专利名称：一种高效提取绵羊皮肤组织蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及绵羊皮肤组织蛋白提取的方法，可用于蛋白的Western blot杂交检测，也可用于二维凝胶电泳(2-DE)分离，以及利用皮肤组织制备生物活性的蛋白质。
背景技术：
绵羊皮肤组织致密，结构完善，有着重要的保护作用。绵羊皮肤由表皮和真皮组成，表皮有许多衍生物，如各种腺体、毛、角、爪、甲、蹄；真皮发达，由胶原纤维及弹性纤维的结缔组织构成，两种纤维交错排列，其间分布有各种结缔组织细胞、感受器官、运动神经末梢及血管、淋巴等；相对于其它组织来说，绵羊皮肤组织结构更为复杂，皮肤组织蛋白的提取也较其它组织难度大；获得一种高效提取绵羊皮肤组织蛋白的方法对于研究绵羊组织器官功能、生物活性蛋白制备具有重要意义。据文献检索披露:①2010年徐小燕、夏蒲，邢亚楠等在《中国医科大学学报》2010，39(5):336-339.发表的文章“冻结破碎法提取组织蛋白方法初探”揭示了冻结破碎法和匀浆法提取小鼠组织蛋白后进行蛋白定量，然后用Western blot检测内参β-actin蛋白的表达，结果表明两种方法提取的总蛋白浓度以及β-actin蛋白表达无明显统计学差异。②2009年王簕、裴国献等在《生命科学研究》2009，13 (2): 137-141)发表的“兔骨组织总蛋白的提取和在免疫印迹法中的应用”采用单纯研磨法、单纯锤击法和锤击研磨法分别对兔骨组织蛋白进行提取，通过SDS-PAGE和免疫印迹法检测骨组织中β -actin的表达，比较3种骨组织蛋白提取法，结果表明锤击研磨法更为方便、快捷，可作为提取骨组织蛋白的一种理想方法。③2007年王桂叶等在《郑州大学学报(医学版)》.2007，42(4):660-662.上发明的“3种方法提取胸腺组织蛋白双向电泳纯化结果比较”分别采用组织裂解液法、丙酮沉淀法和蛋白纯化试剂3种方法提取7例重症肌无力患者胸腺组织蛋白质，用SDS-PAGE和二维电泳检测蛋白。结果表明:采用蛋白纯化试剂法提取胸腺组织蛋白，能够获得较好2-DE凝胶图像。检索未见有理想的提取皮肤组织蛋白的方法报道。本发明构思是将冷冻破碎与冰浴超声相结合，针对绵羊皮肤组织的特点，在进行皮肤的研磨和蛋白质溶解时，先尽量拔除绵羊皮肤表皮密布的毛发(毛发含有大量的角蛋白)，使角蛋白及非皮肤组织的蛋白质的含量大大降低，从而增加了表皮及真皮组织的蛋白质在溶解液中的相对浓度，有效富集了皮肤组织蛋白，为研究皮肤中蛋白质表达谱和制备皮肤组织的活性蛋白奠定了基础。
发明内容
本发明目的在于:提供高效提取绵羊皮肤组织蛋白的方法，为制备绵羊皮肤组织蛋白和进一步研究绵羊皮肤组织蛋白的功能奠定基础。
本发明目是这样实现的:一种高效提取绵羊皮肤组织蛋白的方法，分前处理、冷冻破碎、冰浴超声、蛋白定量及SDS-PAGE、Western-blot的检测步骤:
步骤1.将冰浴皮肤组织样品拔毛处理，用预冷的IXPBS洗涤3次，吸干液体；称取25-30mg样品，置于预冷的2ml离心管中，将其剪碎至0.8-lmm3的小块，置于_70°C冰箱中；步骤2.取上步样品，加入直径为5-7cm无菌钢珠，置于TissueLyser LT仪器中粉碎，其频率50Hz，工作2-5min ;破碎后，取出钢珠，加入预冷的蛋白酶抑制剂的裂解液，其加量为每IOOmg湿重组织加200-300μ1，置于冰浴中超声破碎，其功率200W，工作10S，间隙15S, 25次，且避免大量泡沫产生；
步骤3.将超声后的样品置于漩涡混合器上涡旋30-40S，4°C、采用13000转/分钟、离心25-30分钟；提取上清液，置于_70°C冰箱中，用BCA法测定其蛋白浓度；取IOOPg蛋白样品加入等量的2X loading buffer混合均勻,用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白；
步骤4.采用Western blotting免疫印迹检测蛋白的表达，即操作:将凝胶放入电转缓冲液中，湿转法100V转印60 min后，加入5%脱脂奶粉室温封闭2 h，用一抗鼠抗HA单抗
I: 400稀释，同时以β-actin抗体1:400稀释作内参，4°C过夜孵育，用PBST洗涤5次，每次10 min，用二抗为IRDye 800CW标记的羊抗鼠IgG抗体1: 12 000稀释，室温孵育50min,用PBST洗漆5次,每次10 min,再用PBS洗漆一次,用L1-Cor Biosciences扫描成像；上述裂解液配方:9M尿素2.7克，4 % CHAPS 0.2g，用高压灭菌去离子水溶解，补至5ml，冻存于-20°C冰箱中，使用前加入4 %蛋白酶抑制剂；
