专利名称：固定化重组E.coli BL21－pET/aspC细胞制备L－高苯丙氨酸的制作方法
技术领域：
本发明涉及固定化重组E.coli BL21-pET/aspC细胞制备氨基酸的方法，具体的说涉及将含天冬氨酸转氨酶的重组E.coli BL21-pET/aspC细胞固定化，通过转氨作用将底物α-羰基苯丁酸转化成L-高苯丙氨酸的方法。
背景技术：
L-高苯丙氨酸及其酯是用来制备血管紧张素(ACE)抑制剂类药物的重要原料。它是目前世界上约20种抗高血压新药的共同中间体，例如Enalapril(依那普利)、Benazepril(贝那普利)、Lisinopril(赖诺普利)、Captopril(卡托普利)、Temocapril、Cilazapril(西拉普利)等。全球高血压病人至2006年可超过6.5亿。庞大的患者群体和高增长率，使得抗高血压药物市场增长势头非常明显。2006年全球高血压药物市场将达到385亿美元，到2007年市场容量预计将超过520亿美元。专利方面，依那普利(Merk公司)在2000年到期，贝那普利(Ciba-Geigy公司)在2002年到期，其它专利也于2005年前到期。在今后5年内ACE抑制剂作为非专利药，在抗高血压药物市场中所占的比率较大，以美元计约占25％。目前国内很多制药企业都在开发仿制ACE抑制剂类药物，因而L-高苯丙氨酸及其酯的需求将会急剧增加。
现行制备L-高苯丙氨酸的方法主要是化学合成法(CN1361098A)，步骤如下(a)将甘氨酸酯或甘氨酸酯的加成盐与亚硝酸盐化合物低温下进行肟化反应，生产N-羟基亚胺基氯代乙酸酯(Cloroximidoacetate Ester)；(b)在有机碱存在下，将N-羟基亚胺基氯代乙酸酯与苯乙烯进行环加成反应生成异噁唑啉(Isoxazoline)；(c)在手性催化剂存在下，将加压氢化得到手性化合物L-高苯丙氨酸。
发明内容
本发明的目的是提供一种用固定化重组E.coli BL21-pET/aspC细胞连续生产L-高苯丙氨酸的方法，提高了细胞内酶的稳定性，减少了细胞内辅酶的流失，简化了分离工艺，使L-高苯丙氨酸制备产率大幅提高，降低生产成本。
本发明的目的可以通过以下措施达到一种用固定化重组E.coli BL21-pET/aspC细胞制备L-高苯丙氨酸的方法，将α-羰基苯丁酸与L-谷氨酸或L-天门冬氨酸混匀，调节pH至7.0～9.5，加入非离子型表面活性剂配成反应液，将固定化重组E.coli BL21-pET/aspC细胞加入反应液中，在惰性气体保护下30～50℃反应4～24h，得白色混悬液，调节pH过滤得L-高苯丙氨酸。
α-羰基苯丁酸与L-谷氨酸按摩尔比为1∶1～1.6的比例混合，固定化细胞(即固定化重组E.coli BL21-pET/aspC细胞)与反应液的质量体积比为1％～5％，非离子型表面活性剂与反应液质量体积比为0.1％～0.6％。
上述非离子型表面活性剂优选为聚山梨酯--吐温(Tween)系列表面活性剂，最优为Tween-20，Tween-40，Tween-60，Tween-65，Tween8-0，Tween-85。
上述固定化细胞中所固定化的微生物细胞为含天冬氨酸转氨酶的重组E.coli BL21-pET/aspC。
重组E.coli BL21-pET/aspC的制备方法见专利CN1757737A。
重组E.coli BL21-pET/aspC的具体制备方法为天冬氨酸转氨酶aspC基因调自大肠杆菌K12(标准菌株)。由NCBI检索，根据报道的大肠杆菌K12(标准菌株)aspC序列经VectorNTI8.0软件设计引物如下正向引物5`ATGTTTGAGAACATTACCGC3`反缶引物5`GTTTGTCATCAGTCTCAGCC3`。
采用PCR钓取大肠杆菌K12的天冬氨酸转氨酶基因aspC。
天冬氨酸转氨酶基因aspC与下述的组成型启动子(记为P123)相连，(该启动子的改变碱基部位见下划线)，获取P123-aspC。
TGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATTGCAATTTCACACAACAACACACCTTAACACTCGCCTAACGTTAAAGTGTGTP并将P123-aspC插入至TaKaRa公司pMD-18T载体中，对钓取的aspC基因进行了测序鉴定。利用T载体的HindIII和EcoR I位点双酶切得到新的带有酶切位点的片断P123-aspC。插入到相同酶切后的载体PET22b中。获得重组质粒pET/aspC。制备E.coli BL21感受态细胞，将重组质粒pET/aspC导入E.coli BL21中，选择重组子E.coli BL21-pET/aspC。
本发明使用盐酸和NaOH溶液调节pH值。
固定化细胞的固定化方法为将聚乙烯醇溶胀24h，加入海藻酸钠，灭菌锅加热使其充分溶化，趁热搅拌。将菌悬液与活性炭混合，待聚乙烯醇冷却后与其搅拌均匀。用注射器滴加到交联剂溶液中，形成一定直径的小球，并在其中浸泡3-12h(冰箱冷藏过夜)。用生理盐水洗涤，冰箱保存，用于转化。
在固定化细胞中按质量比计，聚乙烯醇∶海藻酸钠∶微生物细胞(湿重)∶活性炭＝8～12∶0.1～1∶10～30∶5～20；交联剂溶液为硼砂-氯化钙溶液、硼酸-氯化钙溶液或硼酸-硼砂-氯化钙溶液。
优选的转化方法为取一定量的α-羰基苯丁酸，按摩尔比加入L-Glu，混匀，调节pH至8.5，加入0.4％的吐温-80。加入固定化细胞。充氮气保护，置于40℃，120rpm摇床，反应20h。得白色混悬液。
将得到的白色混悬液，酸化过滤除去不溶物，再调节pH至5.5得到白色的L-高苯丙氨酸固体。具体为将固定化细胞从反应液中取出，在反应液加入盐酸调节pH至1以下，过滤除去反应液中的不溶物，加入NaOH调节pH至5.5，反应液中析出白色不溶物即为L-高苯丙氨酸，过滤即得。
本发明的特征在于固定化重组E.coli BL21-pET/aspC细胞过程中，先用活性炭与菌悬液混合。再与添加海藻酸钠的聚乙烯醇混合包埋，滴加至硼砂-氯化钙溶液固化，由于活性炭对辅酶磷酸吡哆醛具有一定的吸附作用，采用该方法，辅酶的稳定性较其他方法显著改善。在L-高苯丙氨酸制备过程中，采用廉价的L-谷氨酸为氨基供体，添加吐温类表面活性剂，使得产物形态为细微晶体，产率显著提高。
本发明采用固定化的方式，提高了固定化细胞的机械强度，提高了细胞内酶的稳定性，减少细胞内辅酶的流失，简化了分离工艺，考虑了固定化细胞成球效果，机械强度，固定化细胞的半衰期可达16天(批次)。本发明制备的固定化细胞，机械强度好，韧性大，吸水膨胀性显著改善，易于操作。L-高苯丙氨酸产率提高显著。
本发明具有如下优点1.对比化学合成法，酶反应条件温和，只需常温常压。
2.L-高苯丙氨酸在反应条件下溶解度低，采用固定化细胞制备，产物的分离简单。
3.本发明在固定化过程中加入活性碳，由于活性炭对辅酶磷酸吡哆醛的吸附作用，采用该方法，辅酶固定化的稳定性较其他方法显著改善，批次较其他方法显著增加。
4.本发明采用廉价的L-谷氨酸为氨基供体，相对L-天冬氨酸，成本将降低。
5.本发明在反应过程中加入0.4％的吐温-80，使得产物对固定化细胞颗粒的吸附效果改善，传质效应增强，产率为原来的135.28％。
图1为本发明各实施例与对比例固定化半衰期及平均转化率对比图。
具体实施例方式
实施例1取2g聚乙烯醇溶胀24h，加入0.04g海藻酸钠，灭菌锅加热使其充分溶化，趁热搅拌。将6g重组E.coli BL21-pET/aspC菌悬液与1g的活性炭混合，待聚乙烯醇冷却后与其搅拌均匀。用注射器滴加到硼砂-氯化钙交联剂溶液中，形成一定直径的小球，浸泡3h，冰箱冷冻。解冻后用生理盐水洗涤。
