蚕豆蛋白水解物中的乳酸菌促生长肽的制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种蚕豆蛋白水解物中的促生长肽的制备方法，实施步骤如下：(1)利用蛋白酶对蚕豆蛋白进行酶解反应后将所得到的蚕豆蛋白水解物进行冷冻干燥；(2)干燥粉溶解在双蒸水中，制备成不同浓度的水溶液用于测定蚕豆蛋白水解物对保加利亚乳杆菌等乳酸菌的生长促进作用；(3)采用葡聚糖凝胶层析法进行分离纯化，得到促生长活性最高的组分；(4)再通过高效液相色谱法进行分离纯化，得到单一的促生长活性组分。利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱MOLDI-TOF-MS进行分子量分析。本发明适合实验室分离纯化蚕豆多肽，可以分离出纯度较高的促生长肽。
【专利说明】蚕豆蛋白水解物中的乳酸菌促生长肽的制备方法
【技术领域】:
[0001 ] 本发明涉及一种蚕豆蛋白水解物中的促生长肽的分离纯化方法。
【背景技术】:
[0002]蚕豆是人类最早栽培的豆类作物之一，蚕豆中含有丰富的营养物质。其主要成分是淀粉，含量高达45~47 %;蚕豆中蛋白质含量在豆类中仅次于大豆，含量高达25~30 %，并且其氨基酸组成也接近于人体和动物所需要的理想比例，所以蚕豆被誉为植物蛋白质的新来源；蚕豆也是维生素及钙和锌等微量元素的重要营养源。此外，蚕豆中还含有黄酮类、活性蛋白和肽类等生物活性物质，是一种物美价廉的营养食品。我国是农业大国，也是大豆的故乡，但传统的大豆蛋白作为主要的植物蛋白已不能满足需要，一些空气潮湿、气候凉爽的农业地区，蚕豆的生产已作为进口大豆的替代品，而我国蚕豆主要用于生产粉丝、粉皮，这仅仅利用其中的淀粉部分，而作为重要的营养成分的蛋白质未被利用或部分回收作为饲料，这不仅是一种巨大的浪费，而且还会造成环境的污染。
[0003]目前，虽然人们承认蚕豆的营养价值和经济价值，但对其保健食品和医药等方面开发利用不够，因此充分挖掘我国蚕豆资源潜力，利用现代科学技术研究蚕豆保健与医疗功能的研究具有重要的现实意义。这不仅可以解决植物蛋白资源缺乏，减轻大豆蛋白供给的压力，同时也解决蚕豆旺季积压，附加值低的难题。
[0004]肽作为蛋白水解的产物，有着许多蛋白质不具备的生物活性和物理性质。我国在活性肽研究主要集中在大豆活性肽，乳源性活性肽及水产类活性肽，对其它的植物源蛋白关注不是很多，因此研究和开发蚕豆肽在食品开发与生产等领域有着广阔的前景。本专利利用蚕豆蛋白水解物中的活性成分，来促进乳酸菌的生长，提高活菌数量，一方面对蚕豆进行了深层次的开发；另一发面，乳酸菌作为发酵奶制品的常用发酵剂，提高它的生长速度，可以节约大量的生产成本，为后续关于促生长肽的研究打下了基础。因此，对蚕豆肽的研究开发具有一定的理论基础和重要的现实意义。
【发明内容】
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[0005]本发明的目的在于提供一种工艺简便，提纯效果显著的蚕豆蛋白水解物中的促生长肽的分离纯化方法。
[0006]为实现上述目的本发明所采用的实施方式如下:
[0007]1.蚕豆分离蛋白的制备:料液比为1: 12，提取pH8.0，超声提取的功率660W，提取时间为20min，蚕豆分离蛋白中蛋白质含量为89.32% ； (2)蚕豆蛋白水解物的制备:按底物浓度6% -8%加入蒸馏水中混匀，70-90°C下热处理蚕豆分离蛋白10-15min，按照酶与底物比为84000-96000U/g加入碱性蛋白酶，通过加入2M氢氧化钠来保持pH8.5不变，反应温度为50-70°C，反应时间lh，水解度达到15-18% ；(3)水解后的蚕豆蛋白水解物进行冷冻干燥，将干燥粉溶解在双蒸水中，制备成不同浓度的水溶液用于测定蚕豆蛋白水解物对保加利亚乳杆菌生长的促进作用；(4)蚕豆蛋白水解物采用葡聚糖凝胶S^hadex G_25进行分离纯化，收集流出液并积累浓缩，得到促生长活性最高的组分；(5)再通过高效液相色谱法分离纯化，得到单一的促生长活性组分。利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱MOLD 1-TOF-MS进行分子量分析。