上述添加蛋白酶抑制剂的裂解液，其蛋白酶抑制剂与裂解液体积比为4% ；
上述的TissueLyser LT仪器在使用前，置于_70°C冰箱中进行预冷处置。所述的方法，所述的BCA法测定，即采用酶标仪检测562 nm波长下的光密度值，制定标准曲线，计算其蛋白浓度。
本发明的研究作用机理:将冷冻破碎与冰浴超声相结合处理绵羊皮肤组织，提取总蛋白后进行蛋白定量，并通过聚丙烯酰胺凝胶电泳对提取的蛋白进行分离，利用Westernblot检测绵羊皮肤组织中FGF5s基因和内参基因β-actin蛋白的表达，进而在蛋白质水平上进行相关功能的研究。本发明的技术特点:(1)由于绵羊皮肤有大量衍生物和各种结缔组织，用冷冻破碎法可使样品粉碎彻底及快速，大大降低使用液氮的成本。(2)为使裂解液彻底裂解组织，进行超声破碎；超声破碎可控制强度，低于溶液产生泡沫的水平，注意散热，防止蛋白质变性，获取闻质量的蛋白。(3)配制的裂解液选用CHAPS是一种两性尚子去垢剂、蛋白质裂解液，用于增溶膜蛋白和裂解蛋白-蛋白之间的相互作用；高浓度的尿素可以造成强变性条件；为防止蛋白降解，加入了 Roche公司生产的cocktail蛋白酶抑制剂。该方法操作简单可靠，方便快捷，获取的大量蛋白质，为体内皮肤组织蛋白的研究奠定基础，彰显技术进步。
本发明对照附图作进一步说明。附图1为采用BCA法对蛋白进行定量的标准曲线；
如图所示:得到的标准曲线方程为y=0.000944X+0.454。附图2为转基因绵羊的FGF5s基因表达的Western Blot检测结果；
如图所示=00813为非转基因绵羊皮肤组织蛋白样品对照；114，112，121，117，115，142，128，148为转基因绵羊皮肤组织蛋白样品。
具体实施例方式本发明对照实施例作进一步说明。实验操作:
对皮肤组织采用前处理、冷冻破碎、冰浴超声、蛋白定量、SDS-PAGE.ffestern-blot检测的步骤:。I)用镊子将采集的皮肤组织在冰浴中拔除表面毛发，用预冷的IXPBS磷酸缓冲液洗涤3次，用灭菌滤纸吸干皮肤组织块表面溶液，称取30mg皮肤组织样品置于提前预冷的2ml离心管中，用已高压灭菌的剪刀将样品剪碎至Imm3块，置于-70°C冰箱；
2)取出冻存的皮肤组织样品，加入直径为7cm的无菌钢珠，置于QIAGEN公司的TissueLyser LT仪器中50HZ工作3min (仪器在使用前置于_70冰箱预冷)，直至冷冻的皮肤组织样品彻底粉碎；
3)破碎结束后，取出钢珠，加入预冷的含cocktail(Roche公司生产，临用前按4%体积比加入)抑制剂的蛋白裂解液(每IOOmg湿重组织加入300μ1裂解液)，将样品置于冰浴中超声破碎；其超声条件为功率200W，工作10S，间隙15S，25次；超声过程中一定要确保样品在冰浴条件下且尽量避免产生大量泡沫，若产生泡沫可将样品静置于冰盒中几分钟或瞬时离心样品；上述裂解液配方:9Μ尿素2.7克，4 % (ff/V)CHAPS 0.2克，加灭菌去离子水溶解，加至5ml即可，临用前加入4 % (V/V) cocktail ;裂解液配好后,按照500微升/管分装，冻存于-20°C冰箱，勿反复冻融；
4)超声结束后于漩涡混合器上涡旋30S，4°C、13000转/分钟、离心30分钟；
5)吸取上清即为含有总蛋白的提取液，将样品分装保存于_70°C冰箱；
6)用BCA法测定提取液中的蛋白浓度，以牛血清白蛋白标准溶液(2mg/ml)作为对照，采用酶标仪检测562 nm波长下的光密度值，制定标准曲线，根据得出的标准曲线方程:y=0.000944X+0.454计算出样品的蛋白浓度；
7)在定量好的蛋白样品中加入等量2Xloading buffer混匀，按常规方法进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE )分离蛋白；