取30mL 10g/L的α-羰基苯丁酸，加入0.3g(按摩尔比1∶1.2)L-Glu(L-谷氨酸)，混匀，调节pH至8.5，加入0.4％(与总反应液质量体积比)的吐温-80配成反应液。加入3％(w/v)的固定化细胞。充氮气保护，置于37℃，120rpm摇床，反应20h。将固定化细胞从反应液中取出，在反应液加入盐酸酸化至pH至1以下，过滤除去反应液中的不溶物，加入NaOH调节pH至5.5，反应液中析出白色不溶物即为L-高苯丙氨酸，过滤即得。固定化细胞的半衰期为13天(批次)，平均转化率(α-羰基苯丁酸转化为L-高苯丙氨酸的比率)为73.2％。
实施例2
取2g聚乙烯醇溶胀24h，加入0.04g海藻酸钠，灭菌锅加热使其充分溶化，趁热搅拌。将6g重组E.coli BL21-pET/aspC菌悬液与1g的活性炭混合，待聚乙烯醇冷却后与其搅拌均匀。用注射器滴加到硼砂-氯化钙交联剂溶液中，形成一定直径的小球，并在其中浸泡12h。用生理盐水洗涤。
取30mL 10g/L的α-羰基苯丁酸，加入0.4g(按摩尔比1∶1.6)L-Glu(L-谷氨酸)，混匀，调节pH至8.5，加入0.5％(w/v)的吐温-60配成反应液。加入4％(w/v)的固定化细胞。充氮气保护，置于37℃，120rpm摇床，反应20h。按实施例1的方法提取L-高苯丙氨酸。固定化细胞的半衰期为16天(批次)，平均转化率为76.5％。
实施例3取2g聚乙烯醇溶胀24h，加入0.04g海藻酸钠，灭菌锅加热使其充分溶化，趁热搅拌。将6g重组E.coli BL21-pET/aspC菌悬液与1g的活性炭混合，待聚乙烯醇冷却后与其搅拌均匀。用注射器滴加到硼砂-氯化钙交联剂溶液中，形成一定直径的小球，并在其中浸泡12h。用生理盐水洗涤。
取30mL10g/L的α-羰基苯丁酸，加入0.3g(按摩尔比1∶1.2)L-Glu(L-谷氨酸)，混匀，调节pH至8.5，加入0.4％(w/v)的吐温-80配成反应液。加入3％(w/v)的固定化细胞。充氮气保护，置于40℃，120rpm摇床，反应20h。按实施例1的方法提取L-高苯丙氨酸。平均转化率为90.1％。
实施例4取8g聚乙烯醇溶胀，加入1g海藻酸钠，灭菌锅加热使其充分溶化，趁热搅拌。将30g重组E.coli BL21-pET/aspC菌悬液与15g的活性炭混合，待聚乙烯醇冷却后与其搅拌均匀。用注射器滴加到硼酸-硼砂-氯化钙交联剂溶液中，形成一定直径的小球，并在其中浸泡12h。用生理盐水洗涤。
取30mL10g/L的α-羰基苯丁酸，加入0.3g(按摩尔比1∶1.2)L-Glu(L-谷氨酸)，混匀，调节pH至7.0，加入0.4％(w/v)的吐温-80配成反应液。加入3％(w/v)的固定化细胞。充氮气保护，置于40℃，120rpm摇床，反应24h。按实施例1的方法提取L-高苯丙氨酸。平均转化率为83.2％。
实施例5取12g聚乙烯醇溶胀，加入0.1g海藻酸钠，灭菌锅加热使其充分溶化，趁热搅拌。将10g重组E.coli BL21-pET/aspC菌悬液与5g的活性炭混合，待聚乙烯醇冷却后与其搅拌均匀。用注射器滴加到硼砂-氯化钙交联剂溶液中，形成一定直径的小球，并在其中浸泡12h。用生理盐水洗涤。
取30mL10g/L的α-羰基苯丁酸，加入0.3g(按摩尔比1∶1.2)L-Glu(L-谷氨酸)，混匀，调节pH至8.5，加入0.2％(w/v)的吐温-80配成反应液。加入4％(w/v)的固定化细胞。充氮气保护，置于40℃，120rpm摇床，反应20h。按实施例1的方法提取L-高苯丙氨酸。平均转化率为88.3％。
实施例6取2g聚乙烯醇溶胀24h，加入0.04g海藻酸钠，灭菌锅加热使其充分溶化，趁热搅拌。将6g重组E.coli BL21-pET/aspC菌悬液与1g的活性炭混合，待聚乙烯醇冷却后与其搅拌均匀。用注射器滴加到硼砂-氯化钙交联剂溶液中，形成一定直径的小球，并在其中浸泡12h。用生理盐水洗涤。
取30mL10g/L的α-羰基苯丁酸，加入0.27g(按摩尔比1∶1.2)L-Asp(L-天门冬氨酸)，混匀，调节pH至8.5，加入0.4％(w/v)的吐温-80配成反应液。加入3％(w/v)的固定化细胞细胞。充氮气保护，置于40℃，120rpm摇床，反应20h。按实施例1的方法提取L-高苯丙氨酸。平均转化率为80.3％。
