专利名称：一种基因定向克隆用tc载体及其制备和使用方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，具体地说是一种便于基因定向克隆的基因工程载体TC载体及其制备以及基因定向克隆的方法。
背景技术：
目前定向克隆技术主要有以下几种方法(I)通过一种限制性核酸内切酶消化载体，也用这种酶(或同尾酶)消化外源基因片段，然后将载体与外源基因片段通过T4 DNA连接酶催化连接，重组克隆包含方向不定(两种方向)的外源基因片段。借助于限制性核酸内切酶消化或其他方法从无定向克隆中筛选外源片段方向符合目的要求的克隆。这种方法缺点是载体两个末端自我连接严重，后期筛选过程工作量大，并且存在较大不确定性，很可 能会得不到所需方向克隆；(2)通过两种不同的限制性核酸内切酶消化载体，也用这两种酶消化外源基因片段，然后将载体与外源基因片段通过T4 DNA连接酶催化连接，重组载体即为定向克隆。该方法缺点是步骤繁琐，工作量大，有时会很难找到合适的限性核酸内切酶位点而确定实验方案；(3)在(I)的基础上，增加外源基因片段与载体之间连接处的特殊序列，使正反向克隆中某向克隆具有或不具有某稀有限制性核酸内切酶的识别、切割位点，因而可以借助于该稀有限制性核酸内切酶筛选方向克隆的筛选。这种改进只是在一定程度上减少了( I)方法后期筛选工作量，而对其他缺点(存在较大不确定性，很可能会得不到所需方向克隆)无任何改进。总之，现有技术存在步骤繁琐、结果不确定或者难于制定实验方案等缺点。
发明内容
本发明提出一种基因定向克隆的载体(可以为质粒、噬菌体、病毒及其衍生载体等)及其制备和使用方法，从而大大方便外源基因片段定向克隆于目标载体(如细菌、酵母、植物以及动物表达载体等)，克服了现有技术存在的缺陷。本发明先将目的载体制备成具有“载体的两个末端的3’端各突出一个碱基，其中一个3’端突出碱基为C碱基，另一个3’端突出碱基为T碱基”特征的TC载体，然后只要把目的基因按照本发明所提出的PCR方法进行扩增，即可将该扩增产物直接定向连接于TC载体。对于从通用目的载体出发进行的重组载体的构建工作而言，该方法由于减少了操作步骤和实验试剂的消耗，使效率得到提高的同时，实验成本也大大降低。本发明所提供的基因定向克隆用的TC载体是
在该线状载体的两个末端的3’端各突出一个碱基，其中一个3’端突出碱基为C碱基，另一个3’端突出碱基为T碱基(称之为“TC载体”)。本发明所提供的TC载体的制备方法，它包括以下步骤
a、填充序列的引物设计
选择一段序列已知DNA序列，该DNA片段长度范围100 2000bp (该DNA频段用作目标载体改造的“填充序列”，所存在于的载体称为供体载体)，针对该序列设计一对PCR扩增引物，该引物一方面与供体载体模板具有特异结合的序列，同时各有一个I I或各有一个EamW^1、Mbo W、Hph1.Bmr l.Hpy AV和必￠/ I中的一种的识别位点；由此得到引物I和引物2 ;
b、在引物I和引物2引发下，以供体载体作DNA模板进行PCR扩增，得到PCR产物，即填充序列；
C、将该填充序列克隆到目标载体，形成前TC载体(TC载体的前体)。由于引物I和引物2两端的内切酶识别位点的简并碱基经过选择，使之被克隆于目标载体形成前TC载体后，用与a)相应的I或者fe 1105 I,Mbo 11,Hph I,Bmr I,Hpy AV和必￠/ I中的一种酶切该前TC载体，所得到的载体片段即为符合TC载体特征的载体分子两个末端的3’端各突出一个碱基，其中一个3’端突出碱基为C碱基，另一个3’端突出碱基为T碱基。—种基因定向克隆用TC载体的制备方法，其特征在于它包括以下步骤
a、填充序列的引物设计
选择一段序列已知DNA片段，该DNA片段长度范围100 2000bp (该DNA片段用作改造目标载体的“填充序列”，该DNA片段序列所存在的载体称为供体载体。);针对该序列设计一对PCR扩增引物，该引物一方面与作为模板的供体载体具有特异结合的序列，同时各有一个 Xcm I 或各有一个万<3 11051、Mbo W、Hph1、Bmr1、HpyI 中的一种内切
酶的识别位点；由此得到引物I和引物2 ；
b、在引物I和引物2引发下，以供体载体作DNA模板进行PCR扩增，得到PCR产物，即填充序列；
C、将该填充序列克隆到目标载体，从而形成前TC载体，即TC载体的前体分子；
