专利名称：酶法水解蛋白制备磷酸肽和非磷酸肽的方法
技术领域：
本发明属于乳制品开发和功能性保健食品技术领域，涉及一种酶法水解酪
蛋白制备磷酸肽(CPP)和非磷酸肽(CNPP)的方法。
背景技术：
近年来，人类钙营养不足的问题受到了广泛的关注。全世界，尤其是发展 中国家，钙缺乏早已是普遍现象，其中最严重的是孕妇、儿童和老年人。我国 正常人钙的推荐量为800mg/d，但是营养调查结果显示人均钙摄入量仅为400 mg/d，而儿童和孕妇实际摄入量还不到应摄入量的一半。我国老年人骨质疏松 症发病率达到30%-50%，儿童佝偻病发病率高达20%-50%。目前有研究表明， 膳食中摄入充足的钙可以减少高血压的发病率。因此，钙对不同年龄和性别的 人群都很重要。影响人体钙吸收的因素很多，除人体自身有吸收障碍问题外， 更重要的是我国的膳食结构是以植物性食品为主，动物性食品为辅的温饱型膳 食类型，这种膳食类型会造成人体摄入钙不足。人们一定要注意科学补钙，CPP 是当之无愧的科学补钙桥梁。此外，CPP同样可以结合其它金属元素并促成它 们被人体吸收，这更加增添了人们对CPP研究和开发的兴趣。
高血压是一种高发病率、高并发症、高致残率的严重影响人体健康的"无 声杀手"。统计表明，发达国家高血压患病率在20%以上，面其它国家的发病率 也在10% 20%。全世界每年的高血压病死亡率达1200万。对于高血压的治疗， 目前存在以下错误(1)对高血压的危害认识不够，不做治疗控制；(2)只单 纯降血压，不综合治疗各种危险因素；(3) —发现高血压就进行药物治疗，而 不做非药物治疗。研究表明，源于食物蛋白质的降血压肽完全可以克服药物治 疗中出现的种种副作用，它只对高血压患者起到降压作用，对血压正常者却无 降压作用，同时它还有免疫调节作用。进一步开发天然降血压肽产品是大势所 趋，它将成为非药物治疗中的重要组成部分。
酪蛋白中富含多种生物活性肽，其中CPP是被研究和开发最早的一种，具 有结合矿物质(如钙)的作用。CNPP作为一种天然存在且同时具有潜在抗氧化 活性和抑制ACE活性的物质，对高血压等疾病起到防治效果，无病人群食用可 以有预防保健作用，有病人群食用起到非药物治疗的作用。因此，采用酪蛋白 为原料制备生物活性肽己经成为当前的研究热点。目前，研究者报道了酪蛋白源的ACE抑制肽的分离纯化，但未对其功能性 组分的结构予以阐明；研究者还利用包括胰酶、碱性蛋白酶在内酶解与膜滤集 成工艺连续制备酪蛋白生物活性多肽，但其所用酶类种类多、价格贵 (CN1546682);另外有研究者以牛乳酪蛋白为原料、采用蛋白酶水解、离子交 换树脂脱盐生产由六肽至十一肽组成的ACE抑制肽(CN1552891)，但其工艺路 线较复杂，冷冻干燥使得成本不菲；还有研究者采用复合蛋白酶酶解酪蛋白制 备酪蛋白磷酸肽(CPP)，但未利用CNPP。
因此，采用价格适宜的蛋白酶水解酪蛋白制备CPP和CNPP，充分提高原 料利用率，既具有很大的经济效益，也具有一定的社会效益。而选择合适的脱 盐方式降低多肽产品中的盐类，以CPP和CNPP产品的推广利用具有重要的意 义。同时，对于CNPP产品中具有功能性质的重要多肽也有必要鉴定其结构， 便于深入研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种酶法水解酪蛋白同时制备酪蛋白磷酸肽(CPP)和 酪蛋白非磷酸肽(CNPP)的方法。
本发明的技术方案为以酪蛋白为原料，采用单一碱性蛋白酶Alcalase2.4L 进行控制水解，采用三硝基苯磺酸法监控DH值，然后采用乙醇-钙沉淀法从酪 蛋白水解液中分离CPP和CNPP，同时制备酪蛋白磷酸肽和酪蛋白非磷酸肽， CPP的部分采用真空干燥得到CPP粉末产品，得率35%以上。CNPP部分采用 纳滤浓縮，回收乙醇，采用大孔吸附树脂脱盐，然后采用喷雾干燥得到CNPP 粉末产品中，得率45%以上。对CNPP产品中两种ACE抑制活性肽和一种抗氧 化活性肽予以鉴定，得到其氨基酸序列。工艺为
(1) 溶解在55 65。C条件下，将酪蛋白溶解在ra为8.0 9.0的碱溶液 中，配成质量浓度16°/。 20% (m/m)的酪蛋白溶液。
(2) 酶解按1 1.5mL酶液/100g酪蛋白的比例加入Alcalase2.4L，在 55 65。C的温度下搅拌2 4h，取样，采用三硝基苯磺酸(TNBS)法监控DH值 达到15 2C)，然后升温至80 85。C，保温15min灭酶。
