冠心病易感基因无创检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测冠心病易感基因的试剂盒。该试剂盒包括检测NOS3基因上G894T(rs1799983)、MTHFR基因上C677T(rs1801133)、LPL基因上HindIII(rs320)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过检测与冠心病发生密切相关的3个单核苷酸多态性位点的基因型从基因层面来评估冠心病发病的风险级别，指导人群提早预防疾病的发生。本发明采样方法是口腔黏膜细胞采样，无痛、无创、避免了交叉感染。测序检测结果准确，可靠，不必购置价格昂贵的进口专用仪器，方法易普及推广。
【专利说明】冠心病易感基因无创检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种冠心病的基因检测试剂盒，根据检测结果从基因层面评估人群冠心病发生的风险级别，并且指导冠心病高危人群提早预防和治疗。
【背景技术】
[0002]冠状动脉性心脏病(coronary artery heart disease, CHD)已经成为严重危害人类生命健康的疾病之一。众多研究发现，该疾病具有较高的遗传倾向，通过分子诊断检测与冠心病发生密切相关的基因位点就可以提前评估受检者患冠心病的风险，提早预防和治疗。
[0003]多数学者认为凡涉及到血栓形成、血管收缩、动脉粥样硬化的因素均易致CHD的发生。内皮型一氧化氮合酶(N0S3)是L-精氨酸和一氧化氮途径的关键酶。NO是所有硝基类扩血管药的活性成分，具有抑制血小板聚集、粘附，抑制白细胞的趋化激活，松弛血管平滑肌、舒张血管，抑制血管平滑肌细胞的增生、迁移及清除超氧自由基等重要作用。NO是心血管系统中抗冠状动脉粥样硬化、血栓形成，维持正常血管舒缩反应中必不可少的保护因子。生理状态下，血管内皮细胞能持续产生少量NO。NO产生量的减少或活性的下降均有可能参与CHD的发生与发展。因此，N0S3基因被列为CHD的一个侯选基因。有文章报道人类血浆NO代谢产物水平与N0S3基因多态性相关。近来的研究发现N0S3基因第7外显子中的G894T突变和CHD的发病及其心肌梗塞(MI)风险有关。2001年魏丹宏的研究表明，N0S3基因G894T突变与中国汉族人群CHD的发生有关，N0S3基因G894T突变可能是中国人CHD的一个独立的危险因子。
[0004]亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)是叶酸代谢系统中的关键酶，其基因多态性可导致叶酸代谢关键酶活性降低，引起叶酸代谢障碍，从而引发包括冠心病在内的多种疾病。2006年，潘棱等研究了 122例冠心病患者与56例对照组的MTHFR C677T基因多态性。结果发现:冠心病组中TT、TC、CC的基因型频率分别为30%、45%、25%，T等位基因频率为53%，C等位基因频率为47% ;而对照组中TT、TC、CC的基因型频率分别为25%、32%、43%，T等位基因频率为41%，C等位基因频率为59%。两组基因型分布和等位基因频率分布差异有显著性。从而得出结论=MTHFR基因C677T点突变与冠心病发病有一定的关系。
[0005]脂蛋白脂酶(LPL)基因多态性与血脂及冠心病关系密切，因此目前对脂蛋白脂酶基因多态性研究相对较多，但主要集中在Hind III酶切位点。该位点位于LPL基因的第8号内含子中，与8、9外显子分别相距600和700个碱基，是由一个T — G碱基置换引起HindIII酶切位点缺失导致的多态性，无Hind III酶切位点定为H-，有酶切位点定为H+，产生3种基因型Η+Η+、Η+Η-、Η-Η-。国内外研究表明，不同基因型与血脂成分及冠心病发病风险等级关系密切。
[0006]因此，建立简单、快速的冠心病易感基因无创检测方法，能够检测出与疾病发生相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出易患冠心病的高危人群，有针对性的进行指导和预防，对于降低冠心病的发生、保障人群安全健康具有非常重要的意义。
【发明内容】
[0007]在基于G894T(rsl799983)、MTHFR基因上C677T(rsl801133)、LPL基因上HindIII(rs320)的3个单核苷酸多态性位点基因型可用来评估冠心病发病风险级别，本发明提供一种冠心病基因无创检测试剂盒。
[0008]该试剂盒包括:
检测 G894T (rsl799983)、MTHFR 基因上 C677T(rsl801133)、LPL 基因上 HindIII(rs320)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；
PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)；
PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；
DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20 等)。
[0009]本发明试剂盒的组分和含量包括:
PCR 反应体系:10 XPCR 反应缓冲液 2.5ul ；25mM dNTP 混合液 0.2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul ;20uM特异性引物对(每条引物各0.25ul) ；ddH20 19.175ul ；
PCR 产物纯化体系:lU/ul SAP 酶 0.75ul ；10U/ul ExoI 酶 0.375ul ；ddH20 3.875ul ；测序反应体系:25%BigDye mix lul ；3.2uM DNA 测序引物 lul ；125mM EDTA 溶液 lul ；100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH20 2ul。
[0010]本试剂盒供一人份检测使用，试剂盒的保存温度为-20°C。
[0011]
【具体实施方式】
[0012]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0013]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0014]
实施例1.检测试剂盒的使用
1、抽提DNA模板
刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。
[0015]2、PCR扩增反应
使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对:
(I)N0S3 (G894T )正向引物:5’ ATGAGGAAACCAGTGGGAGA3’
N0S3 (G894T)反向引物:5’ CCTCACCTCCAGGATGTTGT3’
(2 ) MTHFR (C677T )正向引物:5’ AGGGAGGCTTCAACTACGC3’
MTHFR (C677T)反向引物:5’GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3’(3) LPL (HindIII)正向引物:5’TCATTTGGCACTGTTTCTTGT3’
LPL (HindIII)反向引物:5’CTTATGTTACTGGGCTTTCACC3’
PCR扩增的反应体系为:10XPCR反应缓冲液2.5ul ;25mM的dNTP混合液0.2ul、5U/ul Taq 酶 0.125ul、DNA 模板 lul (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0.25ul、ddH2019.175ul ；
