专利名称：一种酶法水解鸡蛋蛋清蛋白制备蛋清肽的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域。具体涉及一种碱性蛋白酶水解鸡蛋蛋清蛋白制备蛋清肽的方法。水解高效稳定，水解得到的活性小肽可用作生产保健品的原料。
背景技术：
过去人们认为，蛋白质须经消化道中的各种蛋白酶酶促水解后，主要以氨基酸的形式吸收。近年来随着研究的深入，科学家们认为人体吸收蛋白质主要不是以氨基酸的形式吸收，而是以肽的形式吸收，这是对人体蛋白质吸收机制认识的重大突破，也给营养摄入方式及肽作为其他活性用途提出了新的要求。多肽吸收机制具有明显特点，包括不需消化即直接吸收；吸收快速，口服剂如同针剂；吸收时多肽不被破坏；多肽具有100％被人体吸收的特点，吸收后不会有任何排泄物，全部被人体吸收和利用；多肽具有主动吸收的特点，这对于消化能力差、营养缺乏、身体虚弱、体弱多病者有重要意义；多肽在主动吸收时还具有载体作用，可将一些营养物质，特别是钙等对人体有益的微量元素吸附、粘粘、装载在本体上；多肽具有运输工具的作用，将各种营养物质吸附在本体后再输送到身体的各个细胞、器官、组织，一起被人体吸收和利用，发挥各自不同的功能作用；多肽被人体吸收后，在人体内可起到信使作用，作为神经递质在生物体内传递信息、指挥神经、发挥自身作用、维护人体神经的整体效应，使人体更加灵活、灵敏和聪慧。科学家们把多肽原料中间体作为药品和食品配方，目的就是要加强药效，增强吸收率。
进一步的研究还揭示了肽比游离氨基酸的消化吸收更快、更多，说明肽的生物学效价和营养价值比游离氨基酸的为高，也正是水解生物活性肽引起人们广泛关注的原因所在。鸡蛋蛋清蛋白在可控制的条件下经蛋白酶水解，利用现代生物工程手段获分离和制备的蛋清肽，可广泛应用于各类保健饮品、营养食品或糕点中。水解所得到的蛋清肽将具有保持原有蛋清蛋白营养价值高和营养均衡的特点，同时又具有易消化吸收、低抗原(低肽的低抗原性使得食后不会引起过敏反应)，耐热等新优势。
鸡蛋生产产量大，价格低，作为蛋白质中营养效价最高、氨基酸最为平衡的蛋清，通过严格和可控制条件的酶解后制得蛋清肽。寻求开发鸡蛋资源途径和提高鸡蛋蛋品加工附加值是人们一直关注的热点课题。蛋清蛋白是热敏感性蛋白，加热很容易变性，水解后的上清大多为小分子肽-蛋清肽，加热不易发生凝固或絮状沉淀，可制成蛋清多肽饮料，其营养丰富且吸收良好；蛋清肽能将原来得100分的平衡氨基酸很好地保持，由于水解使得分子量变小，所以加热不会发生凝固，可添加到各类液态食品中。
水解产物可经脱盐处理，喷雾干燥制成胶囊或速溶营养粉。酶水解法生产活性肽的产品安全性高，生产条件温和，水解程度可控制，成本低，已成为最主要的生产方法。鸡蛋蛋清在天然状态下的pH一般为9.0～9.2，无需调节pH就可以直接用碱性蛋白酶水解，简化了操作步骤。
对天然蛋白进行加工获得各种生物活性肽，具有多种人体代谢和生理调节功能，易于吸收，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用，食用安全性极高，是当前国际食品界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。本发明以蛋清蛋白为原料经酶解后制得的蛋清肽具有免疫调节、抗疲劳、抗辐射、对化学性肝损伤有辅助保护作用。
发明内容
本发明的目的在于提出一种操作步骤少、设备要求低、水解效率高的酶法水解鸡蛋蛋清蛋白制备蛋清肽的方法，并以此水解产物为原料来开发功能保健品。
本发明提出的酶法水解鸡蛋蛋清蛋白制备蛋清肽的方法，包括寻求一种合适的蛋白水解酶，并通过适当的水解反应条件对鸡蛋卵清蛋白进行水解，水解产生活性小肽的效率可达到60％左右。具体步骤如下取鸡蛋蛋清(1mL蛋清含有0.1克蛋白)加入到反应瓶中，搅匀，然后将其放入振荡恒温水浴锅中，在65-70℃温度条件下预热5-10分钟变性；将蛋清冷却至50～56℃，加入浓度为85-95mg/mL的碱性蛋白酶溶液，用量为蛋清质量的3-5％，混匀，将蛋清与酶混合液置于50～56℃振荡恒温水浴锅中酶解8～10小时，即得到所需产物小分子肽蛋清。
对本发明制得的蛋清蛋白水解产物大小分布情况以及蛋白含量和活性进行了检测，检测方法和结果如下对酶解8～10小时的产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测，结果显示鸡蛋蛋清蛋白未经酶解时有五条主要的蛋白条带，而经过酶解8～10小时以后，水解产物主要为14000D以下的多肽、小肽和游离氨基酸(见附图)。