[0008]2.所述的蚕豆蛋白水解物中的促生长肽的分离纯化方法，其特征是:所述的葡聚糖凝胶层析分离条件为:葡聚糖凝胶层析柱=Sephadex G_25 ;洗脱液:双蒸水；流速:
0.3-0.5mL/min ;上样量:l_2mL ;紫外检测:280nm
[0009]3.所述的蚕豆蛋白水解物中的促生长肽的分离纯化方法，其特征是:所述高效液相色谱HPLC分离纯化条件如下:色谱柱:4.6 X 250mm，C18反相柱，流动相:含1-5%乙腈的水溶液，流速:0.8-lmL/min ;梯度:等度洗脱；紫外检测:280nm根据洗脱峰的保留时间，手动收集样品，然后进行浓缩。
[0010]4.所述的蚕豆蛋白水解物中的促生长肽的分离纯化方法，其特性是:所述的测定蚕豆蛋白水解物或分离纯化后组分对乳酸菌(保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌等)生长的促进作用试验方法如下:
[0011]a.所用菌种为实验室保存的乳酸菌，所用培养基为MRS培养基和脱脂乳培养基；
[0012]b.将保加利亚乳杆菌等按3~5%接种量接种于含有不同浓度的蚕豆蛋白水解物的MRS液体培养基中，37°C培养20h，在660nm下测量发酵液的OD值，检测对保加利亚乳杆菌生长的促进作用；
[0013]C.按照b所述方法对分离纯化后的蚕豆肽组分依据> 2g/L的浓度添加到MRS液体培养基中，37°C培养20h， 取出发酵液，在660nm下测量OD值，检测对保加利亚乳杆菌生长的促进作用。
[0014]本发明的效果是:
[0015]通过本发明，成功分离得到了蚕豆蛋白水解物中的促生长肽。蚕豆促生长肽是蚕豆蛋白酶水解作用后形成的多肽片段，可溶于水，热稳定性较好，同时具有促进保加利亚乳杆菌生长的特点。
[0016]通过凝胶色谱和反相高效液相色谱等色谱分离方法，我们最终获得了单一多肽组分。根据基质辅助激光解吸飞行时间质谱M0LD1-T0F-MS测得分子量为30?a。
[0017]其目的意义在于:为开发一系列新的多肽产品提供思路和方法，同时为研究和开发多肽的新功效作用提供数据，有助于满足人们日益提高的生活水平的需要。
[0018]总之，本发明工艺简单，应用范围广；对今后开发利用蚕豆多肽提纯物质进行药品、保健品等各种广品的生广奠定了基础。
【专利附图】
【附图说明】:
[0019]附图1是Sephadex G-25凝胶层析谱图。
[0020]附图2是高效液相色谱RP-HPLC分离谱图。
[0021]附图3是基质辅助激光解吸飞行时间质谱M0LD1-T0F-MS谱图。
【具体实施方式】:
[0022]实施例1:葡聚糖凝胶层析分离纯化
[0023]包括以下步骤:a.Sephadex G_25的预处理；b.装柱；c.上样；d.洗脱、收集:[0024]a.Sephadex G-25的预处理:取16g的Sephadex G-25,至于烧杯中，加入蒸懼水，轻轻搅拌，弃去悬浮颗粒，如此反复洗涤几次后，加入过量的去离子水，室温下溶胀72h。
[0025]b.装柱:取直径1.6cm，长40cm的层析柱，垂直固定在铁架台上，将层析柱下端的止水螺丝旋紧，向柱中加入约5~7cm的去离子水，排除气泡，然后缓慢加入溶胀好的凝胶，注意使柱中无气泡，打开出样阀。凝胶缓缓下沉，继续加入，用玻璃棒轻轻搅拌，使柱中无界限。待凝胶柱装好后，在凝胶表面放一层滤纸，避免上样时破坏胶面。用去离子水平衡层析柱，并打开恒流泵控制流速为0.3mL/min。
[0026]c.上样:将柱的上端打开，用吸管将凝胶上面的去离子水吸出，留一薄层液面，以免空气进入。沿管壁缓缓加入2mL 5%的蚕豆蛋白水解物溶液，注意不要打乱凝胶表面。拧开下端的螺旋夹，使样品进入凝胶中，当样品接近凝胶表面时，加I~2mL洗脱液，随即用多量的洗脱液洗脱；
[0027]d.洗脱、收集:当样品完全进入凝胶后，用去离子水洗脱样品，洗脱速度为0.3mL/min,并分管收集，1.5mL/管，收集80管，在280nm下检测收集样品的OD值。
[0028]经上述方法分离，蚕豆蛋白水解物得到的良好的分离，共得到4个活性峰，见图1，其中第四个峰对保加利亚乳杆菌生长的促进作用最为明显。
[0029]实施例2:高效液相色谱RP-HPLC分离纯化
