专利名称：一种海参体表细菌dna提取方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种海参体表细菌DNA提取方法。
背景技术：
近些年随着我国水产养殖、加工业的飞速发展，仿刺参养殖与加工数量逐年递增。开展仿刺参体表、肠道菌群多样性分析，可以为海参的微生态·学研究提供极好的原始资料和数据、为更好的了解海参携带的生物信息、为我国海参养殖和加工业的健康发展提供良好帮助。细菌总DNA提取方法较多，主要有CTAB、试剂盒、苯酚氯仿抽提等方法，在实际操作中切实可行。仿刺参表皮含有大量的粘液物质，其富含蛋白质和粘多糖，按照通用细菌总DNA提取方法，根本无法正常提取到海参体表细菌总DNA，提取的细菌DNA电泳图拖尾严重。根据多年的实验摸索和反复操作，在CTAB方法基础上，增加了样品前处理以降低样品的粘度，以及采用增加蛋白酶量和CTAB溶液去除杂蛋白和粘多糖物质，可获得理想的海参体表细菌DNA。微生物在自然界分布广泛，细菌DNA的提取极易受其所处环境的影响。通常处于空气、水体、土壤中的细菌可采用常规的细菌DNA提取方法。而附生、寄生的细菌通常处于植物或动物的体表或体内，生存环境富含多糖和蛋白质等营养物质，采用常规方法很难将它们与宿主分离，因此常规方法无法获得此类细菌DNA，这个问题一直困扰着此领域的研究者。
发明内容
为解决上述技术问题所采用的技术方案是在对海参体表细菌DNA提取过程中，本发明主要目的是去除杂蛋白、粘多糖对样品的干扰，降低样品粘度以利于体表细菌的溶出。首先对样品进行超低温冷冻以降低样品粘度，利于样品中的细菌分散到具有缓冲、降低粘度的洗脱液I中；在菌体收集步骤中，通过多次低速离心除去样品中糊状的多糖和蛋白；增加了粘多糖和杂蛋白的脱除步骤，裂解液中添加了 CTAB溶液以去除粘多糖，添加蛋白酶K进一步去除可溶性杂蛋白的干扰；最终通过洗脱液II抽提，获得细菌DNA。本发明所述的一种海参体表细菌DNA的提取方法，其包括以下步骤，(I)海参样品处理取鲜活海参用无菌生理盐水冲洗三次，无菌封装后，迅速放置_80°C保存24h，取出海参在无菌条件下，用无菌刀片刨刮海参体表，将刨刮物放于无菌离心管中，50mL离心管装6 10g (湿重)海参体表刨刮物；( 2 )海参体表菌体收集①向步骤(I)获得的离心管中，加入15 20mL洗脱液I，常温下300rpm震荡5 10min，使刨刮下的海参体表粘稠物与洗脱液I充分混合；②4°C下IOOOrpm离心5 8min，去除下层海参组织沉淀物及上层糊状物，将剩余液体转移到另一无菌离心管中；③重复步骤②直至完全去除沉淀物和糊状物；④将步骤③所得液体分装于I. 5mL离心管，并于4V IOOOOrpm离心f 2min，收集沉淀，即为海参体表菌体沉淀物；(3)粘多糖和杂蛋白的脱除于步骤④所得海参体表菌体沉淀物中，加入500uL裂解液，吹打至沉淀悬浮，然后55°C孵育震荡l 3h，直到悬浮液澄清，简短离心以去除管盖内壁水珠。
(4)细菌破壁 上述液体中加入180uL溶菌酶(20mg/mL)，于37°C孵育酶解30min以上，期间间隔 震荡直到产生的白色沉淀消失，简短离心以去除管盖内壁水珠。(5)抽提、纯化⑤向步骤(4)获得的酶解液中加入300uL苯酚和300uL洗脱液II，充分混匀后40C 12000rpm 离心 10 15min ；⑥吸取步骤⑤中上清液500uL,加入洗脱液II 500uL于I. 5mLEppendorf试管中，混勻后 4°C 12000rpm 离心 IOmin ； ⑦吸取步骤⑥中上清液400uL，加入无水乙醇(事先于-20 V预冷)800uL于
