专利名称：重组人中期因子(rh-Midkine)的表达及其单克隆抗体的制备和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药领域，涉及人中期因子MK的原核表达、单克隆抗体的制备及其应用。
背景技术：
1988年日本学者Kadomatsu等在视黄酸诱导的小鼠胚胎肿瘤细胞系HM1细胞cDNA文库中发现 Midkine (MK)基因，中文称为中期因子。早期研究发现中期因子是一种对细胞的生长和分化起重要作 用的细胞因子。它能促进正常细胞的生长和分化，尤其可促进神经细胞的发育。近年对人肿瘤研究发现， MK具有诱导细胞转化、促有丝分裂、生血管、抗细胞凋亡和增强纤维蛋白溶解等与肿瘤发生与发展密切 相关的生物学功能，且在多种肿瘤组织中均有异常表达。
Konishi等对15例潜伏期前列腺肿瘤、16例PIN (膀胱上皮内瘤形成)及正常前列腺组织进行了免 疫组化分析研究显示，80%潜伏期肿瘤和75%PIN有MK高度表达，而正常组织不表达或仅微弱表达 MK。在结直肠癌的早期发生中，伴中度或重度发育异常的腺瘤，MK表达均明显高于轻度异常或正常组 织。
本实验室通过RT-PCR和免疫组化的方法，检测9例正常胃镜组织、37例胃肿瘤组织及其相应的配 对癌旁组织中MK的表达情况，对MK的表达进行定性、定量和定位分析，并进一步分析了 MK表达水平 与肿瘤临床病理之间的关系。RT—PCR定性分析表明，MK在胃癌组织中高表达(表达率为94.6%)，癌与 癌旁MK表达有显著差异，而且癌与正常组织有显著差异；RT-PCR定量分析结果证实了定性分析的结果， 而且发现MK的表达与肿瘤的临床分期及远处转移情况相关，而与肿瘤的组织分化、大小及淋巴结转移情 况无关；免疫组化定位分析发现，MK蛋白广泛存在于肿瘤细胞的细胞质，此外，细胞核和核仁也有MK聚 集，细胞外组织中腺泡处MK表达尤为明显。
国内外的研究结果均表明MK与肿瘤的发生与发展密切相关，MK的表达与肿瘤发展的进程及严重 程度也密切相关。而且由于MK在肿瘤形成的早期就有异常表达，MK检测将有可能应用于肿瘤的早期 诊断。
由于目前尚缺乏特异性强的MK单克隆抗体检测和靶向治疗肿瘤的MK单克隆抗体药物，临床上对 MK的免疫学检测都是用多克隆抗体，在检测过程中存在交叉反应、特异性低等不可避免的缺点。正是因 为没有特异性高的人MK单克隆抗体，所以对MK的检测特别是血液、尿液中MK的检测受到了相当大的限制。本发明得到了一株特异性高的单克隆抗体，证明本发明可以用于肿瘤组织、血液、尿液中MK 的特异性检测。并可以通过特异性结合MK而靶向作用于富含MK蛋白的肿瘤细胞。
发明内容
本发明的目的是提供一种特异性抗MK蛋白的单克隆抗体。
本发明的另一个目的是提供一种特异性检测肿瘤病人血液、尿液和组织的检测试剂盒。
本发明的另一个目的是提供一种能靶向作用于富含MK蛋白的肿瘤细胞的单克隆抗体偶联物。作为靶向 富含MK蛋白肿瘤细胞的治疗剂。
在本发明的第一个方面，提供了一种免疫球蛋白IgGl，其特征在于，它能特异性结合MK蛋白，所 述MK蛋白具有SEQIDNO: l所示的氨基酸序列。
在本发明的一个实例中，所述的免疫球蛋白是单克隆抗体。
在本发明的另一个实例中，所述的免疫球蛋白由小鼠杂交瘤细胞系9E10所产生，这种免疫球蛋白还 包括人源化改造的MK单克隆抗体。
本发明的第二个方面，提供了能检测肿瘤组织中的MK蛋白含量的试剂盒，它含有上述免疫球蛋白 或与这种免疫球蛋白形成的偶联物，其特征是该免疫球蛋白偶联物具有特异性结合MK蛋白的免疫球蛋 白或活性片段及可以将药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、荧光素、纳米材料分别偶联到免疫球蛋 白或活性片段上的偶联物。
本发明的第三方面，提供了上述免疫球蛋白或免疫球蛋白偶联物作为一种药物组合物，其特征是可靶 向作用于富含MK蛋白的肿瘤组织。
