房颤易感基因无创检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种检测房颤易感基因无创检测试剂盒。该试剂盒包括检测AGT基因上M235T(rs699)、GNB3基因上C825T(rs5443)、TGF-Β1基因上T869C(rs1982073)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、PCR反应组件、PCR产物纯化组件、DNA测序反应组件等。本发明的试剂盒通过检测与房颤发生密切相关的3个单核苷酸多态性位点的基因型从基因层面来评估房颤发病的风险级别，指导人群提早预防疾病的发生。本发明采样方法是口腔黏膜细胞采样，无痛、无创、避免了交叉感染。测序检测结果准确，可靠，不必购置价格昂贵的进口专用仪器，方法易普及推广。
【专利说明】房颤易感基因无创检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本专利属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体涉及一种房颤易感基因无创检测试剂盒，通过检测房颤易感性密切相关的基因，从基因层面评估房颤遗传易感性的风险级别，为房颤的预防提供建议指导。
【背景技术】
[0002]心房颤动(atrial fibrillation, AF,简称房颤)是一种以心房快速而不规则激动为特征的心律失常，在临床上也是持续性心律失常中最为常见的一种，它不但使患者频繁心悸，而且心房的不规则颤动易产生左心房血栓，导致多种并发症，重者危及生命。
[0003]房颤的患病率随着年龄增长而显著增加。我国目前房颤患者约有1000万人，成人房颤的发病率为0.77%，80岁以上人群中上升至7.5%，与国外调查结果类似，上海和山东威海等地区的房颤流行病学调查也显示了相似的患病趋势。
[0004]单核苷酸多态性(SNP)是人类基因组DNA序列变异的主要形式，是决定人类疾病易感性和药物反应性个体差异的重要因素。现有的研究已经明确了一些房颤家系的致病基因和位点以及一些基因多态性位点与房颤的相关性。
[0005]血管紧张素原(angiotensinogen, AGT)基因由5个外显子和4个内含子构成,第2外显子上第704位核苷酸T-C突变导致第235位氨基酸由甲硫氨酸变成苏氨酸。这个突变可引起血浆中AGT水平轻度增加，促使血管紧张素Ang I和Ang II增加，进而改变血管收缩、水盐代谢和醛固酮合成，导致心房纤维化及传导不均一性等，这对房颤的潜在诊断和预测疾病的发生、发展具有重要的应用价值。
[0006]G蛋白是由α、β、Y三个亚基组成的异源三聚体，介导G蛋白偶联受体激动后的细胞内信号转导，参与细胞多种生命过程。其中编码G蛋白β3亚基的GNB3基因第10个外显子存在一个多态位点C825T，T等位基因的出现导致β 3基因第9外显子在转录时缺失123个碱基，由此产生了活性更强的GNB3剪辑变异体，导致下游的信号活动增强，这种作用在中国人群中增加了房颤发生的风险，显示了 GNB3 C825T是家族性房颤的一个遗传危险因素。
[0007]转化生长因子β? (Transforming growth factor betal, TGF-βΙ)在心房纤维化的发生和调控方面有非常重要的作用，该基因的T869C位点多态性与房颤的发生有较高相关性。这种基因多态性能引起编码区第10密码子亮氨酸(Leu)替换为脯氨酸(Ρι.ο)，影响蛋白的疏水性，导致TGF-β I蛋白输出改变，引起心房纤维化，为房颤的发生提供病理基础。张忠栋等2009年对103例房颤患者和109例对照者的研究显示，T869C位点SNP与中国华南地区汉族人群房颤的发生有明显的相关性，T等位基因是房颤发生的保护基因，C等位基因是房颤的易患基因。
单核苷酸多态性已成为人类群体遗传学的生物学标志，因此，建立简单、快速的房颤易感基因无创检测方法，能够检测出与房颤发生相关的基因单核苷酸位点基因型，及时筛查出易患房颤的高危人群，及早进行预防，对降低房颤发病率、减轻社会经济负担有着重要意义。
【发明内容】
[0008]基于AGT 基因上 M235T (rs699)、GNB3 基因上 C825T(rs5443)、TGF-B I 基因上T869C (rsl982073)的3个单核苷酸多态性位点基因型可用来评估房颤发病风险级别，本发明提供一种房颤基因无创检测试剂盒。
[0009]该试剂盒包括:
检测 AGT 基因上 M235T (rs699)、GNB3 基因上 C825T (rs5443)、TGF- B I 基因上 T869C(rsl982073)的3个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物对及DNA测序引物；