1.5mLEppendorf 试管中，混勻后-20°C静置 20min,4°C下 12000rpm 离心 IOmin ；⑧白色沉淀用70%的乙醇洗涤2 3次，晾干后溶于IOOuL无菌超纯水中，轻轻震荡直至沉淀溶解，或放置于50uL缓冲液TE中，于-20°C条件下贮存。其中，本发明上述技术方案中使用的部分试剂的配制方法如下洗脱液I :磷酸二氢钾0. 27g，磷酸氢二钠1. 42g，氯化钠8g，氯化钾0. 2g，加去离子水约700mL充分搅拌溶解,用盐酸调pH至7. 4,最后定容到1L。然后加入200mL的CTAB溶液，高温高压灭菌后室温保存。裂解液3mL的CTAB溶液中，加入6uL的β -巯基乙醇和30uL蛋白酶K (50mg/Π Τ,)ηCTAB 溶液100mmol/L Tris-Hcl, 20mmoI/L 的 EDTA，I. 4mol/L 的 NaCl。5XTE 缓冲液将 Tris 54g，硼酸 25g，0. 5mol/L EDTA (ρΗ8· O) 20mL，加去离子水定各至IL后,混勾后放在4 C冰箱中保存。洗脱液II :异戊醇氯仿的体积比为1:24。本发明的创新特征是采用常用的试验试剂，无需特殊的实验条件，操作简单，重复性好，细菌DNA提取质量高。该方法适用于从富含多糖、蛋白样品中提取细菌DNA，具有广泛的应用范围和应用前景。
图I为利用试剂盒法提取的细菌总DNA电泳图，其中泳道I为DL15000MARK，泳道
2、3为细菌DNA，拖尾严重。图2为利用CTAB法提取的细菌总DNA电泳图，其中泳道I为DL2000MARK，泳道2、3为细菌DNA，有拖尾干扰。
图3为利用苯酚氯仿法提取的细菌总DNA电泳图，其中泳道I为DL15000MARK，泳道2、3为细菌DNA，拖尾严重。图4 :为利用本实验方法提取的细菌总DNA电泳图，其中泳道I为DL15000MARK，泳道2、3为细菌DNA，细菌DNA提取质量高。图5 :细菌16S rRNA电泳图，其中泳道1、4的Marker为DL2000MARK，中间泳道2、3为PCR产物，大小约1500bp。图6 :阳性克隆子进行菌落PCR扩增电泳图，其中泳道I和12均为DL2000MARKplus5, OOObp 3，OOObp，泳道 2 11 为 PCR 扩增产物，大小约为 1650bp。图7 :仿刺参体表细菌系统发育树。
具体实施例方式下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。本发明实施例中所述方法中涉及的溶液，按下述方法配制洗脱液I :磷酸二氢钾0. 27g，磷酸氢二钠1. 42g，氯化钠8g，氯化钾0. 2g，力口去离子水约700mL充分搅拌溶解,用盐酸调pH至7. 4,最后定容到1L。然后加入200mL的CTAB溶液，高温高压灭菌后室温保存。裂解液3mL的CTAB溶液中，加入6uL的β -巯基乙醇和30uL蛋白酶K (50mg/Π Τ,)ηCTAB 溶液100mmol/L Tris-Hcl, 20mmoI/L 的 EDTA，I. 4mol/L 的 NaCl。5XTE 缓冲液将 Tris 54g，硼酸 25g，0. 5mol/L EDTA (ρΗ8· O) 20mL，加去离子水定各至IL后,混勾后放在4 C冰箱中保存。洗脱液II :异戊醇氯仿的体积比为1:24。