专利名称：一种海参体壁总dna提取方法
技术领域：
本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种海参体壁总DNA提取方法。
背景技术：
海参体壁中含有丰富的胶原、黏多糖和多种微量元素，具有较高的营养价值和药用价值。在我国被认为是传统的美味和滋补品。全球可供食的海参种类约50多种，作为名贵的海产品，市场上海参通常加工为干品或冻品出售，海参经过多道工序加工成干品后，很难从外部形体上分辨出其种类。目前在市面上销售的海参产品，大多根据其颜色和产地来命名贴标，如“美国红参”、“非洲海参”等，缺乏规范的商品命名，海参市场贴标混乱。
根据海参线粒体DNA片段如COI和16S rDNA序列,可以从分子水平鉴定海参种类和开发出简便的种类鉴别方法。由于海参含有丰富的黏多糖和蛋白质，造成DNA的提取比较困难，尤其是高质量DNA的获得，DNA中多糖等杂质过多会影响后续PCR扩增等分子生物学实验，进而影响了海参种类的分子鉴定。另外，干海参经过加工处理，其核基因组DNA已降解，与核基因组DNA相比，线粒体DNA结构简单、稳定，拷贝数多，可以用于海参种类的分子鉴定。
发明内容
本发明的目的是为解决现有技术中存在的上述问题，提供一种能对海参酒精保存样品和干品均适用的海参体壁总DNA提取方法，该方法提取的DNA纯度高，避免了粘多糖、胶原蛋白和色素等影响，能满足后续PCR等分子生物学实验的要求。本发明的海参体壁总DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤(a)样品预处理第一步是将海参的酒精保存样品用PBS溶液置换出酒精，或将海参干品用PBS溶液浸发，将第一步处理好的样品在高盐缓冲液中剪碎样品，然后固液分离，弃液相取剪碎的固体样品作为预处理后的样品；所述的高盐缓冲液为200mmol/LTris-HCl, 50mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, O. 2% β -巯基乙醇，余量为水，pH 8. O ；(b)样品的裂解将预处理后的样品加入到裂解液中，再加入适量的蛋白酶K降解蛋白质，65 消化3(T60min,每隔5 IOmin混勻一次,待样品消化彻底后，12000g/min离心2 3min，上层形成一层悬浮粘稠物，取下层澄清的样品消化液；所述的裂解液为IOOmmol/LTris-HCl, 20mmol/L EDTA,1. 4mol/L NaCl,2%CTAB, 1%PVP, 1%SDS,0. 2%β -巯基乙醇，余量为水；(C)样品消化液用氯仿异戊醇抽提，含有DNA的水相加入等体积的异丙醇高盐溶液，-20°C下放置20min，12000-13000g/min离心12_15min，弃上清，取DNA沉淀；所述的异丙醇高盐溶液是由异丙醇和5mol/L NaCl按体积比3 1混合而成；(d)用体积分数70%乙醇水溶液的洗涤DNA沉淀，然后12000-13000g/min离心3-5min,弃上清；重复操作2_3次，将DNA沉淀干燥，再用O.1 X TE溶液充分溶解保存。
所述的步骤(a)的将海参的酒精保存样品用PBS溶液置换出酒精优选为取海参的酒精保存样品在PBS溶液中放置3-6min，期间更换PBS溶液2次；所述的步骤(a)的将海参干品用PBS溶液浸发是将海参干品在PBS溶液放置30-60min，期间更换PBS溶液2次；所述的步骤(a)的固液分离是在10000-12000g/min离心l_2min,弃上清液；重复操作2次。所述的步骤(C)的样品消化液用氯仿异戊醇抽提优选为样品消化液中加入等体积的体积比为24:1的氯仿异戍醇中，充分混勻，静止l_2min, 12000-13000g/min离心12-15min，取上清液；重复操作2_3次。本发明中的PBS溶液是现有技术中的产品，其为137mmol/L NaCl,2. 7mmol/L KCl,IOmmoI/L Na2HP04，2mmol/L KH2PO4,余量为水，ρΗ7· 2。本发明与现有技术相比，具有如下优点(I)使用PBS置换出酒精保存样品中酒精和浸发干海参样品，可提高提取DNA的获·