对酶解产物进行凝胶过滤层析，层析柱选用Pharmacia公司的产品Superdex 75 HR10/30。酶解产物上样量为100μl，采用pH7.4的PBS作为洗脱缓冲液，洗脱速度为1mL/min，洗脱50min。分子量标记采用GST-X(26000D)，溶菌酶(14000D)，21bp的寡核苷酸引物(约6800D)。结果得到6个洗脱峰，其中1号峰分子量在14000D～26000D，2号峰在6800D～14000D，3～6号峰在6800D以下。
采用Bradford法测定了碱性蛋白酶对鸡蛋蛋清蛋白酶解9小时后的的蛋白浓度，蛋清蛋白的蛋白质浓度为53.8mg/mL，酶解后产物的蛋白质浓度为38.8mg/mL，水解效率为61％。
用小鼠进行动物实验，经免疫调节作用检验结果表明可明显提高单核巨噬细胞功能，体液免疫和细胞免疫水平；明显降低CCL4中毒小鼠血清谷丙转氨酶GPT和谷草转氨酶GOT水平，使肝脏病变明显减轻。这表明水解产物具有一定的生物活性。
本发明的特点有通过对蛋清蛋白加热预变性，充分暴露蛋白肽链上酶切位点，使得酶解反应得以顺利进行；采用碱性蛋白水解酶使酶解反应可在天然状态下直接对鸡蛋蛋清蛋白进行水解，操作步骤简单；蛋清蛋白无需稀释可直接加酶作用，既方便又经济；蛋清预热温度较低，对设备要求不高，可操作性强。
图1为酶解产物SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)结果。
其中，1、8-10小时酶解产物，2、2600分子量标记，3、14000分子量标记，4、未经酶解的鸡蛋蛋清蛋白。
具体实施例方式
实施例1，选用碱性蛋白酶对鸡蛋卵清蛋白进行水解，获得活性小分子肽的具体方式如下取新鲜鸡蛋蛋清蛋清1L(1mL蛋清含有0.1克蛋白)加入到容积为3L的反应瓶中，缓慢搅匀，将其放入恒温振荡水浴锅中，待温度升至68℃时预热5～7分钟变性；待蛋清冷却至大约50～53℃时加入34mL(浓度90mg/mL)碱性蛋白酶溶液，轻轻混匀，将蛋清与酶混合液置于53～55℃振荡恒温水浴锅中酶解反应9小时左右。
按照前述方法对酶解产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测，结果见图。
通过Superdex 75 HR 10/30凝胶过滤层析法对酶解产物的大小进行分析，结果得到6个洗脱峰，各成分蛋白分子量大小见前所述。
Bradford法进行酶解产物蛋白浓度测定，结果浓度为38.8mg/mL，水解效率为60％。
实施例2，取新鲜鸡蛋蛋清蛋清100mL，加入到容积为500mL的反应瓶中，缓慢搅匀，放入恒温振荡水浴锅中，待温度升至65-68℃时预热6分钟变性；自然降温至53～56℃时加入3.5-4.0mL(浓度88mg/mL)碱性蛋白酶溶液，轻轻混匀，在53～56℃条件下酶解反应8小时即可。经测定，结果浓度为380mg/mL，水解效率为61％。
实施例3，取新鲜鸡蛋蛋清蛋清500mL，加入到容积为2L的反应瓶中，缓慢搅匀，然后放入恒温振荡水浴锅中，待温度升至70℃，预热，10分钟变性；自然降温至50℃时加入25mL(浓度85mg/mL)碱性蛋白酶溶液，轻轻混匀，在50～52℃条件下酶解反应10小时即可。经测定，结果浓度为40mg/mL，水解效率为62％。
权利要求
1.一种酶法水解鸡蛋蛋清蛋白制备蛋清肽的方法，其特征在于具体步骤如下取蛋清放入反应瓶中，搅匀，置于振荡式恒温水浴锅中，65-70℃条件下预热5～10分钟变性；将蛋清冷却至50～56℃，加入浓度为85-95mg/mL的碱性蛋白酶溶液，用量为蛋清质量的3-5％，混匀，将蛋清与酶的混合液置于50～56℃振荡恒温水浴锅中酶解8～10小时。
全文摘要
本发明涉及一种酶法水解鸡蛋蛋清蛋白制备活性多肽—蛋清肽的方法。本发明通过选择合适的碱性蛋白酶和优化水解条件，使水解效率达到60％以上。生化分析和生物学试验结果显示，由本发明酶解方法所得到的水解多肽产物为稳定的具有生物活性的小分子肽，水解产物具有免疫促进、抗疲劳、抗辐射及对抗化学肝损伤辅助作用等生物学活性。
文档编号C12P21/00GK1483830SQ0314169
公开日2004年3月24日 申请日期2003年7月18日 优先权日2003年7月18日
发明者曹平生, 王维荣, 闵太善, 黄伟达, 谢承光, 杨长锁, 严华祥 申请人:上海复旦新杨生物科技有限责任公司, 复旦大学