实施例II、海参样品处理取刚打捞上来的鲜活仿刺参用无菌生理盐水冲洗三次，无菌封装后，迅速放置_80°C保存24h，取出海参在无菌条件下，用无菌刀片刨刮海参体表，将刨刮物放于无菌离心管中，每个50mL离心管装约6g海参体表刨刮物；2、海参体表菌体收集①向步骤(I)获得的离心管中，加入15mL洗脱液I ,常温下300rpm震荡5min,将刨刮下的海参体表物质与洗脱液I充分混合；②4°C下IOOOrpm离心5min，去除下层海参组织沉淀物及上层糊状物，将剩余清澈液体转移到另一无菌离心管中；③重复步骤②直至完全去除沉淀物和糊状物；④将步骤③所得清澈液体分装于I. 5mL离心管，并于4°C IOOOOrpm离心lmin，收集沉淀，即为海参体表菌体沉淀物；3、粘多糖和杂蛋白的脱除于步骤④所得海参体表菌体沉淀物中,加入500uL裂解液,吹打至沉淀悬浮,然后55°C孵育震荡lh，直到悬浮液澄清，简短离心以去除管盖内壁水珠。
4、细菌破壁上述液体中加入180uL溶菌酶(20mg/mL)，于37°C孵育酶解30min，期间间隔震荡直到产生的白色沉淀消失，简短离心以去除管盖内壁水珠。5、抽提、纯化⑤向步骤4获得的酶解液中加入300uL苯酚和300uL洗脱液II，充分混匀后4°C，12000rpm 离心 IOmin ；⑥吸取步骤⑤中上清液500uL,加入洗脱液II 500uL于I. 5mLEppendorf试管中，混勻后 4°C 12000rpm 离心 IOmin ；⑦吸取步骤⑥中上清液400uL，加入无水乙醇(事先于-20 V预冷)800uL于
I.5mLEppendorf 试管中，混勻后-20°C静置 20min,4°C下 12000rpm 离心 IOmin ；·
⑧白色沉淀用70%的乙醇洗涤3次，晾干后溶于IOOuL无菌超纯水中，轻轻震荡直至沉淀溶解，或放置于50uL缓冲液TE中，于-20°C条件下贮存。实施例2I、海参样品处理取刚打捞上来的鲜活海参用无菌生理盐水冲洗三次，无菌封装后，迅速放置_80°C保存24h，取出海参在无菌条件下，用无菌刀片刨刮海参体表，将刨刮物放于无菌离心管中，每个50mL离心管装约7g海参体表刨刮物；2、海参体表菌体收集①向步骤(I)获得的离心管中，加入18mL洗脱液I ,常温下300rpm震荡6min,将刨刮下的海参体表物质与洗脱液I充分混合；②4°C下IOOOrpm离心6min，去除下层海参组织沉淀物及上层糊状物，将剩余清澈液体转移到另一无菌离心管中；③重复步骤②直至完全去除沉淀物和糊状物；④将步骤③所得清澈液体分装于I. 5mL离心管，并于4°C IOOOOrpm离心2min，收集沉淀，即为海参体表菌体沉淀物；3、粘多糖和杂蛋白的脱除于步骤④所得海参体表菌体沉淀物中，加入500uL裂解液，吹打至沉淀悬浮，然后55°C孵育震荡2h，直到悬浮液澄清，简短离心以去除管盖内壁水珠。4、细菌破壁上述液体中加入180uL溶菌酶(20mg/mL)，于37°C孵育酶解40min以上，期间间隔震荡直到产生的白色沉淀消失，简短离心以去除管盖内壁水珠。5、抽提、纯化⑤向步骤4获得的酶解液中加入300uL苯酚和300uL洗脱液II，充分混匀后4°C，12000rpm 离心 15min ；⑥吸取步骤⑤中上清液500uL,加入洗脱液II 500uL于L 5mLEppendorf试管中，混勻后 4°C，12000rpm 离心 IOmin ；⑦吸取步骤⑥中上清液400uL，加入无水乙醇(事先于-20 V预冷)800uL于