PCR反应组件(包括Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、ddH20等)；
PCR产物纯化组件(包括SAP酶、ExoI酶、ddH20等)；
DNA测序反应组件(包括BigDye mix，EDTA溶液、100%乙醇溶液、70%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20 等)。
[0010]本发明试剂盒的组分和含量包括:
PCR 反应体系:10 XPCR 反应缓冲液 2.5ul ；25mM dNTP 混合液 0.2ul ；5U/ul Taq DNA聚合酶0.125ul ;20uM特异性引物对(每条引物各0.25ul) ；ddH20 19.175ul ；
PCR 产物纯化体系:lU/ul SAP 酶 0.75ul ；10U/ul ExoI 酶 0.375ul ；ddH20 3.875ul ；测序反应体系:25%BigDye mix lul ；3.2uM DNA 测序引物 lul ；125mM EDTA 溶液 lul ；100% 乙醇溶液 15ul ；70% 乙醇溶液 30ul ；HIDI 溶液 8ul ；ddH20 2ul。
[0011]本试剂盒供一人份检测使用，试剂盒的保存温度为-20°C。
[0012]
【具体实施方式】
[0013]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0014]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0015]
实施例1.检测试剂盒的使用 1、抽提DNA模板
刮取受检者口腔黏膜上皮细胞，用酚氯仿法抽提基因组DNA。
[0016]2、PCR扩增反应
使用检测试剂盒中的PCR反应组件，其中，含有下列引物对:
(1)AGT (M235T)正向引物:5’ CTGACAGGCTACAGGCAATC3’
AGT (M235T)反向引物:5’ CACATAGTAGGGCAGCAGGT3’
(2)GNB3 (C825T)正向引物:5’ TTCCTGCCGCTTGTTTGA3’
GNB3 (C825T)反向引物:5’AAATGCCAGGAACCCAGAA3’(3 ) TGF- B I (T869C)正向引物:5’ TTTCCGTGGGATACTGAGACA3’
TGF- B I (T869C)反向引物:5’ GCTTCCGCTTCACCAGCT3’
PCR扩增的反应体系为:10XPCR反应缓冲液2.5ul ;25mM的dNTP混合液0.2ul、5U/ul Taq 酶 0.125ul、DNA 模板 lul (12_15ng 左右)、20uM 正向引物反向引物各 0.25ul、ddH2019.175ul ；
反应条件为:94°C 4分钟变性和酶激活，94°C 30秒变性，55°C 30秒退火，72°C I分钟延长，循环28次，最后72°C延长5分钟以上。
[0017]3、PCR扩增产物纯化
使用检测试剂盒中的PCR产物纯化组件，反应体系为总体积25ul，包含PCR产物20ul，lU/ul SAP 酶 0.75ul，10U/ul ExoI 酶 0.375ul，去离子水 3.875ul。
[0018]在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为37°C、15min，72°C、20min。
[0019]4、DNA测序反应
使用检测试剂盒中的测序反应组件，其中，含有下列DNA测序引物:
(1)AGT (M235T)测序引物:5’ CTGACAGGCTACAGGCAATC3’
(2)GNB3 (C825T)测序引物:5’ TTCCTGCCGCTTGTTTGA3’
(3)TGF-B I (T869C)测序引物:5’ TTTCCGTGGGATACTGAGACA3’
反应的体系为总体积5ul，包含PCR纯化产物lul，25%Bigdye mixlul, 3.2uM DNA测序引物lul，去离子水2ul。
[0020]在ABI2720型PCR扩增仪上进行反应，反应条件为98 °C 2min,进行25个循环的960C 30s,55°C 30s, 60°C 4min。
[0021]反应结束后加入125mM EDTA溶液Iul和100%乙醇溶液15ul，于室温下沉淀15min ;在4°C , 3600rpm/min的转速离心30min,轻轻倒去上清液；加入70%乙醇溶液30ul,3600rpm/min离心15min,轻轻倒去上清液；室温放置20min后加入HIDI溶液8ul,放入测
序仪中。
[0022]5、基因型分析
熟悉DNA测序技术的本领域技术人员能够通过辨识DNA测序图谱确定所检测的SNP位点的基因型。
[0023]实施例2.为人群进行预防房颤基因无创检测的服务 1.采样及抽提DNA