(3) 乙醇-钙沉淀加入1.2% (氯化钙质量/水解液体积)的氯化钙，再加 入食用级乙醇至乙醇终浓度70% 80%，搅拌30min，静置过夜，时间在6小时 以上，温度在30。C以下；静置分层的方法也可以由3000rpm离心20min替代。
(4) CPP产品的获得虹吸上清液，下沉部分离心(3000rpm， 15min)，沉 淀部分在45'C下真空干燥得到CPP粉末产品，CPP产品水分含量在4. 5%以下，将上清液合并，为CNPP部分。
(5) 纳滤浓縮CNPP与回收乙醇对(4)的酪蛋白非磷酸肽部分以截留相 对分子质量为300D的纳滤膜进行纳滤，得到酪蛋白非磷酸肽纳滤浓縮液和回收 乙醇。
(6) 大孔吸附树脂脱盐浓縮所得60 150mg/ml浓度的酪蛋白非磷酸肽 以每小时1个床体积的流速上样到DA201-C大孔吸附树脂柱，水洗后用70%乙 醇解吸。
(7) 喷雾干燥制得CNPP粉末进出风温度分别为160 18(TC和70 80 °C，喷雾干燥得到CNPP粉末。
(8) CNPP中ACE抑制活性肽和抗氧化肽的结构鉴定依次利用体积排阻色 谱S印hadexG-25、离子交换色谱DTF_02、大敢吸附树脂色谱DA201-C和半制备 型C18RP-HPLC从CNPP中分离得到两种抑制ACE活性肽和一种抗氧化活性肽。 再采用SE-HPLC、 LC/MS以及氨基酸分析证明这三种肽的氨基酸序列分别为 Tyr-Leu、 Glu-Asp-Val-Pro禾口 His-Ser。
本发明的有益效果(1)采用单一蛋白酶对酪蛋白进行水解，建立了高效
的酪蛋白酶水解工艺，原料利用率达到90%以上，同时得到CPP和CNPP两类生 物活性肽，实现低成本、高产出；(2)采用TNBS法监控DH值，建立了可行的 水解度监测方法，便于控制产物中CPP的产率及N/P摩尔比，减少了产品中的 灰分；(3)采用大孔吸附树脂和膜分离技术脱除产品中的盐分，脱盐后CNPP与 CPP产品中灰分含量在6呢以下；(4)以CNPP中重要组分的结构予以鉴定，为构 效关系和作用机理研究奠定基础。利用本发明提供的CPP与CNPP的制备方法， 提高了酪蛋白的利用率，在经济性和制备规模上体现其优势。同时产品中重要 功能成分的结构明确，有利于其推广利用，CPP与CNPP的用途是功能性食品配 料或保健食品。
图1 CPP与CNPP的制备工艺。
图2氨基酸分析与质谱鉴定CNPP中ACE抑制肽与抗氧化肽的结构。(a) Tyr-Leu; (b) Glu-Asp-Val-Pro; (c) His-Ser。
具体实施例方式
本发明的方法并非限定于此实施例。
实施例1
在10L夹层反应器中进行酶反应。将5000ml的水加入反应器中，升温至55°C，然后称取1000g酷蛋白，搅拌下缓慢加入水中。用2mol/L，取样用TNBS 监测DH。加入60g无水CaCl2，搅拌至完全溶解，然后在搅拌状态下缓慢加入食 用乙醇至最终浓度达到70% (v/v)，放置30min，离心(3000rpm， 20min)，沉 淀经真空干燥(40°C)制得CPP产品354g。上清液进纳滤装置(纳滤膜截留的 相对分子质量为300D)浓縮，透过液用于回收乙醇，浓縮(浓度为60mg/ml) 液上DA201-C大孔吸附树脂色谱柱，水洗脱盐后用70%乙醇解吸，流速为每小时 一个床体积，水洗时间3小时，解吸时间5小时。喷雾干燥，进风温度160'C， 出风温度80 。C ，制得CNPP产品486g。
CNPP样品配成3(F。的溶液，通过体积排阻色谱S印hadexG-25、 DTF-02离子 交换色谱、大孔吸附树脂色谱DA201-C和半制备型C18RP-HPLC从CNPP中分离 得到两种ACE抑制活性肽，采用SE-HPLC、 LC/MS和氨基酸分析对CNPP中的抑 制ACE活性肽进行一级结构鉴定，确其氨基酸序列分别为Tyr-Leu和 Glu-Asp-Val-Pro。
