专利名称：肽聚糖结合蛋白BjApextrin1和BjApextrin2及其基因、生产方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新颖的肽聚糖结合蛋白基因及其编码的蛋白BjApextrinl和BjApextrin2，以及该蛋白在制备治疗感染性疾病药物中的应用。
背景技术：
文昌鱼属于脊索动物门(Chordata),头索动物亚门(Cephalochordata),是无脊椎动物进化到脊椎动物的过渡类型，是五亿年前脊椎动物原始祖先的相似模型，一直以来是研究脊椎动物发育的好材料。近年来，对文昌鱼的免疫的研究引起了广泛的重视，在其中发现了不少具有重要意义的免疫基因。肽聚糖(Peptidoglycan, PGN)是几乎所有细菌的细胞壁的主要成分之一,尤其富含于革兰氏阳性菌中，也是宿主感知病原菌入侵、激活免疫反应的一种重要的病源相关分子模式(Pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)。妝聚糖可以被多种模式识别分子识别，如肽聚糖识别蛋白(Peptidoglycan recognition proteins, PGRPs), Toll 样受体 2 (Tol 1-likereceptor 2，TLR2)等。Haag等运用差显技术将胚胎发育模式不同的海胆进行对比，发现Apextrin在直接发育模式的红海胆(Heliocidaris erythrogramma)的胚胎中表达丰度明显高于间接发育的结节海胆，胚胎原位杂交显示Apextrin特异表达于紫海胆胚胎的外胚层。免疫组化实验证明Apextrin蛋白以分泌泡的形式储存在卵细胞里面，在卵细胞完成受精以后逐渐开始分泌，当胚胎在囊胚期极化之后Apextrin蛋白就定位于胚胎顶端胞外基质，故称其为顶端胞外基质蛋白(Apical extracellular matrix protein, Apextrin)。随后人们又分别在水螅，珊瑚中发现Apextrin基因,胚胎原位杂交显示Apextrin也可能参与了水螅和珊瑚的胚胎发育过程。文昌鱼Apextrin基因的表达量在细菌刺激12h后上调了上千倍；红海胆在受到弧菌感染20h之后Apextrin蛋白的表达量也显著增加。我们发现文昌鱼的Apextrin可以能够识别和凝集革兰氏阳性菌，并且特异结合细菌表面的生物大分子肽聚糖，可用于作为制备治疗感染性疾病的药物，在养殖业、医药卫生等领域具有广阔的开发前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的肽聚糖结合蛋白BjApextrinl和BjApextrin2及编码该蛋白的基因。本发明的另一目的在于提供该蛋白的生产方法。本发明的第三个目的在于提供该蛋白在制备治疗感染性疾病药物中的应用。本发明根据已有的EST序列通过5'和3' RACE，从中国文昌鱼的消化道中分离得到文昌鱼BjApextrinl和BjApextrin2基因，其DNA序列如序列表中序列I和序列2序列所示。
本发明所述基因编码的蛋白BjApextrinl和BjApextrin2,其氨基酸序列如序列表中序列3和序列4序列所不；该蛋白等电点分别为6. 05和5. 03,分子量分别为56，671和52，516道尔顿。BjApextrinl和BjApextrin2克隆到大肠杆菌表达载体pET32a上,得到重组表达载体 pET32a_BjApextrinl 和 pET32a_BjApextrin2。该蛋白可以通过表达载体pET32a_BjApextrinl和pET32a_BjApextrin2在大肠杆菌以不溶的包涵体形式表达。所述表达载体pET32a_BjApextrinl和pET32a_BjApextrin2以硫氧还蛋白为融合表达伴体，该系统使表达的BjApextrinl和BjApextrin2包涵体在硫氧还蛋白的帮助下通过变复性正确折叠成为可溶的蛋白。