通过对引物I和引物2两端的I或fe 11051、Mbo W、Hph1、Bmr1、处f AV和Ahd I中的一种的识别位点的简并碱基的选择，使得前TC载体经Zos I或feM105 I, MboU、Hph I,Bmr1、Hpy AV和处c/ I中的一种内切酶酶切后，回收载体片段即可得到一个线性载体，其两个末端的3’端各突出一个碱基，其中一个3’端突出碱基为C碱基，另一个3’端突出碱基为T碱基，即权利要求1所述TC载体。本发明所提供的基于上述TC载体进行的定向克隆基因的方法，它包括以下步骤
a、填充序列的引物设计
选择一段序列已知DNA片段，该DNA片段长度范围100 2000bp，用作改造目标载体的“填充序列”。针对该序列设计一对引物，该引物一方面与目标载体的DNA模板具有特异结合的构造，同时两条引物两5’端各有一个Zos I或各有一个及 1105 UMo II,Hph1、Bmr1、Hpy AV和AM I中的一种的识别位点；由此得到引物I和引物2 ；
b、用引物I和引物2对供体载体进行扩增，得到PCR产物充当填充序列；
C、将该填充序列克隆到目标载体，形成前TC载体，即TC载体的前体分子；通过对引物
I和引物2 两端的 Jc I 或万<3 11051、Mbo II > Hph1、Bmr1、HpyI 中的一种
的识别位点的简并碱基的选择，使得前TC载体经Zos I或fe 11051、Mbo U、Hph I,Bmr
I,Hpy AV和AM I中的一种内切酶酶切后，再回收载体片段即可得到一个线性载体，其两个末端的3’端各突出一个碱基，其中一个3’端突出碱基为C碱基，另一个3’端突出碱基为T碱基，即权利要求1所述TC载体；
d、设计待定向克隆基因的一对特异PCR引物，该引物对中一条引物5’端为C碱基，且另一条引物5’端为G或A或T碱基(正向还是反向引物5’端加C将决定DNA序列定向克隆的方向)；
e、在d步所设计的引物引发下，用Taq酶(或其他与Taq酶具有相同末端转移酶活性的耐热DNA聚合酶)PCR扩增待克隆基因。得到的扩增产物中，将有一个3’端突出一个A碱基、另一个3’端突出一个G碱基的产物，恰与上述TC载体两3’末端匹配。将该扩增产物和TC载体连接即可得到克隆方向确定的重组DNA分子。
图1是本发明基因定向克隆用TC载体的结构示意图。图2是前TC载体结构示意图。
图3是本发明原理图。
图4是本发明具体实施方式
中的原核表达载体pET17b的质粒图谱。图5是本发明具体实施方式
中的细胞表达载体pcDNA6/V5_His A质粒图谱。图6是本发明具体实施方式
中的植物表达载体PCAMBIA1391质粒图谱。图7是本发明具体实施方式
中定向克隆质粒的鉴定图谱。以下结合附图对本发明做进一步的说明。一、TC载体的制备
① 填充序列的引物设计
选择一段已知DNA序列(长度范围100 2000bp，此处用作目标载体改造用的“填充序列”的模板，所存在于的载体称为供体载体)，针对该序列设计一对PCR扩增引物，该引物一方面与供体载体模板具有特异结合的序列，同时5’各有一个Zos I或各有一个及 11051、Mbo W、Hph I,Bmr I,Hpy AV和I中的一种的识别位点；由此得到引物I和引物2。用该对引物PCR扩增供体载体，将所得到的PCR产物克隆于目标载体形成TC载体的前体(即前 TC 载体)。t^Xcm I 或者及迎11051、Mbo U、Hph !,Bmr1、Hpy kN 琳 AhdI中的一种内切酶酶切，通过对识别碱基序列中的简并的选择，使酶切后得到的载体片段符合本发明所述TC载体特征的3’端突出碱基该线状TC载体两个末端的3’端各突出一个碱基，其中一个3’端突出碱基为C碱基，另一个3’端突出碱基为T碱基。为方便克隆，可在引物5’端添加内切酶识别位点及其末端酶切保护碱基，这对引物能扩增出的DNA序列要求一般不小于lOObp、不大于2000bp。上述引物1、引物2的设计可按本领域通用方法进行。引物中Zos I (或feM105UMbo 11,Hph I,Bmr I,Hpy AV和灿c/ I中的一种)识别位点的简并碱基的选择可参考下面例子(以Xos I为例)
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I为Xcm I识别切割位点的一般形式，2、3针对简并碱基进行了碱基选择，使之酶切之后产生特殊的3’端突出碱基(序列中，“N”代表A、T、G、C碱基中的任意一种，“ I ”代表酶切断磷酸二酯键处)，非酶切突出位置简并碱基可选择任意碱基。②将填充序列克隆到目标载体