得量；(2)在高盐缓冲液中剪碎组织样品，可除去样品中胞外多糖和色素等，降低它们对提取DNA的影响；(3)样品裂解液为添加SDS的CTAB抽提缓冲液，即可快速的裂解组织，又有利于去除多糖；(4)异丙醇高盐溶液沉淀DNA，高浓度盐存在将使大量多糖存在在溶液中，消除多糖对DNA质量的影响；因此利用本发明的海参体壁总DNA提取方法能够高质量的提取到海参DNA，其DNA纯度高，避免了粘多糖、胶原蛋白和色素等影响，能满足后续PCR等分子生物学实验的要求。
图1是本发明的实施例1和3提取并纯化出的海参体壁总DNA琼脂糖电泳图。M :DNA Marker(DL15000), 1-4 :花刺参酒精保存样品提取的DNA，5_8 :墨西哥刺参干品提取的DNA。图2是以本发明的实施例1和3提取DNA为模板COI扩增产物的琼脂糖电泳图。M DNA Marker (DL2000)，1-4 :花刺参酒精保存样品提取DNA为模板的COI扩增产物，5-8 墨西哥刺参干品提取DNA为模板的COI扩增产物。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1:(I)样品预处理材料为花刺参(Stichopus monotuberculatus)酒精保存样品，用剪刀取样品40mg，放入 L 5ml 离心管中，加入 800μ I PBS 溶液(137mmol/L NaCl, 2. 7mmol/L KCl，IOmmoI/LNa2HPO4, 2mmol/L KH2PO4,余量为水，pH 7. 2)，放置 3min，期间更换 PBS 溶液 2 次，得到处理后的样品。随后剪取处理后的样品60mg，放入1. 5ml离心管中，加入1000 μ I高盐缓冲液中(200mmol/L Tris-HCl, 50mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 0. 2%β-巯基乙醇，余量为水，pH 8. O，％指的是质量体积分数)，充分剪碎样品，12000g/min离心lmin，弃上清液；重复操作2次，取沉淀，得到的沉淀即为预处理后的样品。(2)样品裂解样品裂解液为添加了 SDS的CTAB抽提缓冲液(100mmol/L Tris-HCl, 20mmol/LEDTA,1. 4mol/L NaCl，2%CTAB，1%PVP, 1%SDS,0. 2%β -巯基乙醇，余量为水，% 指的是质量体积分数)，加热至65°C，混匀；向预处理后的样品中加入800 μ I预热的裂解液和20 μ I20mg/ml蛋白酶K，放置在65°C金属浴上，消化40min，每5min混匀一次。待样品消化彻底后，12000g/min离心2min，上层将形成一层悬浮粘稠物，用移液器吸取下层澄清的样品消化液，转入新的离心管中。(3)氯仿异戊醇抽提向样品消化液中加入等体积的氯仿异戊醇(体积比24:1 )，充分混匀，静止lmin，12000g/min离心15min，用粗口枪头移液器轻吸上清，转入新的离心管；重复操作2次，得上清液。(4)异丙醇高盐沉淀DNA向上清液中加入等体积异丙醇高盐溶液(异丙醇和5mol/L NaCl按体积比3 1混合而成)，混勻，_20°C下放置20min ;12000g/min离心15min,弃上清,底部沉淀有DNA。(5)洗盐和溶解DNA向沉淀有DNA的离心管中加入800 μ I体积分数70%的乙醇水溶液，洗涤DNA沉淀，12000g/min离心3min，弃上清；重复操作2次；取DNA沉淀，在42°C金属浴上，晾干DNA，待干燥后加入100 μ I O. 1XTE溶解DNA，-20°C保存。