图l显示的是经过表达、纯化的30P-MK的蛋白电泳分析。表明30P-MK为可溶性分泌表达，而且 便于纯化。加样孔1指的是蛋白Marker，图左边标记的数字是对应条带的分子量；加样孔2是指未经过诱 导的总蛋白上样，加样孔3是经过低温诱导的总蛋白上样，可以明显看出在17KD左右有明显的蛋白表达； 加样孔4是指经过用1.2M洗脱液洗脱的蛋白电泳分析，可以看出还有一些少量杂蛋白；加样孔5是2M 洗脱液的蛋白电泳分析，得到完全纯化的蛋白。
图2显示纯化的30P-MK具有促进NIH3T3细胞增殖活性，所有浓度的30P-MK蛋白对NIH3T3细胞 有显著的促生长作用。而且当浓度在lug/ml以下时这种促生长作用呈浓度依赖性，但当MK浓度超过 lug/ml时这种促进作用不再增加。图3显示9E10抗体保存液的效价的检测，以訓ng30P-MK为抗原包被，采用间接ELISA法检测抗体
溶液的效价，其中抗体9E10保存液的效价为1/40960。其中A舰的值为9. 999时表示此时的吸光值超过此 仪器测量范围，O为阴性无关血清对照。
图4显示犯10抗体用丁-人组织MK的Western的检测，1泳道人胃粘膜；2泳道胃癌组织；3泳 道胃癌旁组织。在相同总蛋白的时候胃癌样品中MK表达明显高于胃正常组织和癌旁组织。结果表明抗 体9E10可以用于人组织中MK表达的Western-blotting实验。
图5显示9E10抗体用于人胃肿瘤组织和正常胃组织的免疫组化实验，图5.1和图5. 2为胃癌组织的 试验组和阴性对照组；图5. 3和图5. 4分别为胃癌旁组织的实验组与阴性对照组；图5. 5和图5. 6分别胃 正常胃组织和阴性对照组。从图上可以看出在细胞质、细胞间质中均出现特异的棕黄色染色，视为组织 MK表达阳性；在细胞核及核仁区有明显的棕黄染色，视为细胞核及核仁MK阳性，而且从图上可以看出癌 组织中的MK表达明显髙于癌旁组织和正常组织。实验结果说明单克隆抗体9E10可以用于人胃癌组织、 癌旁组织中MK蛋白表达的免疫组化分析实验。
具体实施例方式
本发明经多年研究发现，MK蛋白与肿瘤发展进程及严重程度密切相关，可以作为肿瘤细胞的早期敏 感性标志蛋白。
为了研究人肿瘤组织中MK的表达特性，发明人用pET30a(+)作为载体构建了重组表达人胃癌组织 MK基因的菌株pET30a-MK，获得了大肠杆菌表达的人MK重组蛋白，但该载体表达的MK蛋白以包 涵体的形式存在，这对蛋白的纯化和活性带来了很大的影响。因此，发明人用PCR的方法合成了 pel信 号肽，用以替换pET30a(+)载体中的Tag序列，将pET30a(+)载体进行改造，使克隆在pel信号肽后面的 MK基因的表达蛋白定位到胞质中，以分泌蛋白的形式表达，这将更有利于克隆基因的表达产物保持原有 的生物学活性，利于纯化。将此工程菌株命名为30P-MK。对菌株30p-MK进行扩大培养后，经1PTG诱 导表达产生的总的可溶蛋白用H印arin S印harose 4B亲和柱纯化，用Cell Counting Kit-8试剂盒 (DOjinDO公司)证明30p-MK蛋白具有促进NIH3T3细胞增殖的基本生物学活性。
用重组表达的30p-MK融合蛋白通过免疫Balb/c小鼠、取浆细胞与SP2/0细胞融合、杂交瘤的筛选 等经典单克隆抗体制备方法得到一株亲和力高、特异性好的单克隆抗体杂交瘤细胞株，进行两次亚克隆后 液氮冻存，此株单抗编号为9E10,其亚类为IgGl。
对9E10杂交瘤细胞扩大培养后，取培养上清用于人肿瘤样品中MK的免疫组化、Western的检测。
根据本发明其特征是构建的30p-MK为可溶性表达，且具有NIH3T3促进细胞增殖的活性。
根据本发明其特征是得到的9E10单克隆抗体可以用于肿瘤组织的免疫组化检测MK蛋白的表达实验。根据本发明其特征是得到的9E10单克隆抗体可以用于肿瘤组织的Western blotting检测MK蛋白
的表达实验。
本发明的9E10单克隆抗体或其片段可特异性结合肿瘤细胞的MK蛋白、肿瘤患者血液、尿液中的 MK蛋白。可用于靶向结合治疗，例如通过直接或间接地将MK单克隆抗体或其片段与化学治疗剂、纳 米材料或放疗剂相连从而使其能直接导向肿瘤细胞。