用经上述设计的引物1、引物2扩增出填充序列，之后利用通常的克隆技术克隆到目标载体。具体涉及的实验技术有=PCR扩增、限制内切酶酶切、连接、DNA凝胶电泳产物回收及细菌转化方法等(可参照《分子克隆实验指南》分子生物学实验手册进行)。以下给出部分可参考的实验程序
(A)PCR反应
权利要求
1.一种基因定向克隆用TC载体，其特征在于，该载体两个末端的3’端各突出一个碱基，其中一个3’端突出碱基为C碱基，另一个3’端突出碱基为T碱基。
2.一种基因定向克隆用TC载体的制备方法，其特征在于它包括以下步骤 a、填充序列的引物设计 选择一段序列已知DNA片段，该DNA片段长度范围100 2000bp ;针对该序列设计一对PCR扩增引物，该引物一方面与作为模板的供体载体具有特异结合的序列，同时各有一YXcm I 或各有一个1051、Mbo W、Hph !,Bmr1、Hpy AV 和必i/ I 中的一种内切酶的识别位点；由此得到引物I和引物2 ； b、在引物I和引物2引发下，以供体载体作DNA模板进行PCR扩增，得到PCR产物，即填充序列； C、将该填充序列克隆到目标载体，从而形成前TC载体，即TC载体的前体分子； 通过对引物I和引物2两端的Zc I或fe 11051、Mbo W、Hph1、Bmr1、处f AV和Ahd I中的一种的识别位点的简并碱基的选择，使得前TC载体经Zos I或feM105 !,MboU、Hph I,Bmr1、Hpy AV和处c/ I中的一种内切酶酶切后，回收载体片段即可得到一个线性载体，其两个末端的3’端各突出一个碱基，其中一个3’端突出碱基为C碱基，另一个3’端突出碱基为T碱基，即权利要求1所述TC载体。
3.一种基于TC载体定向克隆基因的方法，其特征在于它包括以下步骤 a、填充序列的引物设计 选择一段序列已知DNA片段，该DNA片段长度范围100 2000bp，用作改造目标载体的“填充序列”，针对该序列设计一对引物，该引物一方面与供体载体的DNA模板具有特异结合的构造，同时两条引物两5’端各有一今Xcm I或各有一个万<3 11051、Mbo W、Hph1、Binr1、Hpy AV和必i/ I中的一种的识别位点；由此得到引物I和引物2 ; b、用引物I和引物2对供体载体进行扩增，得到的PCR产物充当填充序列； C、将该填充序列克隆到目标载体，形成前TC载体，即TC载体的前体分子；通过对引物I和引物 2 两端的 Jc I 或万<3 11051、Mbo II> Hph1、Bmr1、Hpy AV 和 JAtZ I 中的一种的识别位点的简并碱基的选择，使得前TC载体经Zos I或fe 11051、Mbo U、Hph I,BmrI,Hpy AV和AM I中的一种内切酶酶切后，回收载体片段即可得到一个线性载体，其两个末端的3’端各突出一个碱基，其中一个3’端突出碱基为C碱基，另一个3’端突出碱基为T碱基，即符合权利要求1特征的TC载体； d、设计待定向克隆基因的一对特异PCR引物，该引物对中一条引物5’端为C碱基，且另一条引物5’端为G或A或T喊基； e、在d步所设计的引物引发下，用Taq酶(或其他与Taq酶具有类似末端转移酶活性的DNA聚合酶)PCR扩增待克隆基因得到扩增产物，其中一个3’端突出一个A碱基、另一个3’端突出一个G碱基的PCR扩增产物，恰与上述TC载体两3’末端匹配，将该扩增产物和TC载体通过T4 DNA连接酶催化连接即可得到克隆方向确定的重组DNA分子。
全文摘要
本发明公开了一种基因定向克隆用TC载体及其制备和使用方法，该载体两个末端的3’端各突出一个碱基，其中一个3’端突出碱基为C碱基，另一个3’端突出碱基为T碱基。其制备方法包括a、填充序列的引物设计，由此得到引物1和引物2；b、在引物1和引物2引发下，以供体载体作DNA模板进行PCR扩增，得到PCR产物，即填充序列；c、将该填充序列克隆到目标载体，从而形成前TC载体；d、内切酶酶切该前TC载体并回收载体片段就可得到TC载体。其使用方法包括a、制备TC载体；b、设计一对待定向克隆基因的PCR引物；c、用这对引物和Taq酶扩增待定向克隆基因并将产物连接于TC载体即可获得定向克隆重组载体。本发明提高了从通用目的载体出发进行的重组载体的构建的工作效率，可减低实验成本。
文档编号C12N15/64GK102994535SQ201210436709
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月6日 优先权日2012年11月6日
发明者李继刚, 李秀敏, 杨忠祥, 夏洁函 申请人:河北大学