切鉴定连接方向后即可立即进行蛋白表达的等工作。3、与传统方法相比，经单酶切鉴定后的重组载体测序的成功率提闻很多，能达到100%准确。
图1为PCR片段3’端引入酶切位点A顺式连接示意图。
图2为PCR片段3’端引入酶切位点A反式连接示意图。
图3为PCR片段5’端引入酶切位点D顺式连接示意图。
图4为PCR片段5’端引入酶切位点D反式连接示意图。
图5为实施例1中pQE-T构建过程技术路线图。
图6为实施例1中pQE-T酶切位点示意图。
图7为实施例1中酶切盒片段的电泳鉴定的结果图。其中，M TaKaRa5, OOOMarker ；1:酶切盒PCR产物。
图8为实施例1中pT-Q质粒和双酶切电泳图。其中，M =TaKaRa 5000Marker ；1 pT-Q ;2 :pT-Q 双酶切后(EcoR I/Hind III)。
图9为实施例1中pQE-T载体设计及鉴定电泳图。其中，M TaKaRa5, OOOMarker ；1:酶切盒 PCR 产物 T-Q ；2 pT-Q ；3 :pT_Q 双酶切产物(EcoR I/Hind III) ；4 :pQE_TX ；5 pQE-ΤΧ 双酶切产物(EcoR I/Hind III) ;6 :pQE_TX 单酶切产物(Xcm I)。
图1Oa为实施例1中pQE_TX质粒5’端的DNA测序图。
图1Ob为实施例1中pQE-TX质粒3’端的DNA测序图。
图11为实施例1中pQE-T载体与hRBP连接鉴定的结果图。其中，l:TaKaRa 5，OOOMarker ；2 hRBP读码框PCR产物；3 pQE-T载体与hRBP连接后的菌液质粒；4 2中质粒BamH I单酶切产物。
图12为实施例1中重组hRBP在大肠杆菌表达的SDS-PAGE图谱。其中，M :标准蛋白分子量Marker ；1 BL21空白对照；2_5 :1PTG诱导含pQE_hRBP重组质粒的BL21表达，诱导时间分别是0，1，3，5小时。
图13为实施例1中RBP蛋白的western blotting检测结果图。其中,M:标准蛋白Marker ；1:1PTG诱导含pQE_hRBP重组质粒的BL21表达。
图14为实施例1中RBP蛋白指纹图谱。
图15为实施例2中构建的T载体的技术路线图。
图16为实施例2中pYD-T载体结构示意图。
图17为实施例2中酶切盒PCR反应的引物酶切位点分布图(序列空格处为区分酶切位点序列而设置，无其他特殊意义)。·
图18为实施例2中重组质粒构建与鉴定电泳图。其中，M 5000bpMarker ；1 :酶切盒PCR产物；2 pMD-YFP质粒；3 :pMD_YFP质粒NheI和Xho I双酶切；4 pYD-T质粒；5 pYD-T质粒Nhe I和Xho I双酶切；6 pYD-T质粒Xcm I单酶切。
图19为实施例2中pYD-YFP载体转化酵母在激光共聚焦显微镜下的表面展示情况。其中图19. pYD-YFP载体转化酵母在激光共聚焦显微镜下的表面展示情况。其中，A :在青色荧光激发下的酵母表面整体观察图(激发光波长457nm) ；B :在可见光下的酵母表面整体观察图；C :在青色荧光激发下的酵母表面与在可见光下的酵母表面整体观察图的重叠图；D :在青色荧光激发下的酵母表面的局部放大图；E :在可见光下的酵母表面结构图；F 在青色荧光激发下的酵母表面结构图与在可见光下的酵母表面结构图的重叠图。
图20为实施例2中PYD-RFP质粒鉴定电泳图。其中，M 5000bp Marker ；1 :红色荧光蛋白质粒；2 pYD-RFP质粒；3 pYD-RFP质粒经BamH I单酶切。