实施例7取2g聚乙烯醇溶胀24h，加入0.04g海藻酸钠，灭菌锅加热使其充分溶化，趁热搅拌。将6g重组E.coli BL21-pET/aspC菌悬液与1g的活性炭混合，待聚乙烯醇冷却后与其搅拌均匀。用注射器滴加到硼砂-氯化钙交联剂溶液中，形成一定直径的小球，并在其中浸泡10h。用生理盐水洗涤。
取30mL10g/L的α-羰基苯丁酸，加入0.3g(按摩尔比1∶1.2)L-Glu，混匀，调节pH至8.5，加入0.4％(w/v)的吐温-80配成反应液。加入3％(w/v)的固定化细胞。充氮气保护，置于40℃，120rpm摇床，反应14h。按实施例1的方法提取L-高苯丙氨酸。平均转化率为85.6％。
实施例8取2g聚乙烯醇溶胀24h，加入0.04g海藻酸钠，灭菌锅加热使其充分溶化，趁热搅拌。将6g重组E.coli BL21-pETC/aspC菌悬液与1g的活性炭混合，待聚乙烯醇冷却后与其搅拌均匀。用注射器滴加到硼酸-氯化钙交联剂溶液中，形成一定直径的小球，并在其中浸泡12h。用生理盐水洗涤。
取30mL10g/L的α-羰基苯丁酸，加入0.3g(按摩尔比1∶1.2)L-Glu(L-谷氨酸)，混匀，调节pH至9.5，加入0.4％(w/v)的吐温-80配成反应液。加入3％(w/v)的固定化细胞。充氮气保护，置于35℃，120rpm摇床，反应20h。按实施例1的方法提取L-高苯丙氨酸。平均转化率为87.1％。
实施例9取2g聚乙烯醇溶胀24h，加入0.04g海藻酸钠，灭菌锅加热使其充分溶化，趁热搅拌。将6g重组E.coli BL21-pET/aspC菌悬液与1g的活性炭混合，待聚乙烯醇冷却后与其搅拌均匀。用注射器滴加到硼砂-氯化钙交联剂溶液中，形成一定直径的小球，并在其中浸泡12h。用生理盐水洗涤。
取30mL10g/L的α-羰基苯丁酸，加入0.3g(按摩尔比1∶1.2)L-Glu(L-谷氨酸)，混匀，调节pH至8.5，加入0.6％(与总反应液质量体积比)的吐温-80配成反应液。加入3％(w/v)的固定化细胞。充氮气保护，置于40℃，120rpm摇床，反应20h。按实施例1的方法提取L-高苯丙氨酸。平均转化率为84.7％。
对比例1将2g聚乙烯醇溶胀24h，灭菌锅加热使其充分溶化，趁热搅拌。待聚乙烯醇冷却后与6g重组E.coli BL21-pET/aspC菌悬液搅拌均匀。加入交联剂搅拌，冰箱冷冻。解冻后切成3×3×3mm的小块。用生理盐水洗涤。
取30mL10g/L的α-羰基苯丁酸，加入0.3g(按摩尔比1∶1.2)L-Glu(L-谷氨酸)，混匀，调节pH至8.5，加入0.4％(质量体积比)的吐温-80。加入3％(w/v)的固定化细胞。充氮气保护，置于37℃，120rpm摇床，反应20h。按实施例1的方法提取L-高苯丙氨酸。固定化细胞的半衰期为6天(批次)，平均转化率为64.9％。
对比例2将2g聚乙烯醇溶胀24h，灭菌锅加热使其充分溶化，趁热搅拌。待聚乙烯醇冷却后与将6g重组E.coli BL21-pET/aspC菌悬液搅拌均匀。用注射器滴加到交联剂溶液中，形成一定直径的小球，并在其中浸泡12h。用生理盐水洗涤。
取30mL10g/L的α-羰基苯丁酸，加入0.3g(按摩尔比1∶1.2)L-Glu(L-谷氨酸)，混匀，调节pH至8.5，加入0.4％(质量体积比)的吐温-80。加入3％(w/v)的固定化细胞。充氮气保护，置于37℃，120rpm摇床，反应20h。按实施例1的方法提取L-高苯丙氨酸。固定化细胞的半衰期为7天(批次)，平均转化率为75.2％。
对比例3将2g聚乙烯醇溶胀24h，加入0.04g的海藻酸钠，灭菌锅加热使其充分溶化，趁热搅拌。待聚乙烯醇冷却后与将6g重组E.coli BL21-pET/aspC菌悬液搅拌均匀。用注射器滴加到交联剂溶液中，形成一定直径的小球，固定化凝胶成球效果好，并在其中浸泡12h。用生理盐水洗涤。