由医院检验科医师指导受检者使用口腔采样拭进行口腔上皮细胞取样，采用酚氯仿法进行口腔上皮细胞的DNA抽提。
[0024]2.基因型检测
使用本发明提供的试剂盒，对受检者基因组DNA的AGT基因上M235T (rs699)、GNB3基因上C825T (rs5443) ,TGF- B I基因上T869C (rsl982073)的3个单核苷酸多态性位点分别进行DNA测序，确定这3个SNPs位点的基因型。
[0025]3.房颤高危人群风险评估分析
通过对受检者SNPs基因型的分析，出具房颤风险评估分析报告单。报告中详细说明了受检者 AGT 基因上 M235T (rs699)、GNB3 基因上 C825T (rs5443)、TGF- B I 基因上 T869C(rsl982073)的3个SNP位点基因检测信息以及遗传风险评估结果。除此之外，根据受检者的风险级别， 并由医师向受检者详细说明和解读房颤基因无创检测报告单。
【权利要求】
1.一种筛查房颤高危人群的基因无创检测试剂盒，其特征在于:检测AGT基因上M235T(rs699)、GNB3 基因上 C825T (rs5443)、TGF- B I 基因上 T869C (rsl982073)的 3 个单核苷酸多态性位点基因型的特异性引物与DNA测序引物、Taq酶、dNTP混合液、反应缓冲液、SAP酶、ExoI酶、BigDye mix、EDTA溶液、70%乙醇溶液、100%乙醇溶液、HIDI溶液、ddH20等。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述的特异性引物对是指针对AGT基因上 M235T (rs699)、GNB3 基因上 C825T(rs5443)、TGF-B I 基因上 T869C (rsl982073)的3个单核苷酸多态性位点，能特异性扩增出包含这3个SNPs位点的DNA片段的引物对。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于:所述的DNA测序引物是针对AGT基因上 M235T (rs699)、GNB3 基因上 C825T (rs5443)、TGF- B I 基因上 T869C (rsl982073)的 3个单核苷酸多态性位点而设计，能通过DNA测序技术特异性检测出上述3个SNPs位点基因型的DNA测序引物。
4.根据权利要求1所示的试剂盒，其特征在于，所含的3对特异性引物序列如下: (1)AGT (M235T)正向引物:5’ CTGACAGGCTACAGGCAATC3’ AGT (M235T)反向 引物:5’ CACATAGTAGGGCAGCAGGT3’ (2)GNB3 (C825T)正向引物:5’ TTCCTGCCGCTTGTTTGA3’ GNB3 (C825T)反向引物:5’AAATGCCAGGAACCCAGAA3’
(3 ) TGF- B I (T869C)正向引物:5’ TTTCCGTGGGATACTGAGACA3’
TGF- B I (T869C)反向引物:5’GCTTCCGCTTCACCAGCT3’。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所含的3条DNA测序引物序列如下: (1)AGT (M235T)测序引物:5’ CTGACAGGCTACAGGCAATC3’ (2)GNB3 (C825T)测序引物:5’ TTCCTGCCGCTTGTTTGA3’ (3)TGF-B I (T869C)测序引物:5’ TTTCCGTGGGATACTGAGACA3’。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于试剂盒的组分和含量包括: (1)?0?反应体系:10父？0?反应缓冲液2.5111，251111dNTP 混合液 0.2ul，5U / ul TaqDNA聚合酶0.125ul，20uM特异性引物对，每条引物各0.25ul，ddH20 19.175ul ； (2)PCR 产物纯化体系:1 U / ul SAP 酶 0.75ul，10 U / ul ExoI 酶 0.375ul，ddH203.875ul ； (3)测序反应体系:25%BigDye mixlul, 3.2uM DNA测序引物 lul，125mM EDTA溶液 lul，100% 乙醇溶液 15ul,70% 乙醇溶液 30ul, HIDI 溶液 8ul, ddH20 2ul。
7.本试剂盒供一人份检测应用，试剂盒的保存温度为_20°C。
【文档编号】C12Q1/68GK103468784SQ201210184474
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2012年6月6日 优先权日:2012年6月6日
【发明者】郑俊斌 申请人:解码（上海）生物医药科技有限公司