海参组织蛋白质组的提取方法
【专利摘要】本发明所公开的海参组织蛋白质组的提取方法，利用液氮研磨、超声处理、超高速低温离心及蛋白质组样品纯化等一系列步骤，能够从海参组织中获得种类全面、浓度及纯度均较高的蛋白质组，其最终产物尤其适合于进行蛋白质双向电泳、高效液相层析（HPLC）以及蛋白质组质谱鉴定等蛋白质组学研究，对开展海参蛋白质组学的相关研究具有较为重大的意义；它可以为海参的苗种优选、养殖技术提高以及病害防控提供理论基础和实践指导，有助于解决海参种质退化、病害频发等实际生产问题，有利于提高海参产业的经济效益和社会效益。
【专利说明】海参组织蛋白质组的提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种物质的提取方法，特别是一种海参组织蛋白质组的提取方法。
【背景技术】 [0002]随着对基因组研究的不断深入，人们逐渐发现，单纯从基因组水平并不能完全揭示生命活动的规律，只有深入研究基因组的表达产物，才能更直接地了解生命的本质。蛋白质是基因功能主要的执行者，在生命活动中发挥重要作用，对生物体蛋白质组进行定性、定量、定位及相互作用的研究可为阐明生命活动的本质提供理论依据。而蛋白质组样品的提取是蛋白组学研究中的关键环节，蛋白质组样品提取的质量好坏将直接影响后续的蛋白组学相关研究与分析。
[0003]海参具有较高的食用药用价值和经济价值，是被广泛认同的具有特殊滋补与营养保健等多重功效的高值海珍品。但是，随着海参人工养殖规模的不断扩大，海参种质退化以及养殖病害问题日趋严重，制约了海参产业的健康和可持续发展。想要对海参蛋白质组学进行深入的研究，首先需要对海参的蛋白质组进行有效地、高质量的提取，而现在还没有一种针对海参组织蛋白质组的提取方法。
【发明内容】
[0004]本发明是为了解决现有技术所存在的上述不足，提出一种可获得较为全面的蛋白质种类，且纯度和浓度都较高的海参组织蛋白质组的提取方法。
[0005]本发明的技术解决方案是:一种海参组织蛋白质组的提取方法，其特征在于:所述的方法按照以下步骤进行:
a、取海参组织用4°C、pH=6.8的50mM Tris-HCL清洗3_5次，然后将海参组织粉碎后放入研钵中，一边研磨一边向研钵中添加液氮，直至海参组织碎块呈固态的粉末状，
b、将海参组织粉末放置到超声管中，并按照液料比为200μ I:0.1g的比例向超声管中加入pH=6.8的50mM Tris-HCL的缓冲液，在4°C的条件下进行超声处理，超声处理过程中工作时间4s，间歇时间10s，循环30次，然后在8000g、4°C的条件下离心处理20min，取上清液和沉淀物，其中上清液即为海参组织可溶性全蛋白溶液，
C、将b步骤中获得的沉淀物放入超声管中，并向超声管中添加50mM Tris-HCLUmMEGTAUmM PMSF, pH=7.4的缓冲液，在4°C的条件下进行超声处理，超声处理过程中工作时间4s，间歇时间10s，循环30次，然后在23000g、4°C的条件下离心处理lh，取上清液，将上清液在150000g、4°C的条件下离心处理lh，弃上清液，向余下的溶液中加入终浓度为2%的Triton X 114，在4°C的条件下搅拌处理lh，再在150000g、4°C的条件下离心处理lh，去除不溶物，在37°C的条件下水浴20min，之后在1000g、4°C的条件下离心处理20min，取下层溶液，该下层溶液即为海参组织细胞膜蛋白的提取液，
d、将b步骤中获得的海参组织可溶性全蛋白溶液和c步骤中获得的海参组织细胞膜蛋白的提取液合并后，与_20°C的丙酮按照1:5的比例混合，在_20°C的条件下静置12-20h，然后将混合溶液在SOOOg的条件下离心处理30min，去除上清液，将沉淀取出在4°C的环境下干燥，干燥后的产物即为含有海参组织可溶性全蛋白和海参组织细胞膜蛋白的海参组织蛋白质组。
[0006]本发明同现有技术相比，具有如下优点:
本发明所公开的海参组织蛋白质组的提取方法，利用液氮研磨、超声处理、超高速低温离心及蛋白质组样品纯化等一系列步骤，能够从海参组织中获得种类全面、浓度及纯度均较高的蛋白质组，其最终产物尤其适合于进行蛋白质双向电泳、高效液相层析(HPLC)以及蛋白质组质谱鉴定等蛋白质组学研究，对开展海参蛋白质组学的相关研究具有较为重大的意义；它可以为海参的苗种优选、养殖技术提闻以及病害防控提供理论基础和实践指导，有助于解决海参种质退化、病害频发等实际生产问题，有利于提高海参产业的经济效益和社会效益。【具体实施方式】
[0007]—种海参组织蛋白质组的提取方法，按照以下步骤进行:
a、首先取适量的海参组织，用4°C、pH=6.8的50mM Tris-HCL清洗3_5次，然后将海参组织用消毒的干净剪刀剪碎，放入研钵中，一边研磨一边向研钵中添加液氮，直至海参组织碎块呈固态的粉末状；在液氮速冻的条件下进行研磨能有效防止研磨过程中蛋白质的降解，以确保组织蛋白的活性与结构完整性。
[0008]b、然后将海参组织粉末放置到超声管中，并按照液料比为200 μ I:0.1g的比例向超声管中加入pH=6.8的50mM Tris-HCL的缓冲液，在4°C的条件下进行超声处理，超声处理过程中工作时间4s，间歇时间10s，循环30次，然后在8000g、4°C的条件下离心处理20min，取上清液和沉淀物，其中上清液即为海参组织可溶性全蛋白溶液；该步骤能够有效避免核酸污染以及外源离子引入，以确保蛋白质样品的纯度。
[0009]C、将b步骤中获得的沉淀物放入超声管中，并向超声管中添加50mM Tris-HCLUmMEGTAUmM PMSF, pH=7.4的缓冲液，在4°C的条件下进行超声处理，超声处理过程中工作时间4s，间歇时间10s，循环30次，然后在23000g、4°C的条件下离心处理lh，取上清液，将上清液在150000g、4°C的条件下离心处理lh，弃上清液，向余下的溶液中加入终浓度为2%的Triton X 114，在4°C的条件下搅拌处理lh，再在150000g、4°C的条件下离心处理lh，去除不溶物，在37°C的条件下水浴20min，之后在1000g、4°C的条件下离心处理20min，取下层溶液，该下层溶液即为海参组织细胞膜蛋白的提取液；该步骤同样能够有效避免核酸污染以及外源离子引入，以确保蛋白质样品的纯度。
[0010]d、将b步骤中获得的海参组织可溶性全蛋白溶液和c步骤中获得的海参组织细胞膜蛋白的提取液合并后，与-20°C的丙酮按照1:5的比例混合，在-20°C的条件下静置12-20h，然后将混合溶液在8000g的条件下离心处理30min，去除上清液，将沉淀取出在4°C的环境下干燥，干燥后的产物即为含有海参组织可溶性全蛋白和海参组织细胞膜蛋白的海参组织蛋白质组；在这一步骤中，采用丙酮作为除盐溶剂，能够有效去除海参组织蛋白质组提取液中的各种盐离子，进一步确保了所得蛋白质组的纯度及浓度。
【权利要求】
1.一种海参组织蛋白质组的提取方法，其特征在于:所述的方法按照以下步骤进行: a.取海参组织用4°C、pH=6.8的50mM Tris-HCL清洗3_5次，然后将海参组织粉碎后放入研钵中，一边研磨一边向研钵中添加液氮，直至海参组织碎块呈固态的粉末状， b.将海参组织粉末放置到超声管中，并按照液料比为200μ I:0.1g的比例向超声管中加入pH=6.8的50mM Tris-HCL的缓冲液，在4°C的条件下进行超声处理，超声处理过程中工作时间4s，间歇时间10s，循环30次，然后在8000g、4°C的条件下离心处理20min，取上清液和沉淀物，其中上清液即为海参组织可溶性全蛋白溶液， c.将b步骤中获得的沉淀物放入超声管中，并向超声管中添加50mMTris-HCLUmMEGTAUmM PMSF, pH=7.4的缓冲液，在4°C的条件下进行超声处理，超声处理过程中工作时间4s，间歇时间10s，循环30次，然后在23000g、4°C的条件下离心处理lh，取上清液，将上清液在150000g、4°C的条件下 离心处理lh，弃上清液，向余下的溶液中加入终浓度为2%的Triton X 114，在4°C的条件下搅拌处理lh，再在150000g、4°C的条件下离心处理lh，去除不溶物，在37°C的条件下水浴20min，之后在1000g、4°C的条件下离心处理20min，取下层溶液，该下层溶液即为海参组织细胞膜蛋白的提取液， d.将b步骤中获得的海参组织可溶性全蛋白溶液和c步骤中获得的海参组织细胞膜蛋白的提取液合并后，与_20°C的丙酮按照1:5的比例混合，在_20°C的条件下静置12-20h，然后将混合溶液在SOOOg的条件下离心处理30min，去除上清液，将沉淀取出在4°C的环境下干燥，干燥后的产物即为含有海参组织可溶性全蛋白和海参组织细胞膜蛋白的海参组织蛋白质组。
【文档编号】C07K1/02GK103665135SQ201310588498
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年11月21日 优先权日:2013年11月21日
【发明者】湛垚垚, 黄显雅, 段立柱, 常亚青 申请人:大连海洋大学, 湛垚垚