本发明所选择的青岛文昌鱼(Branchiostoma japonicum)采集于山东省沙子口水域。本发明根据已有的EST序列通过5'和3' RACE，从中国文昌鱼的消化道中分离得到文昌鱼BjApextrinl和BjApextrin2基因(其DNA序列如序列表中序列I和序列2序列所示)。分别编码504和462个氨基酸(其氨基酸序列如序列表中序列3和序列4序列所示)，等电点分别为6. 05和5. 03，分子量分别为56，671和52，516道尔顿。本发明通过设计了两对引物,将基因BjApextrinl和BjApextrin2克隆到大肠杆菌表达载体pET32a (Novagen公司)，构建表达质粒并将其转化大肠杆菌BL21 (DE3)。表达载体pET32a-BjApextrinl和pET32a_BjApextrin2以硫氧还蛋白为融合表达伴体,该系统使表达的BjApextrinl和BjApextrin2包涵体在硫氧还蛋白的帮助下通过变复性正确折叠成为可溶的蛋白。该重组蛋白分别编码670和628个氨基酸，等电点分别为5. 80和5. 14，分子量分别为74，374和70，219道尔顿。通过对培养时间，诱导时间，温度等条件的摸索和优化，BjApextrinl和BjApextrin2融合蛋白的表达量较高,绝大部分以不可溶包涵体形式存在。本发明还摸索和优化了 BjApextrinl和BjApextrin2重组蛋白的纯化条件,菌体进行超声破碎后，离心取沉淀进行变复性可以得到较纯的蛋白。本发明的表达质粒复制方法参照Sambrook (Sambrook, et al. 1989, Moleculardoing. Cold Spring Harbor Labroratory Press. USA)方法,用 CaCl2 的方法将质粒转化E. coli.DH5a或BL21 (DE3)菌株，用含氨苄青霉素(100 μ g/mL)的LB培养基培养转化菌株,用Omega公司试剂盒提取质粒。本发明通过细菌结合试验证明了该重组蛋白具有结合革兰氏阳性细菌的活性。细菌凝集实验表明该重组蛋白能够使粪场球菌和黄色葡萄球菌发生凝集。酶联免疫吸附测定(Enzyme-1 inked-immunosorbent assay, ELISA)表明该重组蛋白可以特异性地于肽聚糖结合，融合蛋白和肽聚糖做下拉实验(Pulldown assay)表明该重组蛋白对肽聚糖的结合活性随肽聚糖浓度的增加而增强。通过构建缺失突变体我们发现BjApextrinl的模式识别功能是由C端的一段保守序列决定的。
图Ia及图 Ib 分别为 5' RACE和 3' RACE扩增得到的BjApextrinl 和BjApextrin2基因目的片段。1.5' RACE扩增片段；2. 3' RACE扩增片段；3. DNA分子量标准(DL2000)。图2a及图2b分别为扩增得到的BjApextrinl和BjApextrin2基因全长片段。图3 为重组表达质粒 pET32a_BjApextrinl 和 pET32a_BjApextrin2 构建图。图4a及图4b分别为重组BjApextrinl和BjApextrin2蛋白诱导表达、变复性纯化电泳图。M,蛋白质marker; I,未诱导的超声上清；2，未诱导的超声沉淀；3，诱导的超声上清；4，诱导的超声沉淀；5,纯化后的TRX-Apextrinl和TRX-Apextrin2。图5为重组蛋白BjApextrinl和BjApextrin2的细菌结合试验结果将约2 X IO7个各种不同的细菌用TBS (ρΗ7·5)洗涤平衡后，与Iyg目的蛋白在Iml TBS (ρΗ7·5)缓冲液中4°C振荡孵育过夜；41、12000\8离心11^11，沉淀用Iml TBS缓冲液洗5遍；用100 μ ITBS重悬菌体，再加入20 μ I 6 X上样缓冲液，混匀后沸煮IOmin ;然后进行Western blot分析，用His单克隆抗体来检测目的蛋白，Sepharose 4Bbead作为阴性对照进行平行实验。