取30mL10g/L的α-羰基苯丁酸，加入0.3g(按摩尔比1∶1.2)L-Glu(L-谷氨酸)，混匀，调节pH至8.5，加入0.4％(质量体积比)的吐温-80。加入3％(w/v)的固定化细胞。充氮气保护，置于37℃，120rpm摇床，反应20h。按实施例1的方法提取L-高苯丙氨酸。固定化细胞的半衰期为8天(批次)，平均转化率为77.3％。
对比例4将2g聚乙烯醇溶胀24h，加入0.04g的海藻酸钠，灭菌锅加热使其充分溶化，趁热搅拌。将6g重组E.coli BL21-pET/aspC菌悬液与1g的活性炭混合，待聚乙烯醇冷却后与其搅拌均匀。用注射器滴加到硼砂-氯化钙交联剂溶液中，形成一定直径的小球，并在其中浸泡12h。用生理盐水洗涤。
取30mL10g/L的α-羰基苯丁酸，加入0.3g(按摩尔比1∶1.2)L-Glu(L-谷氨酸)，混匀，调节pH至8.5。加入3％(w/v)的固定化细胞。充氮气保护，置于37℃，120rpm摇床，反应20h。按实施例1的方法提取L-高苯丙氨酸。固定化细胞的半衰期为5天(批次)，平均转化率46.6％。
由对比例2和3可看出，在细胞的固定化中，活性炭对于提升固定化细胞的半衰期具有重要作用。由对比例4可看出，非离子型表面活性剂对于平均转化率的提升也有重要意义。
权利要求
1.一种固定化重组E.coli BL21-pET/aspC细胞制备L-高苯丙氨酸的方法，其特征在于将α-羰基苯丁酸与L-谷氨酸或L-天门冬氨酸混匀，调节pH至7.0～9.5，加入非离子型表面活性剂配成反应液，将固定化重组E.coliBL21-pET/aspC细胞加入反应液中，在惰性气体保护下30～50℃反应4～24h，得白色混悬液，调节pH过滤得L-高苯丙氨酸。
2.根据权利要求1所述的制备L-高苯丙氨酸的方法，其特征在于α-羰基苯丁酸与L-谷氨酸按摩尔比为1∶1～1.6的比例混合，固定化细胞与反应液的质量体积比为1％～5％，非离子型表面活性剂与反应液的质量体积比为0.1％～0.6％。
3.根据权利要求1或2所述的制备L-高苯丙氨酸的方法，其特征在于重组E.coli BL21-pET/aspC细胞的固定化方法为将聚乙烯醇溶胀后，加入海藻酸钠，灭菌锅加热使其溶化，待聚乙烯醇冷却后，加入含有重组E.coliBL21-pET/aspC菌悬液与活性炭的混合物，搅拌均匀后滴加到交联剂溶液中，形成小球状，并在交联剂溶液中浸泡3～12h，洗涤后得到固定化细胞。
4.根据权利要求3所述的制备L-高苯丙氨酸的方法，其特征在于在固定化细胞的制备中各原料按质量比计，聚乙烯醇∶海藻酸钠∶活性炭＝8～12∶0.1～1∶5～20。
5.根据权利要求3所述的制备L-高苯丙氨酸的方法，其特征在于交联剂溶液为硼砂-氯化钙溶液、硼酸-氯化钙溶液或硼酸-硼砂-氯化钙溶液。
6.根据权利要求1或2所述的制备L-高苯丙氨酸的方法，其特征在于所述的非离子型表面活性剂为聚山梨酯-吐温系列表面活性剂。
全文摘要
本发明公开了一种用固定化重组E.coli BL21－pET/aspC细胞制备L－高苯丙氨酸的方法，将α－羰基苯丁酸与L－谷氨酸或L－天门冬氨酸混匀，调节pH至7.0～9.5，加入非离子型表面活性剂配成反应液，将固定化细胞加入反应液中，在惰性气体保护下30～50℃反应12～24h，得混悬液，调节pH过滤得L－高苯丙氨酸。本发明采用固定化的方式，提高了细胞内酶的稳定性，减少了细胞内辅酶的流失，简化了分离工艺。本发明制备的固定化细胞，机械强度好，韧性大，吸水膨胀性显著改善，易于操作，L－高苯丙氨酸产率提高显著。
文档编号C12P13/00GK101054570SQ20071002134
公开日2007年10月17日 申请日期2007年4月9日 优先权日2007年4月9日
发明者韦萍, 贾红华, 陈永生, 何冰芳, 欧阳平凯 申请人:南京工业大学