本发明包括具有MK单抗的相应氨基酸序列的单克隆抗体，具有MK单抗可变区链的单克隆抗体， 以及具有这些链的其它蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补 决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及人源化片段。只要该超变区与本发明的轻 链和重链的超变区相同或至少卯％同源性。如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括 药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、荧光标记物、纳米材料和其它诊断或治疗分子与MK单抗或 其片段结合形成的偶联物。本发明还包括与MK单抗或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。
本发明MK单抗重链和轻链序列可以用常规方法测定，本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括 具有免疫活性的抗体片段，如Fab片段、抗体重链、抗体轻链、遗传工程改造的单链Fv分7，或嵌合抗 体，如具有鼠抗体结合特异性但保留来自人的抗体部分的人源化抗体。
本发明提供了编码MK蛋白的cDNA,按本领域技术人员已知的常规方法制备模板，通过扩增而得到 有关序列。本发明还提供了上述免疫球蛋白或片段的DNA分子，这些DNA分子序列可以如上用常规技 术获得， 一旦获得了有关序列，按本领域技术人员已知的常规方法来获得有关序列，并通过常规方法通过 载体转化适当的宿主细胞以使其能够表达蛋白质。
本发明还提供了一种MK蛋白质的单克隆抗体检测试剂盒，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶联物， 或其活性片段，可用于肿瘤患者血液、尿液、肿瘤组织中MK蛋白浓度的检测，已完成37例胃癌组织及 其癌旁组织和9例正常胃组织的免疫组化和western blotting的检测。
本发明还提供了一种药物组合物，它含有上述免疫球蛋白或免疫偶联物，或其活性片段免疫偶联物， 这些药物组合物与给药方式相匹配，可以被制成针剂形式，溶液宜在无菌条件下制造，例如MK单克隆 抗体同金纳米壳球体结合后，在近红外光的激发下，热疗杀死肿瘤细胞。
本发明参照附图及以下实施例，进一步阐述本发明，这些实施例的目的仅用于说明本发明而不是为了 以任何方式限制本发明。
实施例l:重组瓶蛋白抗原的制备和活性的验证 1、引物设计
根据pdB信号肽序列，设计两条引物，在引物的两端分别引入W&I和Wm1酶切位点，用于 pET30a-MK菌株质粒的改造。pelB—5引物
5，tatgaaataectgctgccgacegctgctgctggtctgctgctcctcgctgcccagccggcgatggccc 3， pelB—3引物
5，catgggccatcgccggctgggcagcgaggagcagcag狄cagcagcagcggtcggcagcaggtatttca3， pelB信号肽序列
catatgaaatacctgctgccgaccgctgctgctggtctpctgctcctcgctgccccagccggccgatggccccatgg
2、对pET30a-MK载体的改造
将保存的pET30a-MK质粒、pel信号肽序列用和iVwI, 37°C， 3小时双酶切后，1%的凝胶电 泳30min后，对目的条带用胶回收试剂盒(BioFhix公司)胶回收后，用T4DNA连接酶16'C过夜连接， 转化DH5a感受态细胞，涂LB/Kanr液体培养基，到长出转化菌落时挑单菌落于LB/KaiT液体培养基37 'C培养后，抽提质粒进行PCR鉴定，经鉴定阳性的菌送博亚测序，测序正确的划平板，挑单菌落扩大培 养后分装，一70'C保存。改造后的菌株储存号为pET30P-MK。