图21为实施例2中pYD-RFP在激光共聚焦显微镜下的整体观察图。其中，A :在紫外光激发下的酵母表面结构图(激发光波长407nm) ；B :在可见光下的酵母表面结构图；C 在紫外光激发下的酵母表面结构图与在可见光下的酵母表面结构图的重叠图。
具体实施方式
本发明提供一种定向克隆方法及载体的改造方法及T载体，为使本发明的目的、 技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
由于T载体在线性质粒DNA的3’末端均连接有一个-T残基，因此可与以3’有-A 残基PCR产物连接，目的基因不能以特定的方向与载体连接，可正向或反向连接，因此无法实现定向克隆。本发明利用可变限制性内切酶Xcm I制备出可进行高效快捷的能定向克隆的T载体。用本发明方法改造表达载体而成的定向克隆T载体可直接用于蛋白表达研究。 与传统分子生物学方法相比，目的基因的PCR产物无需酶切、纯化，直接通过TA克隆重组于载体，通过挑取单克隆菌落提取质粒并进行简单的单酶切鉴定即可确定目的基因的连接方向，而无需通过传统的测序等繁琐步骤才能确定连接方向，以简单快捷、准确高效的方式实现定向克隆。本技术所构建T载体无需事先进行双酶切，纯化、回收等繁琐步骤，具有明显优势，该方法简单有效无需昂贵的器材，一般条件的实验室均可操作实行。
具体的，本发明是利用可变限制性内切酶Xcm I构建的酶切盒，5’和3’端设有多个不同的限制性酶切位点，构建到表达载体上，通过Xcm I单酶切生成两端带有突出的‘T’ 的克隆位点(T Cloning Site),目标基因片段用PCR扩增方法在5’或3’端加入一个与T 载体的3’或5’端所对应相同的限制性内切酶位点(该限制性内切酶位点务必确保在目标 PCR片段中与T载体中均有且仅有一个)，然后用T4连接酶把目标基因PCR片段与T载体连接起来构成重组载体，再转入大肠杆菌感受态细胞中，通过涂抗性平板得到单克隆菌落，挑取数个至十多个菌落扩大培养，然后提取质粒，再用所设的限制性内切酶进行单酶切鉴定， 如果能切出与目标基因PCR片段大小相约的片段，即可鉴定为正向连接。
所述鉴定过程和原理如下
一、假设目标基因PCR片段在3’端加入一个和T载体的5’端所对应相同的限制性内切酶位点A (可选A或者B限制性内切酶位点)，用T4连接酶把目标基因PCR片段与T 载体连接起来构成重组载体会出现两种的连接情况顺式连接和反式连接。若是顺式连接时如图1所示，用限制性内切酶A进行单酶切鉴定，会出现与目标基因PCR片段大小相约的片段(约多了十多bp)。如若是反式连接就会出现如图2所示结果，用限制性内切酶A进行单酶切鉴定，只能得到长度约为二十来个bp的片段，实际上在琼脂糖凝胶电泳中是看不到条带的。因此能鉴定出克隆片段是正向或反向连接。
二、假设目标基因PCR片段在5’端加入一个和T载体的3’端所对应相同的限制性内切酶位点D (可选C或者D限制 性内切酶位点)，用T4连接酶把目标基因PCR片段与T 载体连接起来构成重组载体会出现两种的连接情况顺式连接和反式连接。若是顺式连接时如图3所示，用限制性内切酶D进行单酶切鉴定，会出现与目标基因PCR片段大小相约的片段(约多了十多bp)。如若是反式连接就会出现如图4所示结果，用限制性内切酶D进行单酶切鉴定，只能得到长度约为二十来个bp的片段，实际上在琼脂糖凝胶电泳中是看不到条带的。因此能鉴定出克隆片段是正向或反向连接。
在下面实施例中将通过改造原核表达载体pQE_30a和真核表达载体PYD-1来进一步详细说明本发明的方案。
实施例1 :原核表达型T-载体的构建