本实施例提取并纯化出的花刺参酒精保存样品体壁总DNA的琼脂糖电泳如图1(1-4道)所示，DNA呈主带，质量好；以本实施例提取DNA为模板，COI扩增产物的琼脂糖电泳如图2 (1-4道)所示，COI带型清晰，稳定，说明此DNA能满足后续PCR等分子生物学实 验的要求。实施例2 (I)样品预处理材料为花刺参(Stichopus monotuberculatus)酒精保存样品，用剪刀取样品40mg，放入1. 5ml 离心管中，加入 1000μ I PBS 溶液(137mmol/L NaCl, 2. 7mmol/L KCl，IOmmoI/LNa2HPO4, 2mmol/L KH2PO4,余量为水，pH7. 2)，放置 6min，期间更换 PBS 溶液 2 次，得到处理后的样品。随后剪取处理后的样品60mg，放入1. 5ml离心管中，加入1000 μ I高盐缓冲液中(200mmol/L Tris-HCl, 50mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 0. 2%β-巯基乙醇，余量为水，pH 8. 0)，充分剪碎样品，10000g/min离心2min，弃上清液；重复操作2次，得到的沉淀即为预处理后的样品。(2)样品裂解样品裂解液为添加了 SDS的CTAB抽提缓冲液(100mmol/L Tris-HCl, 20mmol/LEDTA,1. 4mol/L NaCl，2%CTAB，1%PVP, 1%SDS, 0. 2% β -巯基乙醇，余量为水)，加热至 65°C，混匀；向预处理后的样品中加入800 μ I预热的裂解液和20 μ I 20mg/ml蛋白酶K，放置在65°C金属浴上,消化30min,每IOmin混勻一次。待样品消化彻底后，12000g/min离心3min,上层将形成一层悬浮粘稠物，用移液器吸取下层澄清的样品消化液，转入新的离心管中。
(3)氯仿异戊醇抽提向样品消化液中加入等体积的氯仿异戊醇(体积比24:1 )，充分混匀，静止2min，13000g/min离心12min，用粗口枪头移液器轻吸上清，转入新的离心管；重复操作2次，得上清液。(4)异丙醇高盐沉淀DNA向上清液中加入等体积异丙醇高盐溶液(异丙醇和5mol/L NaCl按体积比3 1混合而成)，混勻，_20°C下放置20min ;13000g/min离心12min,弃上清,底部沉淀有DNA。(5)洗盐和溶解DNA 向沉淀有DNA的离心管中加入800 μ I体积分数70%的乙醇水溶液，洗涤DNA沉淀，13000g/min离心3min，弃上清；重复操作3次；取DNA沉淀，在42°C金属浴上，晾干DNA，待干燥后加入100 μ I O. 1XTE溶解DNA，-20°C保存。由此获得花刺参酒精保存样品体壁总DNA，该DNA质量好，以本实施例提取DNA为模板，COI扩增产物的琼脂糖电泳显示COI带型清晰，稳定，说明此DNA能满足后续PCR等分子生物学实验的要求。实施例3 (I)样品预处理材料为墨西哥刺参(Isostichopus fucus)干品，用剪刀取体壁组织8mg,放入1. 5ml 离心管中，加入 800 μ I PBS 溶液(137mmol/L NaCl, 2. 7mmol/L KCl, 10mmoI /L Na2HPO4, 2mmol/L KH2PO4, ρΗ7· 2)，放置60min,期间更换PBS溶液2次，得到浸发的样品。剪取60mg浸发的样品，放入1. 5ml离心管中，加入1000 μ I高盐缓冲液中(200mmol/LTris-HCl, 50mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 0. 2%β -巯基乙醇，余量为水，pH 8.0)，充分剪碎样品，12000g/min离心lmin，弃上清液；重复操作2次，得到的沉淀即为预处理后的样品。(2)样品裂解样品裂解液为添加SDS的CTAB抽提缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，20mmol/LEDTA,1. 