专利名称：一种高效诱导l-阿拉伯糖异构酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种高效诱导L-阿拉伯糖异构酶的方法。
背景技术：
随着糖尿病、肥胖症等病症的发病率的不断升高，人们对饮食健康越来越关注,并尽量避免高脂高能量食物的摄入。蔗糖是传统的甜味剂，但其能量较高，新型的蔗糖替代品的开发和研究是功能性甜味剂领域具有重要经济价值和实际意义的当务之急。D-塔格糖是近年来发现的一种低热量的功能性单糖，D-塔格糖是一种天然存在的稀有己酮糖。它与D-半乳糖是醛酮糖异构体。D-塔格糖的甜味特性与蔗糖非常相似，甜度为蔗糖的92%，而且没有任何的不良异味或后味，可作为一种理想的风味增强剂和甜味剂；另外塔格糖还有很多特殊的功能，它可以改善肠道菌群，维护肠道健康，降低血糖，治疗糖尿病，还可以抗龋齿，是一种新型的功能性甜味剂。大量安全毒理学试验均显示，D-塔格糖安全无毒，美国食 品药品管理局(FDA)于2001年批准塔格糖为公认安全食品(GRAS)，并正式批准其可作为一种甜味剂应用到食品和医药行业中。现在，D-塔格糖作为一种传统甜味剂的代用品已经被广泛地应用于烘焙食品、口香糖、饮料、巧克力、酸奶、保健以及医药产品中。L-阿拉伯糖异构酶(EC 5. 3. I. 4, L-arabinose isomerase)不仅可以催化L-阿拉伯糖异构化生成L-核酮糖，也可以催化D-半乳糖异构化为D-塔格糖，被认为是目前生物法生产D-塔格糖最有效并且最可行的酶。用L-阿拉伯糖异构酶来生产D-塔格糖已经成为学者们研究的热点。目前L-阿拉伯糖异构酶的大量获得多采用大肠杆菌工程菌的过量表达方法，该方法相比较于野生微生物的产酶，具有容易控制、培养简单、发酵周期短、发酵酶活高等优点。而已有的L-阿拉伯糖异构酶大肠杆菌基因工程菌多采用乳糖操纵子重组质粒的表达方式，利用乳糖操纵子的诱导模式，以IPTG等常见诱导剂，实现L-阿拉伯糖异构酶的高效诱导表达。然而在实际操作中，蛋白表达速率过快，不易折叠成活性蛋白而形成包涵体，不利于L-阿拉伯糖异构酶的活性表达，从而影响了其发酵酶活。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种高效诱导L-阿拉伯糖异构酶的方法，该方法能够高效诱导L-阿拉伯糖异构酶的活性表达，有效提高活性酶的表达量。为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案一种高效诱导L-阿拉伯糖异构酶的方法，其以乳糖操纵子质粒pET_22b (+)构建的L-阿拉伯糖异构酶重组菌为出发菌，利用诱导剂诱导L-阿拉伯糖异构酶的活性表达，其中，所述的诱导剂至少包括D-半乳糖。优选地，所述诱导剂为D-半乳糖与其它诱导剂的组合。根据一个具体方面，所述诱导剂为D-半乳糖与诱导剂IPTG的组合。一般，D-半乳糖的添加浓度为O. 01 lOmmol/L，诱导剂IPTG的添加浓度为O. I lmmol/L。优选地，D-半乳糖的添加浓度为0. I lmmol/L0根据本发明的进一步实施方案将L-阿拉伯糖异构酶重组菌培养于LB培养基中，培养温度为37± 1°C，培养至600nm光密度值为O. 6时，添加诱导剂IPTG和D-半乳糖，在温度15 40°C下进行诱导，诱导时间为O. 5 10h。根据本发明，所述乳糖操纵子质粒pET_22b(+)构建的L-阿拉伯糖异构酶重组菌可以为含解纤维热酸菌L-阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌BL21 (DE3)或含嗜热脂肪芽孢杆菌L-阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌BL21 (DE3)。由于上述技术方案的运用，本发明与现有技术相比具有下列优点和效果 本发明在L-阿拉伯糖异构酶诱导表达过程中，采用D-半乳糖作为诱导剂，有效促进了 L-阿拉伯糖异构酶的折叠，从而提高了 L-阿拉伯糖异构酶的活性表达，提升L-阿拉伯糖异构酶的发酵酶活，降低了 L-阿拉伯糖异构酶的发酵生产成本。本发明方法所得L-阿拉伯糖异构酶，酶活性高，用于催化D-半乳糖合成D-塔格糖，可显著降低D-塔格糖的生产 成本。