在25L夹层反应器中进行酶反应。将15000ml水加入反应器中，升温至65 °C，然后称取3750g酷蛋白，搅拌下缓慢加入水中。用2mol/LNaOH调节PH值 至8. 5，在65。C条件下使酪蛋白全部溶解，加入55mLAlcalase2. 4L，取样用TNBS 监测DH。加入180g无水CaCl2，搅拌至完全溶解，然后在搅拌状态下缓慢加入食 用乙醇至最终浓度达到80% (v/v)，静置过夜，虹吸上层清液后离心 (3000rpm，15min)，沉淀以真空干燥(45°C)制得CPP产品函g。上清液进纳 滤装置(纳滤膜截留的相对分子质量为300D)浓縮，透过液用于回收乙醇，浓 縮(浓度为150mg/ml)液上DA201-C大孔吸附树脂色谱柱，水洗脱盐后用70% 乙醇解吸，流速为每小时一个床体积，水洗时间3小时，解吸时间5小时。喷 雾干燥，进风温度180。C，出风温度7(TC，制得CNPP产品1690g。
CNPP样品配制成25%的溶液，通过体积排阻色谱S印hadex G_25、 DTF-02 离子交换色谱、大孔吸附树脂色谱DA201-C和半制备型C18RP-HPLC从CNPP中 分离得到两种ACE抑制活性太，采用SE-HPLC、 LC/MS和氨基酸分析对CNPP中 的抑制ACE活性肽进行一级结构鉴定，确其氨基酸序列分别为His-Ser。
权利要求
1、一种酶法水解酪蛋白制备酪蛋白磷酸肽和酪蛋白非磷酸肽的方法，以酪蛋白为原料，采用单一碱性蛋白酶Alcasase2.4L进行控制水解，采用三硝基苯磺酸法监控DH值，然后采用乙醇-钙分离法从酪蛋白水解液中同时制备酪蛋白磷酸肽和酪蛋白非磷酸肽，工艺为(1)溶解在55～65℃下，将酪蛋白溶解在PH8.0～9.0的碱溶液中，配成质量浓度16％～20％的酪蛋白溶液；(2)酶解按1～1.5mL酶液/100g酪蛋白的比例加入Alcalase2.4L，在55～65℃下搅拌2～4h，取样，采用三硝基苯磺酸法监控DH值达到15～20，然后升温灭酶；(3)乙醇-钙沉淀加入氯化钙质量/水解液体积比1.2％的氯化钙，再加入食用级乙醇终浓度70％～80％，搅拌30min，30℃以下静置过夜；或3000rpm离心20min分层；(4)酪蛋白磷酸肽产品的获得虹吸出上层清液，底部的沉淀部分3000rpm、15min离心，沉淀部分在45℃以下真空干燥得到酪蛋白磷酸肽粉末产品，产品水分含量在4.5％以下；将上清液合并，为酪蛋白非磷酸肽部分；(5)酪蛋白非磷酸肽的纳滤浓缩与乙醇回收对(4)的酪蛋白非磷酸肽部分以截留相对分子质量为300D的纳滤膜进行纳滤，得到酪蛋白非磷酸肽纳滤浓缩液和回收乙醇；(6)大孔吸附树脂脱盐浓缩所得60～150mg/ml浓度的酪蛋白非磷酸肽以每小时1个床体积的流速上样至DA201-C大孔吸附树脂柱，水洗后用70％乙醇解吸；(7)喷雾干燥进出风温度分别为160～180℃和70～80℃，喷雾干燥得到酪蛋白非磷酸肽粉末；(8)酪蛋白非磷酸肽中ACE抑制活性肽和抗氧化活性肽的结构鉴定依次利用体积排阴色谱SephadexG-25、离子交换色谱DTF-02、大孔吸附树脂色谱DA201-C和半制备型RP-HPLC从酪蛋白非磷酸肽中分离得到两种抑制ACE活性肽和一种抗氧化活性肽；再采用SE-HPLC、LC/MS以及氨基酸分析证明这三种肽的氨基酸序列分别为Tyr-Leu、Glu-Asp-Val-Pro和His-Ser。
2、 根据权利要求1所述方法，其特征是酪蛋白磷酸肽的氮/磷摩尔比为20 25: 1，含有原料酪蛋白中95%的磷，酪蛋白磷酸肽得率达到35%，脱盐后酪蛋磷酸肽产品中灰分含量在6%以下。
3、根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的酪蛋白非磷酸肽的脱盐率达到98%，脱盐过程酪蛋白非磷酸肽回收率达到90%，产品得率达到45%， 脱盐后酪蛋白非磷酸肽产品中灰分含量在6%以下。
全文摘要
本发明公开了一种酶法水解酪蛋白制备酪蛋白磷酸肽和酪蛋白非磷酸肽的方法，主要以酪蛋白为原料，采用单一碱性蛋白酶Alcalase2.4L进行控制水解，采用三硝基苯磺酸法监控DH值，用乙醇—钙分离法从酪蛋白水解液中同时制备CPP和CNPP。CPP的氮/磷摩尔比为20～25比1，得率35％以上；CNPP得率达到45％；鉴定出CNPP产品中两种ACE抑制活性肽和一种抗氧化活性肽的氨基酸序列为Tyr-Leu、Glu-Asp-Val-Pro和His-Ser。本发明酶水解效果好，价格适宜，工艺路线合理，原料利用率高，易于放大，产品CPP和CNPP可广泛应用于功能性食品配料和保健食品。
文档编号C12P21/02GK101289685SQ20071002160
公开日2008年10月22日 申请日期2007年4月17日 优先权日2007年4月17日
发明者季万兰, 健 蔡 申请人:江苏梁丰食品集团有限公司