4mol/L NaCl，2%CTAB，1%PVP, 1%SDS,0. 2%β -巯基乙醇，余量为水)，加热至 65。。，混匀；向预处理后的样品中加入800 μ I预热的裂解液和20 μ I 20mg/ml蛋白酶K，放置在65°C金属浴上,消化50min,每5min混勻一次。待样品消化彻底后，12000g/min离心2min,上层将形成一层悬浮粘稠物，用移液器吸取下层澄清的样品消化液，转入新的1. 5ml离心管中。(3)氯仿异戊醇抽提向样品消化液中加入等体积的氯仿异戊醇(体积比24:1 )，充分混匀，静止lmin，13000g/min离心15min，用粗口枪头移液器轻吸上清，转入新的离心管；重复操作3次，得上清液。(4)异丙醇高盐沉淀DNA向上清液中加入等体积异丙醇高盐溶液(异丙醇和5mol/L NaCl按体积比3 1混合而成)，混勻，_20°C下放置20min ;12000g/min离心15min,弃上清,底部沉淀有DNA。(5)洗盐和溶解DNA向沉淀有DNA的离心管中加入1000 μ I体积分数70%的乙醇水溶液，洗涤，13000g/min离心3min，弃上清；重复操作2次；取DNA沉淀，在42°C金属浴上，晾干DNA，待干燥后加入60 μ I O.1XTE溶解DNA，-20°C保存。本实施例提取并纯化出的墨西哥刺参干品体壁总DNA的琼脂糖电泳如图1 (5-8道)所示，无明显的DNA主带；但以本实施例提取DNA为模板，COI扩增产物的琼脂糖电泳如图2 (5-8道)所示，COI带型清晰，稳定，说明此DNA中有完整的线粒体DNA，能满足对线粒体DNA片段PCR扩增等分子生物学实验的要求。实施例4 (I)样品预处理材料为墨西哥刺参(Isostichopus fucus)干品，用剪刀取体壁组织8mg,放入1. 5ml 离心管中，加入 1000 μ I PBS 溶液(137mmol/L NaCl, 2. 7mmol/L KCl, 10mmoI /L Na2HPO4, 2mmol/L KH2PO4, ρΗ7· 2)，放置30min,期间更换PBS溶 液2次，得到浸发的样品。剪取60mg浸发的样品，放入1. 5ml离心管中，加入1000 μ I高盐缓冲液中(200mmol/LTris-HCl, 50mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 0. 2%β -巯基乙醇，余量为水，pH 8.0)，充分剪碎样品，10000g/min离心2min，弃上清液；重复操作2次，得到的沉淀即为预处理后的样品。(2)样品裂解样品裂解液为添加SDS的CTAB抽提缓冲液(100mmol/L Tris-HCl，20mmol/LEDTA,1. 4mol/L NaCl，2%CTAB，1%PVP, 1%SDS,0. 2%β -巯基乙醇，余量为水)，加热至 65。。，混匀；向预处理后的样品中加入800 μ I预热的裂解液和20 μ I 20mg/ml蛋白酶K，放置在65°C金属浴上,消化60min,每IOmin混勻一次。待样品消化彻底后，12000g/min离心3min,上层将形成一层悬浮粘稠物，用移液器吸取下层澄清的样品消化液，转入新的1. 5ml离心管中。(3)氯仿异戊醇抽提向样品消化液中加入等体积的氯仿异戊醇(体积比24:1 )，充分混匀，静止2min，12000g/min离心12min，用粗口枪头移液器轻吸上清，转入新的离心管；重复操作3次，得上清液。(4)异丙醇高盐沉淀DNA向上清液中加入等体积异丙醇高盐溶液(异丙醇和5mol/L NaCl按体积比3 1混合而成)，混勻，_20°C下放置20min ;13000g/min离心12min,弃上清,底部沉淀有DNA。(5)洗盐和溶解DNA向沉淀有DNA的离心管中加入1000 μ I体积分数70%的乙醇水溶液，洗涤，12000g/min离心5min，弃上清；重复操作3次；取DNA沉淀，在42°C金属浴上，晾干DNA，待干燥后加入60 μ I 0.1XTE溶解DNA，-20°C保存。由此获得墨西哥刺参干品体壁总DNA，该DNA质量好，以本实施例提取DNA为模板，COI扩增产物的琼脂糖电泳显示COI带型清晰，稳定，说明此DNA中有完整的线粒体DNA，能满足对线粒体DNA片段PCR扩增等分子生物学实验的要求。