具体实施例方式本发明目的在于提供一种高效诱导L-阿拉伯糖异构酶的方法，采用的技术方案是在以乳糖操纵子质粒pET-22b (+)构建的L-阿拉伯糖异构酶重组菌表达目的蛋白诱导表达过程中，添加酶底物D-半乳糖，促进L-阿拉伯糖异构酶的有效折叠，高效诱导L-阿拉伯糖异构酶的活性表达，有效提高了活性酶的表达量，其特点是I、L-阿拉伯糖异构酶重组菌的宿主细胞为BL21 (DE3)，载体质粒为pET_22b (+)，重组菌培养于LB培养基中，培养温度为37±1°C，培养至600nm光密度值为O. 6时，添加诱导剂O. I lmmol/L IPTG,同时添加D-半乳糖至O. I lmmol/L,诱导温度为15 40°C,诱导时间为O. 5 IOh ；2、粗酶液制备重组大肠杆菌细胞经培养后，10，OOOrpm离心IOmin收集菌体，生理盐水洗涤三次后加入适量50mmol/L Tris-HCl (pH 6. 5)悬浮细胞，进行超声波细胞破碎。破碎条件工作Is,间隔3s,工作时间6min。条件下12, OOOrpm离心15min收集上清液，即为粗酶液；3、L-阿拉伯糖异构酶活力测定总反应体积为ImL,包括50mmol/L底物D-半乳糖，lmmol/L MnSO4,0. 5mmol/L CoCl2, 50mmol/L Tris-HCl 缓冲液和适量的酶液，75°C水浴恒温30min后，冰浴终止反应，离心取上清测定D-塔格糖的生成量，每分钟催化氧化I μ molD-塔格糖的酶量为I个酶活单位；4、HPLC检测L-阿拉伯糖异构酶反应产物D-塔格糖的方法取酶反应液离心，上清液微孔滤膜过滤(0. 22 μ m),滤液上HPLC分析，HPLC条件为=Anglent 1200色谱柱NH2P-504E，流动相60%乙腈，检测器示差折光检测器，柱温35°C，流速lmL/min，进样量20 μ L，D-塔格糖标样浓度0. 5%。以下结合具体的实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明不限于以下实施例。实施例I添加D-半乳糖促进解纤维热酸菌L-阿拉伯糖异构酶的高效表达含解纤维热酸菌L-阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌BL21(DE3)的构建方法如文献报道(Appl Microbiol Biotechnol，2010，86 (4) : 1089-1097)，其利用的宿主细胞为大肠杆菌BL21 (DE3),外源L-阿拉伯糖异构酶基因的来源为纤维热酸菌(Acidothermuscellulolytics ATCC 43068)，表达载体质粒是乳糖操纵子的pET_22b (+)。该重组菌在LB培养基中37°C培养至600nm光吸收值为0. 6的时候，加入lmmol/L常规诱导剂IPTG，同时添加不同浓度的酶底物D-半乳糖，30°C诱导4h，收集菌体，测定发酵酶活，实验结果见表I。表I添加D-半乳糖可以提高解纤维热酸菌L-阿拉伯糖异构酶的发酵酶活
神乳糖添加量細麵亂)O Foj^ 0.4 o.6 I o.8 Ii p Γιο^
L-阿拉伯帽羿機酶諭 ..........j 6.S..............J,,,,,16.8............J ,,,,,,,玉露:,,,,,,,,j 23#2,,,,,,,,,| 23.5,,,,,, | ft酵酶活(u/niL)实验结果表明添加酶底物D-半乳糖可以明显提高L-阿拉伯糖异构酶的发酵酶活，可能原理是诱导剂的诱导结果，只是让蛋白基因高效转录成mRNA，而mRNA的翻译过程与诱导剂无关；然而天然L-阿拉伯糖异构酶是个六个亚基构成的多聚体结构，每个亚基具有三个结构域，而L-阿拉伯糖异构酶的活性中心及底物结合口袋是由三个不同亚基中不同结构域共同组成，因此，L-阿拉伯糖异构酶的蛋白翻译与折叠相对困难，而底物D-半乳糖的存在有利于酶蛋白折叠成活性蛋白。