图6为重组蛋白BjApextrinl和BjApextrin2的细菌凝集实验结果将FITC标记过的粪肠球菌和金黄色葡萄球菌与重组蛋白共孵育，在荧光显微镜下面观测微生物的凝集情况。图7a及图7b分别为重组蛋白BjApextrinl和BjApextrin2与细菌细胞壁纯组分的ELISA实验结果重组蛋白分别与LPS，LTA, PGN, Mannan和Zymosan进行ELISA实验。图8为重组蛋白BjApextrinl和BjApextrin2与肽聚糖Pulldown实验结果将I μ g目的蛋白分别与5，10，20，50 μ g的PGN进行Pul I down实验。图9为重组蛋白BjApextrinl缺失突变体诱导表达、变复性纯化电泳图。M,蛋白质marker ;第I泳道，未诱导的TRX- Δ C超声上清；第2泳道，未诱导的TRX- Δ C超声沉淀；第3泳道，诱导的TRX- Δ C超声上清；第4泳道，诱导的TRX- Δ C超声沉淀；第5泳道，纯化后的TRX- Λ C ;第6泳道，未诱导的TRX- Δ N超声上清 ’第7泳道，未诱导的TRX- Δ N超声沉淀；第8泳道，诱导的TRX- Δ N超声上清；第9泳道，诱导的TRX- Δ N超声沉淀；第10泳道，纯化后的TRX- Δ N。图IOa和IOb分别为重组蛋白BjApextrinl缺失突变体与金黄色葡萄球菌来源地的肽聚糖PGN (S.a)和枯草芽孢杆菌来源的肽聚糖PGN (B. s)的ELISA实验结果。
具体实施例方式以下实施将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。实施例I :中国文昌鱼消化道总RNA的提取和cDNA的合成总RNA的提取和RACE cDNA合成收集中国文昌鱼消化道，采用Trizol试剂法提取消化道总RNA。取I μ g总RNA，按照Τ0Υ0Β0公司的cDNA —链合成试剂盒(ReverTraAce- a - , code No. FSK-100)说明合成 cDNA — 链。米用 Invitrogen 的GeneRacer Kit 按照说明合成 RACE cDNA—链。实施例2 RACE 扩增 BjApextrinl 和 BjApextrin2 基因 5'和 3'末端。根据已知的EST序列设计BjApextrinl的5' RACE扩增的基因特异性引物为5' -GSP:5/ -CGTCATCTTCATCGTCCCA ACGGAA-3' ;BjApextrinl 的 3' RACE 扩增的基因特异性引物为 3 ' -GSP: 5 ' -TTCCGCTTGGGACGATGAAGATG-3 '。B jApextrin2 的 5 ' RACE扩增的基因特异性引物为 5' -GSP:5/ -CGTCTTCATCGTCCCACCGGAA-3 ' ;BjApextrin2 的
3' RACE 扩增的基因特异性引物为 3 ' -GSP: 5 ' -TTCCGGTGGGACGATGAAGAC-3 '。采用Takara公司的LA Taq聚合酶按照GeneRacer Kit的反应体系进行PCR扩增。扩增得到的目前片段如图I。将目的片段连接到pGEX Teasy vector(promega)后转化大肠杆菌DH5 α，挑选重组克隆测序。将5' RACE和3' RACE的测序结果进行拼接后得到了 BjApextrinl和BjApextrin2基因的全长序列。BjApextrinl的全长序列含有一个长度为1515bp的开放阅读框(open reading frame, 0RF),编码504个氨基酸的蛋白；BjApextrin2的全长序列含有一个长度为1389bp的开放阅读框(open reading frame, 0RF),编码462个氨基酸的蛋白。