3、 蛋白纯化挑阳性单菌落于LB/Kanr液体培养基扩大培养至OD值为0.6时加IPTG， 37°C、 4小时诱 导蛋白表达；离心收集菌体，用50mmol/LTris-Cl pH7. 5悬浮，加入溶菌酶至终浓度为l mg/ml，冰 上作用30分钟后，用超声波破碎菌体，最后离心收集上清。用H印arin S印harose 4B层析柱纯化。平衡 和洗涤均用50mmol/LTris-ClpH7. 5。然后分别用含O. 6M、 1. 2M、 2M的NaCl的50鹏ol / L Tris-Cl pH 7. 5 液梯度洗脱，洗脱液进行SDS-PAGE检测收集蛋白的纯度，取2M洗脱液透析后冻干保存。
4、 用Cell Counting Kit-8试剂盒(D0jinD0公司)验证MK蛋白对NIH3T3细胞的增值活性将处于对
数生长期的NIH3T3细胞用DMEM培养基调节成2Xl(f/ml的细胞悬液，100 ul /孔接种于96孔板，37'C 、 5 % C0滞养箱中培养4h。弃去培养液(DMEM+l(m小牛血清)。100ul /孔加入含不同浓度服的培养液(O. 25、 0.5、 1、 2 ug/tnl)，每一点浓度设6孔，并设不含MK的培养液作为对照组。24 h后去培养液，每孔加5 微升CCK-8试剂.继续37'C 、 5% C02培养4h，酶标仪检测A450值。测定结果用单因素方差分析统计不同 浓度MK重组蛋白对NIH3T3细胞生长活性的影响。
结果
(1) 构建的pET30P-MK载体的相关序列(见序列表)。
(2) 经过H印arin S印harose 4B层析柱纯化后，2M洗脱液中得到较纯的MK蛋白(附图l)。
(3) 30P-MK蛋白促进NIH3T3细胞增殖活性的验证醸标仪测定各组A450吸光度结果表明，与对照组相比， 所有浓度的30P-MK蛋白对NIH3T3细胞有显著的促生长作用。而且当浓度在lug/ml以下时这种促生长作用呈 浓度依赖性，但当MK浓度超过lug/ml时这种促进作用不再增加(附图2)。
制备的重组舰蛋白具有基本的天然MK的基本活性，满足MK用于细胞生物学、肿瘤、神经系统等研究的基本特征。
实施例2:抗MK单克隆抗体的的制备、亚类的鉴定
1、 免疫动物
取纯化冻干的20微克30P-MK重组蛋白用IOO微升无菌PBS缓沖液溶解，加入福氏完全佐剂100微升混匀， 对6周龄、雌性Balb/c小鼠进行皮下常规免疫；3周后取20微克MK重组蛋白用100微升无菌PBS溶解后，力口 入福氏不完全佐剂100微升混匀，腹腔注射；7天后用间接ELISA (100纳克30P-MK蛋白包被)测效价，效价 为1A0240, 30天后20微克/只MK蛋白用100微升无菌PBS溶解后，尾静脉注射追加免疫。
2、 细胞融合与阳性孔的筛选及其克隆
追加免疫3天后收集免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞以5: l的比例混合，在37X:水浴中，加入1毫升的50 %PEG-1000 (Sigma)融合90秒，然后分别依次在30秒内加入1亳升、3亳升、6毫升直至总体积到40毫升的 RPMI-1640 (Gibco)不完全培养基离心后加HAT选择性培养液悬浮，铺入10块96孔培养板中，37'C， 5 % C02选择培养杂交瘤细胞。15天后取上清进行ELISA筛选阳性克隆，得到6株阳性克隆，将筛选的阳性克 隆孔的杂交瘤细胞作有限稀释，进行2次亚克隆，冻存稳定的杂交瘤细胞株。
3、 单克隆抗体的腹水制备、纯化及其保存
取8周龄的Balb/c小鼠，腹腔注射降植烷(sigma) 0. 5毫升，10天后腹腔注射lxl(/个杂交瘤细胞， 于10—U天后收集腹水，4'C静置过夜，3000rpm离心10inin，收集上清即为单抗腹水。在腹水中加入2倍体 积的0.06mol/L PH5. O醋酸缓冲液稀释腹水，调PH至4.8，按每毫升稀释液加l微升辛酸的比例，于室温搅 拌下逐滴加入辛酸，4X:静置2h， 15000g离心30iDin,弃沉淀，调节PH至7.2，加入终浓度为45%的饱和硫 酸氨，4'C搅拌30min后，静置lh, 10000g， 10min离心，沉淀用等体积的无菌PBS融解后，用100倍体积的 PBS透析5次，10000g离心30迈in,测定蛋白含量后，分装，加等体积甘油-20'C冻存备用。