I.5mLEppendorf 试管中，混勻后-20°C静置 20min,4°C下 12000rpm 离心 IOmin ；⑧白色沉淀用70%的乙醇洗涤2次，晾干后溶于IOOuL无菌超纯水中，轻轻震荡直至沉淀溶解，或放置于50uL缓冲液TE中，于-20°C条件下贮存。实施例3I、海参样品处理取刚打捞上来的鲜活海参用无菌生理盐水冲洗三次，无菌封装后，迅速放置_80°C保存24h，取出海参在无菌条件下，用无菌刀片刨刮海参体表，将刨刮物放于无菌离心管中，每个50mL离心管装约IOg海参体表刨刮物；2、海参体表菌体收集①向步骤(I)获得的离心管中，加入15mL洗脱液I ,常温下300rpm震荡IOmin,将刨刮下的海参体表物质与洗脱液I充分混合；·②4°C下IOOOrpm离心8min，去除下层海参组织沉淀物及上层糊状物，将剩余清澈液体转移到另一无菌离心管中；③重复步骤②直至完全去除沉淀物和糊状物；④将步骤③所得清澈液体分装于I. 5mL离心管，并于4°C IOOOOrpm离心2min，收集沉淀，即为海参体表菌体沉淀物；3、粘多糖和杂蛋白的脱除于步骤④所得海参体表菌体沉淀物中,加入500uL裂解液,吹打至沉淀悬浮,然后55°C孵育震荡3h，直到悬浮液澄清，简短离心以去除管盖内壁水珠。4、细菌破壁上述液体中加入180uL溶菌酶(20mg/mL)，于37°C孵育酶解50min以上，期间间隔震荡直到产生的白色沉淀消失，简短离心以去除管盖内壁水珠。5、抽提、纯化⑤向步骤4获得的酶解液中加入300uL苯酚和300uL洗脱液II，充分混匀后40C 12000rpm 离心 15min ；⑥吸取步骤⑤中上清液500uL,加入洗脱液II 500uL于I. 5mLEppendorf试管中，混勻后 4°C 12000rpm 离心 IOmin ；⑦吸取步骤⑥中上清液400uL，加入无水乙醇(事先于-20 V预冷)800uL于
I.5mLEppendorf 试管中，混勻后-20°C静置 20min,4°C下 12000rpm 离心 IOmin ；⑧白色沉淀用70%的乙醇洗涤2 3次，晾干后溶于IOOuL无菌超纯水中，轻轻震荡直至沉淀溶解，或放置于50uL缓冲液TE中，于-20°C条件下贮存。实施例4采用以下四种方法提取海参体表细菌的总DNA，并进行电泳，从而检测本发明所述方法的提取细菌总DNA的质量试剂盒法、CTAB法、苯酚氯仿法、本发明实施例I所述方法；I.试剂盒法见生物公司的DNA纯化试剂盒说明书。图I为利用试剂盒法提取的细菌总DNA电泳图，其中泳道I为DL15000MARK，泳道2、3为细菌DNA，拖尾严重。2.常规CTAB法的具体操作步骤，参见《海洋生物生态调查技术规程》[1]，国家海洋局908专项办公室编，海洋出版社，2006。图2为利用CTAB法提取的细菌总DNA电泳图，其中泳道I为DL2000MARK，泳道2、3为细菌DNA，有拖尾干扰。3.苯酚氯仿抽提法的操作步骤，参见《精编分子生物学实验指南》[2]，科学出版社，2008。图3为利用苯酚氯仿法提取的细菌总DNA电泳图，其中泳道I为DL15000MARK，泳道2、3为细菌DNA，拖尾严重。4.利用本发明实施例I所述的方法提取的细菌总DNA电泳，其电泳图见图4 :其中泳道I为DL15000MARK，泳道2、3为细菌DNA，由图中的电泳条带大小及亮度可以确定细菌DNA提取质量高。综上所述从图广4中可以看出，试剂盒法、苯酚氯仿法拖尾严重，普通CTAB法虽然可见细菌DNA，但仍有拖尾干扰。而采用本方法，获得的细菌DNA条带清晰。5.利用核酸蛋白分析仪检测提取DNA的纯度及浓度，其结果如表I ;表I核酸蛋白分析仪检测提取DNA的纯度及浓度
权利要求