实施例3 BjApextrinl和BjApextrin2基因全长序列的扩增及分析。根据上面拼接得到的序列设计BjApextrinl基因全长序列的PCR引物 5 ' -AACGGCGGTTCTTCTCTGA-3 '和 5 ' -TGTAGTCGCATCAAGCTCTTTATT-3 '；BjApextrin2 基因全长序列的 PCR 引物 5 ' -CAAAGGAACGTCAGAACATTC-3 '和5' -TTTAGAGTGAGCCAGTTTGT-3'，采用 Takara 的 LA Taq 聚合酶扩增 BjApextrinl 的全基因，分别扩增得到的1578bp和1433bp片段的，电泳图谱如图2。将扩增得到的目的片段连接到pGEX Teasy vector后转化大肠杆菌DH5 α，挑选重组克隆测序。对测序结果进行分析表明，获得了 BjApextrinl和BjApextrin2基因全长序列。实施例4 :重组 pET32a_BjApextrinl 和 pET32a_BjApextrin2 表达质粒的构建根据BjApextrinl基因的序列合成一对引物，上游引物含BamH I切割位点，下游引物含Xho I切割位点。上游引物(FL-Fl):5’-CGCGGATCCGCACCGACCGAAGTCGTACA-3’BamH I下游引物(FL-Rl):5’-CCGCTCGAGCGAATAGTAACAGTAGTG GAGTCT-3’Xho I根据BjApextrin2基因的序列合成一对引物,上游引物含BamHI切割位点，下游引物含Xho I切割位点。上游引物(FL-F2):5’-GGAAGATCTATGAAATTCGCGCTGCTCG-3’Bgl II下游引物(FL-R2):5’-CCGCTCGAGAGAGTAGTAGCAGTAGTGAATCCG-3，Xho I分别以含有BjApextrinl和BjApextrin2基因的pGEX Teasy质粒为模板，FL-F1/FL-R1和FL-F2/FL-R2为引物PCR扩增，得到特异扩增的单一条带，产物大小在1500左右。将PCR扩增产物克隆到原核融合表达载体pET32a上，得到重组表达载体pET32a_BjApextrinl和pET32a_BjApextrin2 (其构建过程如图3所示)。表达载体中的外源基因序列经测序鉴定正确。
实施例4 :中国文昌鱼BjApextrinl和BjApextrin2融合蛋白的表达和纯化将pET32a_BjApextrinl 和 pET32a_BjApextrin2 质粒转化大肠杆菌 BL21 (DE3)。基因工程菌超声裂解上清液和沉淀经SDS-PAGE电泳分析表明，菌株经诱导后在超声裂解沉淀中有明显的特异表达产物带，分子量与预测的理论值相符(图4)。对培养时间、诱导浓度、温度等条件的摸索得出。基因工程菌的培养条件为接单菌落于50ml氨苄抗性2XYT液体培养基中，37°C，250rpm培养过夜，取过夜培养物5ml接种于500ml的氨苄抗性2 X YT培养基中，37°C，250rpm培养至0D600=0. 6 (扩大培养约4h)，加入IOOmM IPTG至终浓度分别为O. ImM, 18°C，250rpm诱导培养24h后离心收集菌体。经SDS-PAGE电泳分析表明，在此条件下BjApextrinl和BjApextrin2融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的20%以上，处于不溶的包涵体状态。将收集的超声裂解沉淀用TBS缓冲液(50mM Tris · Cl，150mM NaCl，pH 7. 5，)重悬后，用超声波细胞粉碎机以200W的功率，冰上超声30min (超声4s,间歇4s), 4°C、12，OOOrpm离心30min。重复两次。将得到沉淀按照Ig 50ml比例用8M尿素-TBS溶解，通过加入磁力搅拌器加速其溶解，室温12，OOOrpm离心溶解液lOmin。