4、 效价测定和单抗亚型的鉴定
抗体保存液的效价以100ng30PMK为抗原包被，采用间接ELISA法检测抗体溶液的效价，其中抗体9E10 保存液的效价为1/40960 (见附图3)。用鼠mAb亚型鉴定试剂盒I咖unoType TMKit对犯10抗体进行亚型鉴 定为IgGl。
实施例3:人胃癌组织中MK检测1、 Western blotting:①、取正常的胃组织(l泳道)、胃癌患者的癌组织(2泳道)及相应的癌旁组 织(3泳道)加相应体积PBS研磨后，分别取100ug总蛋白跑15乂的SDS-PAGE蛋白凝胶电泳；②、IOOV, 2h, 转硝酸纤维素膜；5先脱脂奶粉室温封闭2h;③、用9E10 (1: 1000)单克隆抗体孵育两个小时；TBST洗4 次(10分钟/次)后； 、加羊抗鼠IgG-朋P(博士德，1/1000稀释)，室温孵育1.5小时；TBST洗4次(10 分钟/次)后。 、用EZ-ECL试剂盒(Biological Industries)来验证9E10单抗的特异性。
2、 免疫组化①、载玻片经2%盐酸酒精处理后，包被多聚赖氨酸；将37例胃癌组织及其癌旁组织
和9例正常胃组织经OCT包埋后，做5微米冰冻切片，切片室温风扇吹干。②、用10%的中性缓冲福尔马 林液固定30分钟；蒸馏水洗三次，每次5min;③、用30%112021份+纯甲醇50份混合溶液，室温浸泡30分 钟，用来灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次，每次5min; 、滴加5XBSA封闭液，室温60min,鬼去 多余液体。⑤、滴加9E10单抗(PBS梯度稀释选择得到合适的工作稀释度为1: 1280),以PBS作为阴性对 照，湿盒中37'C lh;用PBS (pH=7.4)洗SminX3次。⑥、滴加羊抗鼠IgG-冊P(博士德，1/1000稀释)， 37'C 60min， PBS (pH=7.4)洗3次，每次3分钟。⑦、用DAB显色试剂盒(博士德)显色，显微镜下控制 显色时间，3—5min，用水冲洗终止显色。⑧、常规苏木精复染1一2分钟后，自来水冲洗残余染液后，1 %盐酸/75%酒精混合液分色，1%氨水返蓝后镜下观察。⑨、蒸馏水洗后，常规梯度酒精脱水、二甲苯处 理后，封片，显微镜观察，统计分析。
结果
1、 蛋白印记实验在胃正常组织、胃癌组织和胃癌旁组织中都有特异的蛋白印记条带。且从条带上 分析得知肿瘤组织中的MK表达明显较正常组织和癌旁组织中髙。实验结果说明单克隆抗体9E10完全可以 用于人胃癌组织、癌旁组织中服蛋白的Western实验分析(见附图4)。
2、 免疫组化实验在细胞质、细胞间质中均出现特异的棕黄色染色，视为组织MK表达阳性；在细胞 核及核仁区有明显的棕黄染色，视为细胞核及核仁MK阳性。在37例胃癌组织及其相应的癌旁组织和9例正 常组织中，检测出有30例胃癌组织、26例癌旁组织和1例正常组织有不通程度的MK表达阳性。实验结果说 明单克隆抗体犯10可以用于人胃癌组织、癌旁组织中MK蛋白表达的免疫组化分析实验(见附图5)。
实施例4: MK单克隆抗体与纳米材料结合形成免疫偶联物靶向作用于肿瘤细胞
用HEPES缓冲液(PH=7.4)把金纳米壳球体稀释到OD. 53。为0. 8:把抗体9E10用HEPES缓冲液稀释到适 当浓度；然后把两种溶液按比例混合后，室温放置20min，加入0.5ml、 1%的聚乙二醇(防止形成聚合体) 室温放置5分钟后，离心(6000 rpm)，沉淀用PBS稀释后4匸保存。在BALB/c裸鼠前肢腋皮下接种5X106 个BGC细胞，两周后待肿瘤直径约1.5cm时，随机分为对照组(注射100ul生理盐水)、单抗对照组(100ul 的100ng/ml)、抗体-金纳米壳球体复合物组(100ul的2.4X10"个金纳米粒子/inl)，尾静脉注射，注射 后6小时后，肿瘤处皮肤用聚乙烯乙二醇擦试以便光可以最大渗入组织，用近红外光照射激发3分钟，连续 10天。最后一次治疗后处死小鼠，量肿瘤的直径，统计分析。其中抗体一金纳米偶连物组的肿瘤平均直径从刚开始的l. 55Cfi減少，jU 13CM;单抗对照组的肿瘤平均 直径从原来的l. 49CM增加到5. 6CM;而生理盐水对照组的肿瘤平均直径由l. 53CM增加到7. 25CM。