8)ffesternblotting免疫印迹检测蛋白的表达,具体操作:将凝胶放入电转缓冲液中，湿转法100V转印60 min后，加5%脱脂奶粉室温封闭2 h，用一抗为鼠抗HA单抗1: 400稀释，同时用β-actin抗体1:400稀释做内参，4°C过夜孵育，用PBST洗涤5次，每次10min，用二抗为IRDye 800CW标记的羊抗鼠IgG抗体1: 12 000稀释，室温孵育50 min,用PBST洗涤5次，每次10 min,最后用PBS洗涤一次，Odyssey近红外双色激光成像系统(L1-Cor Biosciences)扫描成像。所述的方法，选用小鼠单克隆抗体HA购自北京天根生化科技有限公司；选用的4%蛋白酶抑制剂购自Roche公司；选用的TissueLyser LT仪器由德国QIAGEN公司生产；选用的4 % CHAPS (3-[(3_胆固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸)由Sigma公司生产；选用的鼠抗β-actin单克隆抗体由博士德公司生产； 选用的羊抗属IRDye 800CW抗体由ODYSSEY公司生产。
权利要求
1.一种高效提取绵羊皮肤组织蛋白的方法，其特征在于:分前处理、冷冻破碎、冰浴超声、蛋白定量及SDS-PAGE、Western-blot的检测步骤: 步骤1.将冰浴皮肤组织样品拔毛处理，用预冷的IXPBS洗涤3次，吸干液体；称取25-30mg样品，置于预冷的2ml离心管中，将其剪碎至0.8-lmm3的小块，置于_70°C冰箱中；步骤2.取上步样品，加入直径为5-7cm无菌钢珠，置于TissueLyser LT仪器中粉碎，其频率50Hz，工作2-5min ;破碎后，取出钢珠，加入预冷的蛋白酶抑制剂的裂解液，其加量为每IOOmg湿重组织加200-300μ1，置于冰浴中超声破碎，其功率200W，工作10S，间隙15S, 25次，且避免大量泡沫产生； 步骤3.将超声后的样品置于漩涡混合器上涡旋30-40S，4°C、采用13000转/分钟、离心25-30分钟；提取上清液，置于_70°C冰箱中，用BCA法测定其蛋白浓度；取IOOPg蛋白样品加入等量的2X loading buffer混合均勻,用聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白； 步骤4.采用Western blotting免疫印迹检测蛋白的表达，即操作:将凝胶放入电转缓冲液中，湿转法100V转印60 min后，加入5%脱脂奶粉室温封闭2 h，用一抗鼠抗HA单抗I: 400稀释，同时以β-act in抗体1:400稀释作内参，4°C过夜孵育，用PBST洗涤5次，每次10 min，用二抗为IRDye 800CW标记的羊抗鼠IgG抗体1: 12 000稀释，室温孵育50min,用PBST洗漆5次,每次10 min,再用PBS洗漆一次,用L1-Cor Biosciences扫描成像；上述裂解液配方:9M尿素2.7克，4 % CHAPS 0.2g，用高压灭菌去离子水溶解，补至5ml，冻存于_20°C冰箱中，使用前加入4 %蛋白酶抑制剂； 上述添加蛋白酶抑制剂的裂解液，其蛋白酶抑制剂与裂解液体积比为4% ； 上述的TissueLyser LT仪器在使用前，置于_70°C冰箱中进行预冷处置。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的BCA法测定，即采用酶标仪检测562 nm波长下的光密度值，制定标准曲线，计算其蛋白浓度。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:选用小鼠单克隆抗体HA购自北京天根生化科技有限公司；选用的4 %蛋白酶抑制剂购自Roche公司；选用的TissueLyser LT仪器由德国QIAGEN公司生产；选用的4 % CHAPS(3-[(3-胆固醇氨丙基)二甲基氨基]_1_丙磺酸)由Sigma公司生产；选用的鼠抗β-actin单克隆抗体由博士德公司生产；选用的羊抗属IRDye 800CW抗体由ODYSSEY公司生产。
全文摘要
本发明提供的一种高效提取绵羊皮肤组织蛋白的方法，针对绵羊皮肤组织结构的复杂性，采用冷冻破碎法粉碎组织，然后摸索出适合绵羊皮肤组织的超声破碎条件，并通过涡旋使样品裂解更充分，以便能提高皮肤组织的利用率，尽可能少地破坏蛋白内的分子结构，产出高质量的蛋白。该方法操作简单可靠，方便快捷，成本低廉，为体内皮肤组织蛋白提取提供了成熟的高效的技术方法。
文档编号G01N33/53GK103087146SQ20111034543
公开日2013年5月8日 申请日期2011年11月4日 优先权日2011年11月4日
发明者张雪梅, 李文蓉, 贺三刚, 张宁, 刘明军 申请人:新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心