将溶解的包涵体上清液装入已处理的透析袋，把透析袋转移至bufferA (50mM Tris · Cl, pH6. 0,150mM NaCl，2mM 还原型谷胱苷肽(GSH)，0. 2mM 氧化型谷胱苷肽(6556)，10%甘油，411尿素)，41透析1211，然后将透析袋转移至1311打6『B (50mM Tris Cl,pH6. 0,150mM NaCl，2mM GSH，0. 2mMGSSG, 10% 甘油，2M 尿素)，4°C透析 12h，再将透析袋转移至 buffer C (50mM 的 Tris · Cl，ρΗ6· O, 150mM NaCl，2mM GSH,0. 2mM GSSG，10% 甘油，IM 尿素)，4°C透析 12h，最后将透析袋转移至 buffer D (50mM Tris *Cl,pH6. 0,150mM NaCl, 10%甘油),4°C透析12h,更换新鲜透析buffer D,重复上一步。复性蛋白在4°C, 12，OOOrpm离心15min，取上清进行SDS-PAGE电泳检测(图4)。实施例5 :中国文昌鱼BjApextrinl和BjApextrin2融合蛋白的细菌结合活性分析使用的细菌包括革兰氏阴性细菌大肠杆菌K12 (Escherichia coli K12)、獲弧菌(VibroanguiIIarum)、副溶血弧菌(Vibro paraheamoIyticus)和醋酸|丐不动杆菌(Acinetobactercaloacetius);革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)> 溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)、粪场球菌(Enterococcusfaecium)、枯草芽抱杆菌(Bacillussubtilis)和黄色微球菌(Micrococcus luteus)。将约2X IO7个各种不同的细菌用TBS (pH7. 5)洗涤平衡后，与1μ g的BjApextrinl和BjApextrin2融合蛋白在Iml TBS (ρΗ7· 5)缓冲液中4°C振荡孵育过夜;4°C、12000 X g离心lmin，沉淀用Iml TBS缓冲液洗5遍；用100 μ ITBS重悬菌体，再加入20 μ I 6 X上样缓冲液，混勻后沸煮IOmin ;然后进行Western blot分析,用His单克隆抗体来检测目的蛋白，Sepharose 4B bead作为阴性对照进行平行实验。如图5所不BjApextrinl和BjApextrin2重组蛋白可以结合革兰氏阳性细菌，而不结合革兰氏阴性细菌。实施例6 :中国文昌鱼BjApextrinl和BjApextrin2重组蛋白的细菌凝集活性分析将粪肠球菌和金黄色葡萄球菌振荡培养过夜后，6，OOOrpm离心收集2 X IO9的各种细菌后，用TBS (ρΗ7·5)清洗2次。加入50μ1 FITC溶液(溶于DMS0，终浓度为10mg/ml)后,用TBS补平至总体积Iml,避光摇晃lh。用TBS清洗7_8遍至溶液无色,最后悬浮在Iml含有IOmM的CaCl2的TBS溶液中备用。在96孔平板上进行，每孔加入10 μ I的各种微生物悬浮液(终浓度大约lX107CFU/ml的细菌或者lX106CFU/ml酵母)，10 μ g的目的蛋白，用TBS补平至100 μ 1，混匀后避光静置f 2h后在荧光显微镜下检测凝集活性。如图6所示BjApextrinl和BjApextrin2重组蛋白可以结合粪肠球菌和金黄色葡萄球菌发生凝集。实施例7 :中国文昌鱼BjApextrinl和BjApextrin2重组蛋白的细菌细胞壁纯组分结合活性分析通过ELISA试验来检测重组蛋白对细菌细胞壁纯组分的结合活性。