1.一种海参体表细菌DNA的提取方法，其特征在于包括以下步骤， (1)海参样品处理 取鲜活海参用无菌生理盐水冲洗三次，无菌封装后，迅速放置_80°C保存24h，取出海参在无菌条件下，用无菌刀片刨刮海参体表，将刨刮物放于无菌离心管中，50mL离心管装湿重6 IOg的海参体表刨刮物； (2)海参体表菌体收集 ①向步骤(I)获得的离心管中，加入15 20mL洗脱液I，常温下300rpm震荡5 lOmin，使刨刮下的海参体表粘稠物与洗脱液I充分混合； ②4°C下IOOOrpm离心5、min,去除下层海参组织沉淀物及上层糊状物,将剩余液体转移到另一无菌离心管中； ③重复步骤②直至完全去除沉淀物和糊状物； ④将步骤③所得液体分装于I.5mL离心管，并于4°C IOOOOrpm离心f 2min，收集沉淀，即为海参体表菌体沉淀物； (3)粘多糖和杂蛋白的脱除 于步骤④所得海参体表菌体沉淀物中，加入500uL裂解液，吹打至沉淀悬浮，然后55°C孵育震荡f3h，直到悬浮液澄清，简短离心以去除管盖内壁水珠； (4)细菌破壁 上述液体中加入180uL的浓度为20mg/mL溶菌酶，于37°C孵育酶解至少30min，期间间隔震荡直到产生的白色沉淀消失，简短离心以去除管盖内壁水珠； (5)抽提、纯化 ⑤向步骤(4)获得的酶解液中加入300uL苯酚和300uL洗脱液II，充分混匀后40C 12000rpm 离心 10 15min ； ⑥吸取步骤⑤中上清液500uL，加入洗脱液II500uL于I. 5mLEppendorf管中，混匀后40C 12000rpm 离心 IOmin ； ⑦吸取步骤⑥中上清液400uL，加入于-20V预冷的无水乙醇，800uL于I. 5mLEppendorf 管中，混勻后-20°C静置 20min,4°C下 12000rpm 离心 IOmin ； ⑧白色沉淀用70%的乙醇洗涤2 3次，晾干后溶于IOOuL无菌超纯水中，轻轻震荡直至沉淀溶解，或放置于50uL缓冲液TE中，于-20°C条件下贮存。
2.根据权利要求I所述的一种海参体表细菌DNA的提取方法，其特征在于所述试剂的配制方法如下 洗脱液I :磷酸二氢钾0.27g，磷酸氢二钠1.42g，氯化钠8g，氯化钾0. 2g，加去离子水约700mL充分搅拌溶解，用盐酸调pH至7. 4，最后定容到IL ;然后加入200mL的CTAB溶液，高温高压灭菌后室温保存； 裂解液3mL的CTAB溶液中，加入6uL的β -巯基乙醇和30uL的浓度为50mg/mL蛋白酶K;CTAB 溶液IOOmmoI/L Tris-Hcl, 20mmoI/L 的 EDTA, I. 4mol/L 的 NaCl ； 5XTE 缓冲液将 Tris 54g，硼酸 25g，0. 5mol/L EDTA (ρΗ8· O) 20mL，加去离子水定容至IL后,混勾后放4 C保存； 洗脱液II :异戊醇氯仿的体积比为1:24。
全文摘要
本发明公开一种海参体表细菌DNA提取方法，其通过对样品进行超低温冷冻以降低样品粘度，以利于样品中的细菌分散到具有缓冲、降低粘度的洗脱液Ⅰ中；再在菌体收集步骤中，通过多次低速离心除去样品中糊状的多糖和蛋白；粘多糖和杂蛋白的脱除步骤中，裂解液中添加了CTAB溶液以去除粘多糖，添加蛋白酶K以进一步去除可溶性杂蛋白的干扰；最终通过洗脱液Ⅱ抽提的方法，获得细菌DNA。本发明采用常用的试验试剂，无需特殊的实验条件，操作简单，重复性好，细菌DNA提取质量高。该方法适用于从富含多糖、蛋白样品中提取细菌DNA，具有广泛的应用范围、应用前景。
文档编号C12N15/10GK102911934SQ201210439498
公开日2013年2月6日 申请日期2012年11月6日 优先权日2012年11月6日
发明者侯红漫, 张公亮, 高美玲, 孙黎明, 王璐 申请人:大连工业大学