[0030]高效液相色谱HPLC操作步骤如下:
[0031]a.向忙液瓶中倒入足够当天操作用的溶剂，溶剂预先过0.45 ii m膜并脱气；
[0032]b.高效液相色谱仪紫外可见检测仪应预热30min后，打开泵开关；
[0033]c.向泵中充入新鲜溶剂水-乙腈，直到基线无波动为止；
[0034]d.进样:进样量为20 ii L ;
[0035]e.记录色谱图，打印色谱图；
[0036]高效液相色谱HPLC分离蚕豆促生长肽所用的色谱柱为4.6 X 250mm, C18反相柱，用含1%乙腈水溶液洗脱，在280nm下检测，根据洗脱峰的保留时间，手动收集样品，然后进行浓缩。
[0037]经S印hadex G-25凝胶层析分离后的第四个组分再经RP-HPLC分离纯化后，得到
2个组分，见图2，其中第二个组分对保加利亚乳杆菌的生长具有促进作用。
[0038]实施例3:基质辅助激光解吸飞行时间质谱M0LD1-T0F-MS测定单一活性组分分子量
[0039]将分离纯化得到的单一活性组分利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱MOLD 1-TOF-MS测定其分子量，操作步骤如下:
[0040]1.实验仪器:
【权利要求】
1.一种蚕豆蛋白水解物中的促生长肽的分离纯化方法，其组成包括:(1)蚕豆分离蛋白的制备:料液比为1: 12，提取pH8.0，超声提取的功率660W，提取时间为20min，蚕豆分离蛋白中蛋白质含量为89.32% ；(2)蚕豆蛋白水解物的制备:按底物浓度6%-8%加入蒸馏水中混匀，70-90°C下热处理蚕豆分离蛋白10-15min，按照酶与底物比为84000-96000U/g加入碱性蛋白酶，通过加入2M氢氧化钠来保持pH8.5不变，反应温度为50-70°C，反应时间lh，水解度达到15-18% ；(3)水解后的蚕豆蛋白水解物进行冷冻干燥，将干燥粉溶解在双蒸水中，制备成不同浓度的水溶液用于测定蚕豆蛋白水解物对保加利亚乳杆菌等乳酸菌生长的促进作用；(4)蚕豆蛋白水解物采用葡聚糖凝胶S^hadex G_25进行分离纯化，收集流出液并积累浓缩，得到促生长活性最高的组分；(5)再通过高效液相色谱法分离纯化，得到单一的促生长活性组分。利用基质辅助激光解吸飞行时间质谱MOLD1-TOF-MS进行分子量分析。
2.根据权利要求1所述的蚕豆蛋白水解物中的促生长肽的分离纯化方法，其特征是:所述的葡聚糖凝胶层析分离条件为:葡聚糖凝胶层析柱=Sephadex G_25 ;洗脱液:双蒸水；流速:0.3-0.5mL/min ;上样量:l_2mL ;紫外检测:280nm。
3.根据权利要求1或2所述的蚕豆蛋白水解物中的促生长肽的分离纯化方法，其特征是:所述高效液相色谱HPLC分离纯化条件如下:色谱柱:4.6 X 250mm，C18反相柱；流动相:含卜5%乙腈的水溶液；流速:0.8-lmL/min ;梯度:等度洗脱；紫外检测:280nm。根据洗脱峰的保留时间，手动收集样品，然后进行浓缩。
4.根据权利I或2或3所述的蚕豆蛋白水解物中的促生长肽的分离纯化方法，其特性是:所述的测定蚕豆蛋白水解物或分离纯化后组分对乳酸菌(保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌等)生长的促进作用试验方法如下: a.所用菌种为实验室保存的 乳酸菌，所用培养基为MRS培养基和脱脂乳培养基。 b.将保加利亚乳杆菌等按3-5%接种量接种于含有不同浓度的蚕豆蛋白水解物的MRS液体培养基中，37°C培养20h，在660nm下测量发酵液的OD值，检测对乳酸菌生长的促进作用； c.按照b所述方法对分离纯化后的蚕豆肽组分依据>2g/L的浓度添加到MRS液体培养基中，37°C培养20h，取出发酵液，在660nm下测量OD值，检测对保加利亚乳杆菌生长的促进作用。
【文档编号】C12P21/06GK103468770SQ201210184875
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2012年6月7日 优先权日:2012年6月7日
【发明者】王艳萍, 肖萍 申请人:天津科技大学