通过对原核表达载体pQE_30a进行改造，设计出利用两端带有Xcm I内切酶酶切位点的含有卡那霉素抗性基因的酶切盒，酶切盒两端添加其它酶切位点，然后再通过重组技术定向克隆两端带有Xcm I内切酶位点的含有卡那霉素抗性基因的酶切盒到pQE-30a载体上相应的酶切位点，将测序正确的重组的质粒再用Xcm I内切酶单酶切，把带有卡那霉素抗性基因的片段切下来，从而形成两端带有突出的dT的线性化的T-载体。最后，利用人视黄醇结合蛋白(hRBP)来鉴定构建的T载体的表达功能，通过把hRBP基因的DNA片段PCR后用T4连接酶和线性化的T载体连接，然后导入表达菌大肠杆菌BL21中进行诱导表达，通过 Western Blotting检测、hRBP蛋白质谱检测所表达的目标蛋白，由此证明所构建的T载体的正确性。
1.1实验材料
1.1.1 基因
人视黄醇结合蛋白基因(hRBP)。
1.1. 2 菌株
大肠杆菌JM107 基因型endAl, yrA96, thi, hsdR17, supE44, relAl, Δ (lac-proAB)/F' [traD36, proAB+, lac Iq, IacZ Δ M15]；
大肠杆菌BL21 (DE3)基因型F’ , ompT, hsdSB (rB-mB~), gal ( λ cI857, indl, Sam7, nin5,lacUV5_T7genel), dcm(DE3)。
1.1.3 质粒
酶切盒所需材料pET-28a、pQE-30a。
1.1.4主要试剂
限制性核酸内切酶EcoRI, Hind III, Nco I，BamH I, Xcm I。
抗生素卡那霉素((Kanamycin,Kana),氨节西林(Ampicillin, Amp)
琼脂糖,蛋白胨,酵母提取物(yeast extract),氯化钠(NaCl),氢氧化钠(NaOH), 30%丙烯酰胺(ACRY)，异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，Tris-HCl缓冲液(1. 5mol/ L pH8. 8 ；0. 5mol/L ρΗ6· 8)，N，N，N’，N’-四甲基二乙胺(TEMED)。其他试剂均为国产分析纯。
1.1. 5主要仪器设备高压灭菌锅、电子天平、PCR扩增仪、琼脂糖凝胶电泳仪、分光光度计、电热恒温培养箱、恒温培养振荡器、冷冻离心机等。
1.1. 6主要试剂的配制
琼脂糖凝胶电泳缓冲液50X TAE Buffer 242g Tris碱，57.1ml HAc, IOOml O. 5M EDTA (pH8. O)，定容至 1000ml。使用时稀释为 IXTAE Buffer。
LB培养基IOg Trypeptone, 5g Yeast extract, IOg NaCl,加 ddH20至 1000ml，用 5M的NaOH调pH至7. 2后进行高压灭菌。
1. 5M Tris-HCKpH 8.8) Tris 18. 17g 加 ddH20 溶解，浓盐酸调 pH 至 8. 8，定容至 IOOml。
IM Tris-HCKpH 6.8) =Tris 12.1lg 加 ddH20 溶解，浓盐酸调 pH 至 6. 8，定容至 IOOml。
10%SDS :电泳级SDS 10. Og加ddH20 68 °C助溶，浓盐酸调至pH 7. 2，定容至 IOOml。
IOX 电泳缓冲液(pH 8.3) Tris 3. 02g，甘氨酸 18. 8g，10%SDS IOml 加 ddH20 溶解，定容至100ml。使用时稀释为IX电泳缓冲液。
10% 过硫酸铵(AP) 0.1gAP 加 ddH20 至 Iml。
2 X SDS 电泳上样缓冲液1M Tris-HCl (pH 6. 8)2. 5ml, β -巯基乙醇1. 0ml, SDSO. 6g，甘油 2. Oml, O. 1%，溴酚兰1. 0ml, ddH20 3. 5ml。