使用的六种细菌细胞壁纯组分分别为来源于金黄色葡萄球菌的肽聚糖(PGN(S. a))、来源于枯草芽胞杆菌的肽聚糖(PGN(B. s))、酵母聚糖(Zymosan)、磷壁酸(Lipoteichoic acid, LTA)、脂多糖(LipopoIysaccharides, LPS)和甘露聚糖(Mannan)。由于 PGN、Mannan 和 Zymosan 均为为不溶物，实验前将这3种组分重悬在碳酸缓冲液中后用超声波助溶，离心取上清进行下面的实验。I)包被:用碳酸缓冲液(O. IM NaHC03，2. 5mM Na2C03, pH 9. 6)溶解各种不同的细胞壁多糖组分。然后在每一个聚苯乙烯微量滴定板的反应孔中加入20 yg各组分，补充包被缓冲液至ΙΟΟμ 1，37°C孵育3h (空白对照孔不加入糖组分)。2)洗涤弃去孔内溶液，用 200μ I TBST (TBS, O. 05% Tween-20)洗 3 次，每次3min。3)封闭加入200 μ I封闭缓冲液(TBST，5% BSA) 4°C孵育过夜。次日用TBST洗涤。4)加样在反应孔中加入不同浓度的重组蛋白，置于湿盒中于37°C孵育此。然后用TBST洗漆,用硫氧还蛋白(thioredoxin, TRX)做阴性对照。5)加酶标一抗于各反应孔中，加入ΙΟΟμ I新鲜的用封闭缓冲液稀释的小鼠His单克隆抗体(I :5，000)，置于湿盒中于37°C下孵育lh，洗涤。6)加酶标二抗于各反应孔中，加入ΙΟΟμ I用封闭缓冲液稀释的HRP标记的羊抗小鼠IgG 二抗(I :20，000)，置于湿盒中于37°C孵育lh，洗涤。7)加底物缓冲液(100 μ g/ml 四甲基联苯胺，O. 24% H2O2, O. 2 M Na2HPO4, O. I M 柠檬酸，PH5. 5)显色于各反应孔中，加入50 μ I TMB显色液，从加入第一个孔开始记时。全部加完后避光37°C孵育lOmin。8)终止反应从第一孔开始计时后lOmin，每孔按照加入底物缓冲液的顺序加入50 μ I 终止液(2Μ H2SO4) O9)结果判定在酶标仪上于450nm处，用空白对照孔调零后测各孔的吸光值。如图7所示，重组蛋白TRX-BjApextrinl和TRX_BjApextrin2对两种来源的PGN都有显著的结合活性，但是不结合其他细胞壁组分。实施例8 :中国文昌鱼BjApextrinl和TRX_BjApextrin2融合蛋白的细菌不溶肽聚糖结合活性分析通过Pulldown试验来检测重组蛋白对不溶肽聚糖(PGN)的结合活性。将I μ g目的蛋白分别与5，10，20，50 μ g的两种细菌来源的PGN在Iml TBS(pH7. 5)缓冲液中4°C振荡孵育过夜；4°C、12000Xg离心lmin，沉淀用Iml TBS缓冲液洗5遍；用100 μ I TBS重悬沉淀，再加入20 μ I 6Χ上样缓冲液,混勻后沸煮IOmin ;然后进行Western blot分析,用His单克隆抗体来检测目的蛋白。如图8所示,重组蛋白TRX-BjApextrinl和RX_BjApextrin2对两种PGN都有显著的结合活性，并且结合活性随肽聚糖浓度的增加而增强。实施例9 :中国文昌鱼BjApextrinl缺失突变体融合蛋白的表达和纯化根据BjApextrinl基因的序列和同源比对的结果设计构建缺失突变体的引物，如下Δ C-R:5’-CCGCTCGAGCTGTTTGGT AAACCGTTGGAGG-3’BamHIΔ N-F 5，-CGCGGATCCCAAGGTGAAGT TGCGGCTGT-3，Xho I以含有BjApextrinl基因的pGEX Teasy质粒为模板，用FL-F和Λ C-R为引物PCR扩增得到C端缺失的片断Λ C;用Λ N-F和FL-R为引物PCR扩增得到端N缺失的片断Λ N。将PCR扩增产物克隆到原核融合表达载体pET32a上，得到重组表达载体pET32a_ Λ C和pET32a- Δ N (其构建过程如图4所示相同)，重组表达载体经测序鉴定正确。