反应条件为:94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C I分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。
[0016]3、PCR扩增产物纯化
使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物20ul，lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0.375ul，去离子水 3.875ul。
[0017]在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。
[0018]4、DNA测序反应
使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物:
(1)N0S3 (G894T)测序引物:5’ ATGAGGAAACCAGTGGGAGA3’
(2)MTHFR (C677T)测序引物:5’AGGGAGGCTTCAACTACGC3’
(3)LPL (HindIII)测序引物:5’ TCATTTGGCACTGTTTCTTGT3’
反应的体系为总体积5ul ，包含PCR纯化产物lul，25%Bigdye mixlul, 3.2uM DNA测序引物lul，去离子水2ul。
[0019]在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98°C 2min，进行25个循环的960C 30s,55°C 30s, 60°C 4min。
[0020]反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100%乙醇溶液15ul，于室温下沉淀15min ;在4°C , 3600rpm/min的转速离心30min,轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min离心15min,轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入测
序仪中。
[0021]5、基因型分析
熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。
[0022]实施例2.为人群进行预防冠心病基因无创检测的服务
1.采样及抽提DNA
由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提
2.基因型检测
使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的N0S3基因上G894T (rsl799983)、MTHFR基因上C677T(rsl801133)、LPL基因上HindIII (rs320)的3个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这3个SNPs位点的基因型。
[0023]3.冠心病高危人群风险评估分析
通过对受检者SNPs基因型的分析，出具冠心病风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者 N0S3 基因上 G894T (rsl799983)、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、LPL 基因上HindIII (rs320)的3个SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别，并由医 师向受检者详细说明和解读冠心病基因无创检测报告单。
【权利要求】
1.一种筛查冠心病高危人群的基因无创检测试剂盒，其特征在于:检测N0S3基因上G894T (rsl799983)、MTHFR 基因上 C677T(rsl801133)、LPL 基因上 HindIII (rs320)的 3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20 等。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述的特异性引物对是指针对N0S3基因上 G894T (rsl799983)、MTHFR 基因上 C677T (rsl801133)、LPL 基因上 HindIII (rs320)的3个单核苷酸多态性位点，能特异性扩增出包含这3个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述的DNA测序引物是针对N0S3基因上 G894T (rsl799983)、MTHFR 基因上 C677T(rsl801133)、LPL 基因上 HindIII (rs320)的3个单核苷酸多态性位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出上述3个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
4.根据权利要求1所示的试剂盒，其特征在于，所含的3对特异性引物序列如下:
(I)N0S3 (G894T )正向引物:5’ ATGAGGAAACCAGTGGGAGA3’ N0S3 (G894T)反向引物:5’ CCTCACCTCCAGGATGTTGT3’
(2 ) MTHFR (C677T )正向引物:5’ AGGGAGGCTTCAACTACGC3’ MTHFR (C677T)反向引物:5’GCGGTTGAGGGTGTAGAAGT3’ (3)LPL (HindIII)正向引物:5’TCATTTGGCACTGTTTCTTGT3’
LPL (HindIII)反向引物:5’CTTATGTTACTGGGCTTTCACC3’。
5.根据权利要求1所述的试 剂盒，其特征在于，所含的3条DNA测序引物序列如下: (1)N0S3 (G894T)测序引物:5’ ATGAGGAAACCAGTGGGAGA3’ (2)MTHFR (C677T)测序引物:5’AGGGAGGCTTCAACTACGC3’ (3)LPL (HindIII)测序引物:5’ TCATTTGGCACTGTTTCTTGT3’。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括: (1)?0?反应体系:10父？0?反应缓冲液2.5111，251111dNTP 混合液 0.2ul，5U / ul TaqDNA聚合酶0.125ul，20uM特异性引物对，每条引物各0.25ul，ddH20 19.175ul ； (2)PCR 产物纯化体系:1 U / ul SAP 酶 0.75ul，10 U / ul ExoI 酶 0.375ul，ddH203.875ul ； (3)测序反应体系:25%BigDye mixlul，3.2uM DNA测序引物 lul，125mM EDTA溶液 lul，100% 乙醇溶液 15ul, 70% 乙醇溶液 30ul, HIDI 溶液 8ul, ddH20 2ul。
7.本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。
【文档编号】C12Q1/68GK103468781SQ201210184470
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2012年6月6日 优先权日:2012年6月6日
【发明者】郑俊斌 申请人:解码（上海）生物医药科技有限公司