权利要求
1.一种海参体壁总DNA提取方法，其特征在于，包括以下步骤Ca)样品预处理第一步是将海参的酒精保存样品用PBS溶液置换出酒精，或将海参干品用PBS溶液浸发，将第一步处理好的样品在高盐缓冲液中剪碎样品，然后固液分离，弃液相取剪碎的固体样品作为预处理后的样品；所述的高盐缓冲液为200mmol/LTris-HCl, 50mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, O. 2% β -巯基乙醇，余量为水，ρΗ8. O ；(b)样品的裂解将预处理后的样品加入到裂解液中，再加入适量的蛋白酶K降解蛋白质，65°C消化3(T60min，每隔5 IOmin混匀一次，待样品消化彻底后，12000g/min离心2 3min，上层形成一层悬浮粘稠物，取下层澄清的样品消化液；所述的裂解液为IOOmmol/LTris-HCl, 20mmol/L EDTA,1. 4mol/L NaCl，2%CTAB，1%PVP, 1%SDS,0. 2%β -巯基乙醇，余量为水；(c)样品消化液用氯仿异戊醇抽提，含有DNA的水相加入等体积的异丙醇高盐溶液，-20°C下放置20min，12000-13000g/min离心12_15min，弃上清，取DNA沉淀；所述的异丙醇高盐溶液是由异丙醇和5mol/L NaCl按体积比3 1混合而成；(d)用体积分数70%乙醇水溶液的洗涤DNA沉淀，然后12000-13000g/min离心3_5min，弃上清；重复操作2-3次，将DNA沉淀干燥，再用O.1 X TE溶液充分溶解保存。
2.根据权利要求1所述的海参体壁总DNA提取方法，其特征在于，所述的步骤(a)的将海参的酒精保存样品用PBS溶液置换出酒精是取海参的酒精保存样品在PBS溶液中放置3-6min,期间更换PBS溶液2次；所述的步骤(a)的将海参干品用PBS溶液浸发是将海参干品在PBS溶液放置30-60min，期间更换PBS溶液2次；所述的步骤(a)的固液分离是在10000-12000g/min离心l_2min,弃上清液；重复操作2次。
3.根据权利要求1所述的海参体壁总DNA提取方法，其特征在于，所述的步骤(c)的样品消化液用氯仿异戊醇抽提是将样品消化液中加入等体积的体积比为24:1的氯仿异戊醇中，充分混匀，静止l-2min，12000-13000g/min离心12-15min，取上清液；重复操作2-3次，得到含有DNA的上清水相。
全文摘要
本发明公开了一种海参体壁总DNA提取方法。它包括样品预处理、样品的裂解、样品消化液用氯仿异戊醇抽提，含有DNA的水相加入等体积的异丙醇高盐溶液，-20℃下放置20min，12000-13000g/min离心12-15min，弃上清，取DNA沉淀；所述的异丙醇高盐溶液是由异丙醇和5mol/L NaCl按体积比31混合而成；用体积分数70%乙醇水溶液的洗涤DNA沉淀，然后12000-13000g/min离心3-5min，弃上清；重复操作2-3次，将DNA沉淀干燥，再用0.1×TE溶液充分溶解保存。因此利用本发明的海参体壁总DNA提取方法能够高质量的提取到海参DNA，其DNA纯度高，避免了粘多糖、胶原蛋白和色素等影响，能满足后续PCR等分子生物学实验的要求。
文档编号C12N15/10GK102994493SQ201210439669
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月6日 优先权日2012年11月6日
发明者夏建军, 胡超群, 张吕平, 王艳红 申请人:中国科学院南海海洋研究所