此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域的技术人员可以对本发明作各种改动或修 改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限范围。
权利要求
1、一种重组质粒载体，其特征是该载体为pET 30a/midkine，它含有适合于在原核细胞宿主中可溶性表达的人中期因子(midkine，MK)，具有如下所示的核苷酸序列CATATGGGCCATCGCCGGCTGGGCAGCGAGGAGCAGCAGACCAGCAGCAGCGGTCGGCAGCAGGTATTTCCATGGAAAAAGAAAGATAAGGTGAAGAAGGGCGGCCCGGGGAGCGAGTGCGCTGAGTGGGCCTGGGGGCCCTGCACCCCCAGCAGCAAGGATTGCGGCGTGGGTTTCCGCGAGGGCACCTGCGGGGCCCAGACCCAGCGCATCCGGTGCAGGGTGCCCTGCAACTGGAAGAAGGAGTTTGGAGCCGACTGCAAGTACAAGTTTGAGAACTGGGGTGCGTGTGATGGGGGCACAGGCACCAAAGTCCGCCAAGGCACCCTGAAGAAGGCGCGCTACAATGCTCAGTGCCAGGAGACCATCCGCGTCACCAAGCCCTGCACCCCCAAGACCAAAGCAAAGGCCAAAGCCAAGAAAGGGAAGGGAAAGGACCTCGAG
2. 根据权利要求1所述的载体，其特征是该载体转化的是可以表达MK基因的大肠杆菌。
3. 根据权利要求l，其特征是在大肠杆菌中表达的具有生物活性的融合重组蛋白30p—MK，具有促进 NIH3T3细胞的增殖活性。
4. 权利要求3所述蛋白应用于制备一种抗人中期因子的单克隆抗体，其特征在于是用权利要求1表 达的蛋白免疫Balb/c小鼠取脾细胞与SP2/0细胞融合得到杂交瘤细胞后制备而得，亚类为IgGl。
5. —种免疫偶联物，其特征在于它含有特异性结合MK蛋白的免疫球蛋白和可偶联的部分药物、 毒素、细胞因子、放射性核素、酶、荧光素、纳米材料。
6. —种检测血液、尿液和肿瘤组织中MK的肿瘤检测试剂盒，其特征在于，它含有权利要求4所述的单 克隆抗体或权利5所述的免疫偶联物。
7. —种药物组合物，其特征在于，它含有权利要求4所述的单克隆抗体或权利要求5所述的免疫偶联物， 可靶向作用于富含MK蛋白的肿瘤细胞。
全文摘要
本发明属于生物医药领域，公开了一种重组人中期因子(rh-Midkine)的表达及其单克隆抗体的制备和应用。特征是通过大肠杆菌进行人中期因子(Midkine，MK)的原核表达，得到的重组蛋白30P-MK具有促进细胞增殖的生物活性，为MK在肿瘤、细胞生物学和神经系统等方面的研究提供基础；30P-MK蛋白纯化后免疫Balb/c小鼠，取脾细胞与SP2/0细胞融合、筛选得到抗人MK单克隆抗体杂交瘤，所分泌的单抗为IgG1，通过对人肿瘤组织样品中中期因子Western-blotting和免疫组化的检测实验验证表明得到的单抗特异性强，背景低，可发展成为诊断试剂盒用于临床和实验室检测肿瘤组织和血清中MK的表达水平，为通过MK单抗靶向治疗肿瘤奠定了基础。
文档编号C12N15/12GK101294164SQ20071002165
公开日2008年10月29日 申请日期2007年4月23日 优先权日2007年4月23日
发明者侯亚义, 会 王, 王庆苓, 浩 谢, 赵树立, 黄亚红 申请人:南京大学