实施例2添加D-半乳糖促进嗜热脂肪芽孢杆菌L-阿拉伯糖异构酶的高效表达含嗜热脂肪芽孢杆菌L-阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌BL21(DE3)的构建方法如文献报道(J Sci Food Agric 2010，90 (8) : 1327-1333)，其利用的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)，外源L-阿拉伯糖异构酶基因的来源为嗜热脂肪芽孢杆菌(BacillusstearothermophiIus IAM 11001),表达载体质粒是乳糖操纵子的pET_22b (+)。该重组菌在LB培养基中37°C培养至600nm光吸收值为0. 6的时候，加入lmmol/L常规诱导剂IPTG，同时添加不同浓度的酶底物D-半乳糖，30°C诱导4h，收集菌体，测定发酵酶活，实验结果见表2。表2添加D-半乳糖可以提高嗜热脂肪芽孢杆菌L-阿拉伯糖异构酶的发酵酶活D-半乳糖添加量 I O ΠΟ^Ι 4^ 0.6 0.8^Π P po^(mmo]/L)L·阿拉伯糖异构酶 4.6 12J^ ^183^ ^ 9Μ^ ^18J^ ^18.6 17.9^ ^17,5
的发酵酶簡u/nA)上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种高效诱导L-阿拉伯糖异构酶的方法，其以乳糖操纵子质粒pET-22b(+)构建的L-阿拉伯糖异构酶重组菌为出发菌，利用诱导剂诱导L-阿拉伯糖异构酶的活性表达，其特征在于所述的诱导剂至少包括D-半乳糖。
2.根据权利要求I所述的高效诱导L-阿拉伯糖异构酶的方法，其特征在于所述诱导剂为D-半乳糖与其它诱导剂的组合。
3.根据权利要求2所述的高效诱导L-阿拉伯糖异构酶的方法，其特征在于所述诱导齐U为D-半乳糖与诱导剂IPTG的组合。
4.根据权利要求3所述的高效诱导L-阿拉伯糖异构酶的方法，其特征在于D-半乳糖的添加浓度为O. 01 10mmol/L，诱导剂IPTG的添加浓度为O. lmmol/L。
5.根据权利要求4所述的高效诱导L-阿拉伯糖异构酶的方法，其特征在于D-半乳糖的添加浓度为O. l^lmmol/Lo
6.根据权利要求I或4或5所述的高效诱导L-阿拉伯糖异构酶的方法，其特征在于将L-阿拉伯糖异构酶重组菌培养于LB培养基中，培养温度为37 土 1°C，培养至600 nm光密度值为0.6时，添加诱导剂IPTG和D-半乳糖，在温度15lO°C下进行诱导，诱导时间为O.5 10h。
7.根据权利要求I所述的高效诱导L-阿拉伯糖异构酶的方法，其特征在于所述乳糖操纵子质粒pET-22b (+)构建的L-阿拉伯糖异构酶重组菌为含解纤维热酸菌L-阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌BL21 (DE3)或含嗜热脂肪芽孢杆菌L-阿拉伯糖异构酶的大肠杆菌BL21(DE3)。
全文摘要
本发明涉及一种高效诱导L-阿拉伯糖异构酶方法，主要是在以乳糖操纵子质粒pET-22b(+)构建的L-阿拉伯糖异构酶重组菌表达目的蛋白诱导表达过程中，添加酶底物D-半乳糖，促进L-阿拉伯糖异构酶的有效折叠，高效诱导L-阿拉伯糖异构酶的活性表达，有效提高活性酶的表达量。本发明提高了以乳糖操纵子质粒pET-22b(+)构建的L-阿拉伯糖异构酶重组菌的活性L-阿拉伯糖异构酶的表达量与发酵酶活，从而可以大幅度降低L-阿拉伯糖异构酶的发酵生产成本；所得产品L-阿拉伯糖异构酶是一种新型糖酶，可以催化D-半乳糖合成高附加值的功能性稀有糖—D-塔格糖，具有广阔的市场前景。
文档编号C12N9/90GK102888389SQ201210320390
公开日2013年1月23日 申请日期2012年8月31日 优先权日2012年8月31日
发明者季万兰, 江波, 沐万孟, 李晓卉, 丁美琴, 刘炯, 刘知远, 韩晓明 申请人:江苏梁丰食品集团有限公司