考马斯亮兰染色液考马斯亮兰O. 25g，甲醇225ml，冰醋酸46ml，ddH20 225ml。
脱色液甲醇、冰醋酸、ddH20以3 I 6配制而成。
IPTG储液(200mg/ml):在800 μ I蒸馏水中溶解200mg IPTG后，用蒸馏水定容至 lml，用O. 22 μ m滤膜过滤除菌，分装于1. 5ml离心管并储于_20°C中。
氨节青霉素(Ampicillin Amp)母液将氨节青霉素粉末配成100mg/ml水溶液，-20°C保存备用。
卡那霉素((Kanamycin, Kana)母液将卡那霉素粉末配成1000mg/ml水溶液, 于-20°C保存备用。
1.1. 7培养基的配制
大肠杆菌LB 培养基(液体)IOg Trypeptone, 5g Yeast extract, IOg NaCl,加去离子水至950ml，用5M NaOH调pH至7. 2，定容至1000ml，高压灭菌(121 °C，20min)后使用 (固体培养基需要加入1. 5%琼脂，再进行灭菌)。
涂平板前需要加热固体培养基至完全溶解，放到无菌操作台内，使温度降至60°C 以下，加入2%。的氨苄，混匀后迅速倒平板。倒好的平板晾干后放入4°C冰箱待用。
1. 2实验方法
1. 2.1酶切盒的设计与合成
设计克隆卡那霉素抗性基因(Kana)的引物pQE_T Pl，pQE_T P2，引物序列如表2.所示，以pET-28a质粒为模板经过PCR扩增出Kana片段(利用引入Kana抗性进行目标克隆的筛选)，再转入PMD-19T中进行扩增卡那霉素基因表达盒片段。包含有多个酶切位点 (EcoR I，Hind III，Nco I，Xcm I，BamH I)。其中Xcm I内切酶酶切位点在卡那霉素基因表达盒的两端，另外，在其3’端加上6个His标签，如图5，图6所示。本实验所需PCR引物如表2.所示。
表2.本实验所需的引物
权利要求
1.一种定向克隆的方法，其特征在于，具体包括以下步骤 设计并合成酶切盒所述酶切盒的两端带有Xcm I内切酶酶切位点，并在所述酶切盒的两端分别添加其他酶切位点； 构建T载体将所述酶切盒构建到载体上，得到带有两个Xcm I内切酶酶切位点的T载体； 形成两端带有突出的dT的线性化的T载体采用Xcm I内切酶对所述第二表达载体进行单酶切，形成两端带有突出的dT的线性化的T载体； 生成目标基因PCR片段将目标基因片段用PCR扩增方法在5’或3’端加入一个与T载体的3’或5’端所对应相同的限制性内切酶位点，得到目标基因PCR片段，所述所对应相同的限制性内切酶位点在目标PCR片段中与T载体中均有且仅有一个； 构建含有目标基因的重组载体用T4连接酶把目标基因PCR片段与T载体连接起来构成含有目标基因的重组载体。
2.根据权利要求1所述的定向克隆的方法，其特征在于，所述定向克隆的方法还包括以下步骤 转化和鉴定将所述含有目标基因的重组载体转入大肠杆菌感受态细胞中，通过涂抗性平板得到单克隆菌落，挑取单克隆菌落进行扩大培养，然后提取质粒，再用限制性内切酶进行单酶切鉴定，确定目标基因的连接方向； 其中，转化和鉴定步骤中所述的限制性内切酶为生成目标基因PCR片段步骤中所述的限制性内切酶位点所对应的限制性内切酶。
3.根据权利要求1所述的定向克隆的方法，其特征在于，所述设计并合成酶切盒步骤，包括以下步骤 合成标记基因，所述标记基因用于鉴定和筛选所述酶切盒是否成功地扩增出所述酶切盒; 在所述标记基因的两端添加多个酶切位点，其中，所述标记基因的两端均添加有一 XcmI内切酶酶切位点； 通过PCR扩增所述酶切盒片段。