将pET32a_ Λ C和pET32a_ Λ N质粒转化大肠杆菌BL2 I (DE3)。基因工程菌超声裂解上清液和沉淀经SDS-PAGE电泳分析表明，菌株经诱导后在超声裂解沉淀中有明显的特异表达产物带。重组蛋白的纯化条件及过程与实施例4相同，如图9所示不溶的包涵体经变复性可得到较纯的重组蛋白。实施例10 :中国文昌鱼BjApextrinl缺失突变体融合蛋白的细菌肽聚糖结合活性分析用ELISA法检测重组蛋白TRX- Λ C和TRX- Δ N对细菌肽聚糖结合活性，方法与实施例7相同。如图10所示，TRX- Δ N对肽聚糖有显著的结合活性，而TRX- Δ C没有。
权利要求
1.BjApextrinl基因，其DNA序列如序列表中序列I所不。
2.由权利要求I所述BjApextrinl基因编码的BjApextrinl蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列3所示。
3.权利要求2所述BjApextrinl蛋白的生产方法,按以下步骤进行 (1)将权利要求I所述的BjApextrinl基因克隆到大肠杆菌表达载体pET32a，得到重组表达载体 pET32a_BjApextrinl ； (2)将pET32a-BjApextrinl 转化大肠杆菌菌株 BL21 (DE3)； (3)对转化的大肠杆菌BL21(DE3)在液体培养基2XYT，37°C培养4小时后加入终浓度为O. 2mM的IPTG在18°C诱导过夜； (4)重组中国文昌鱼BjApextrinl融合蛋白的纯化，具体是将菌液离心收集菌体，进行超声破碎，离心取沉淀进行变复性，得到蛋白。
4.权利要求2所述的BjApextrinl蛋白在作为制备治疗感染性疾病药物中的应用。
5.BjApextrin2基因，其DNA序列如序列表中序列2所示。
6.由权利要求5所述BjApextrin2基因编码的BjApextrin2蛋白，其氨基酸序列如序列表中序列4所示。
7.权利要求6所述BjApextrin2蛋白的生产方法,按以下步骤进行 (1)将权利要求5所述的BjApeXtrin2基因克隆到大肠杆菌表达载体pET32a，得到重组表达载体 pET32a_BjApextrin2 ； (2)将pET32a-BjApextrin2 转化大肠杆菌菌株 BL21 (DE3)； (3)对转化的大肠杆菌BL21(DE3)在液体培养基2X YT，37°C培养4小时后加入终浓度为O. 2mM的IPTG在18°C诱导过夜； (4)重组中国文昌鱼BjApextrin2融合蛋白的纯化，具体是将菌液离心收集菌体，进行超声破碎，离心取沉淀进行变复性，得到蛋白。
8.权利要求6所述的BjApextrin2蛋白在作为制备治疗感染性疾病药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及两个肽聚糖结合蛋白及其编码基因BjApextrin1和BjApextrin2，以及该蛋白在制备治疗感染性疾病药物中的应用。本发明根据已有的EST序列通过5′RACE和3′RACE,从中国文昌鱼的消化道中分离得到文昌鱼BjApextrin1和BjApextrin2基因,其DNA序列如序列表中序列1和序列2所示。该基因编码的蛋白(BjApextrin1和BjApextrin2)，其氨基酸序列如序列表中序列3和序列4所示。本发明的基因BjApextrin1和BjApextrin2编码的蛋白能够识别和凝集革兰氏阳性菌，并且特异结合细菌表面的生物大分子肽聚糖，可用于作为制备治疗感染性疾病的药物。
文档编号C12N15/12GK102925447SQ201210439488
公开日2013年2月13日 申请日期2012年11月6日 优先权日2012年11月6日
发明者徐安龙, 黄光瑞, 黄盛丰, 严信宇, 章玲玲, 杨平 申请人:中山大学