4.根据权利要求1所述的定向克隆的方法，其特征在于，所述构建T载体步骤中，包括以下步骤 将所述酶切盒片段与PMD-19T载体相连，得到带有所述酶切盒的第一重组载体； 将所述第一重组载体转化到感受态细胞中，培养后挑取单菌落，进行扩大培养，从菌液中提取所述第一重组载体； 对载体和所述第一重组载体分别用同样的限制性内切酶进行双酶切； 回收所述第一重组载体切出的酶切盒片段和酶切后的载体； 将所述重组载体切出的酶切盒片段和酶切后的载体进行连接，形成第二重组载体； 将第二重组载体转化至感受态细胞，培养后挑取单菌落，进行扩大培养，从菌液中提取所述第二重组载体； 对所述第二重组载体用上述同样的限制性内切酶进行酶切鉴定，经鉴定正确后，得到带有两个Xcm I内切酶酶切位点的T载体。
5.一种载体的改造方法，其特征在于，包括以下步骤设计并合成酶切盒所述酶切盒的两端带有Xcm I内切酶酶切位点，并在所述酶切盒的两端分别添加其他酶切位点； 构建T载体将所述酶切盒构建到载体上，得到带有两个Xcm I内切酶酶切位点的T载体； 所述载体为待改造的载体，所述载体为克隆型载体或表达型载体。
6.根据权利要求5所述的载体的改造方法，其特征在于，所述设计并合成酶切盒步骤，包括以下步骤 合成标记基因，所述标记基因用于鉴定和筛选所述酶切盒是否成功地扩增出所述酶切盒; 在所述标记基因的两端添加多个酶切位点，其中，所述标记基因的两端均添加有一 XcmI内切酶酶切位点； 通过PCR扩增所述酶切盒片段。
7.根据权利要求6所述的载体的改造方法，其特征在于，所述构建T载体步骤，包括以下步骤 将所述酶切盒片段与PMD-19T载体相连，得到带有所述酶切盒的第一重组载体； 将所述第一重组载体转化到感受态细胞中，培养后挑取单菌落，进行扩大培养，从菌液中提取所述第一重组载体； 对载体和所述第一重组载体分别用同样的限制性内切酶进行双酶切； 回收所述第一重组载体切出的酶切盒片段和酶切后的载体； 将所述重组载体切出的酶切盒片段和酶切后的载体进行连接，形成第二重组载体； 将第二重组载体转化至感受态细胞，培养后挑取单菌落，进行扩大培养，从菌液中提取所述第二重组载体； 对所述第二重组载体用上述同样的限制性内切酶进行酶切鉴定，经鉴定正确后，得到带有两个Xcm I内切酶酶切位点的T载体。
8.根据权利要求7所述的载体的改造方法，其特征在于，所述载体的改造方法还包括以下步骤 将所述T载体用Xcm I内切酶进行单酶切，形成两端带有突出的dT的线性化的T载体。
9.一种T载体，所述T载体为具有定向克隆功能的T载体，其特征在于，所述T载体是采用如权利要求61任一所述的载体的改造方法对载体进行改造得到的； 所述载体为克隆型载体或表达型载体。
10.根据权利要求9所述的T载体，其特征在于，所述载体为原核表达载体pQE-30a或真核表达载体PYD-1。
全文摘要
本发明公开了一种定向克隆方法及载体的改造方法及T载体，所述定向克隆的方法包括设计并合成酶切盒、构建T载体、形成两端带有突出的dT的线性化的T载体、生成目标基因PCR片段、构建含有目标基因的重组载体。本发明定向TA克隆技术可用作制备高效的定向克隆的T载体，在分子生物学实验中广泛应用于PCR产物的克隆和表达。由于本发明改造的是表达载体，PCR产物可直接连接该载体，经单酶切鉴定后确定目的基因的连接方向，即可转入细胞内进行表达，而无需通过传统的测序等繁琐步骤才能确定连接方向，以简单快捷的方法实现定向克隆，一步构建出工程菌，应用前景广阔。
文档编号C12N15/66GK103014046SQ20121043968
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月7日 优先权日2012年11月7日
发明者田生礼, 梁志成, 梁秀怡, 刘士德 申请人:深圳大学