一种高效鸡基因工程鸡干扰素α的制备方法

专利名称：一种高效鸡基因工程鸡干扰素α的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种高效鸡基因工程鸡干扰素α的制备方法，属于疾病免疫领域。
背景技术：
干扰素(Interferon，IFN)是在外源物质(如病原微生物)和肿瘤细胞的作用下，由特定细胞(B细胞、成纤维细胞或上皮细胞)基因控制所分泌的一种糖蛋白。最先是由英国病毒学家Isaacs和瑞士研究人员Linden_mann于1957年在利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感病毒的干扰现象时发现的。1963年Lampson等纯化了这种因子，并证明该因子是一种蛋白质，其分子量为20-34kd (鸡干扰素研究进展，家禽科学，2010，(5):46-48)。对干扰素基因序列研究结果表明，该序列早在5-10亿年前就存在于生命细胞的基因序列中，是生物体内一种古老的保护因子。近半个世纪，干扰素一直是病毒学、细胞学、分子生物学、临床医学、免疫学、肿瘤学等相关领域的研究热点，但主要是针对人类及哺乳动物干扰素作用机理及 临床实验的研究。国际细胞因子命名委员会根据干扰素结合受体类型和在染色体上的位置不同，将干扰素分为I型、II型和III型干扰素。其中I型干扰素主要具有抗病毒和抗肿瘤等作用，按其与抗体结合的抗原性不同可分为α、β、τ、ω等。其中IFN-α主要由感染病毒B细胞产生，又可分为13种以上亚型，如IFNa-I、IFNa-2、IFNa-3。亚型又可分为不同的亚亚型，如 IFNa -la、IFNa -lb、IFNa -lc、IFNa-Id 以及 IFNa -2a、IFNa -2b、IFNa -2c 等。IFN-β主要由成纤维细胞和上皮细胞产生，部分来源于巨噬细胞。I型干扰素具有耐酸性，在ρΗ2. (Γ10. O的条件下很稳定。II型干扰素又被成为免疫干扰素，只包括IFN-Y，主要由T淋巴细胞和NK细胞产生，具有免疫调节作用，但也有一定的抗病毒活性，但不如I型干扰素强。II型干扰素既不耐酸，也不耐热，在ΡΗ2. O时不稳定，在56°C下30min会被破坏。III型干扰素，目前已知的主要包括 IFNA (IL-29)、IFNA2 (IL-28A)和 IFNλ 3 (IL-28B)。III型干扰素刺激不同的细胞系后导致的转录应答均与I型和II型干扰素相似。I型干扰素的产生是天然免疫应答的重要组成部分，是机体抵御外来病原感染的第一道防线。病毒感染后几个小时内，IFN就会出现自分泌和旁分泌效应，从而来抵抗外来病原的感染。I型干扰素可以抑制病毒蛋白和DNA的合成，活化NK细胞，促进MHC I类分子的抗原递呈。干扰素的抗病毒活性主要通过PKR途径、2 ’ -5 ’寡核苷酸合成酶途径、Mx途径和ADARl途径等来发挥作用，以感染病毒的细胞为靶向，作用于病毒侵染的每个阶段，包括侵入、转录、RNA的合成、翻译起始、成熟、组装和释放，而不是直接作用于病毒本身。禽类IFN具有以下几种作用(I)抗病毒作用IFN并不直接作用于病毒，而是通过诱导正常细胞产生抗病毒蛋白(Antiviral protein, AVP)间接地达到抗病毒的效果,是非特异的,但具有种属特异性。家禽IFN I、II型均具有广谱抗病毒作用，I型IFN的抗病毒作用最强。首先，IFN与周围细胞膜上的受体结合，起着第一信使的作用，活化细胞膜腺苷酸环化酶，促使cAMP形成；然后cAMP作为第二信使，激活细胞内抗病毒作用机制，产生AVP。AVP主要有3种蛋白激酶、磷酸二酯酶和2 - 5A合成酶。前2种能破坏细胞核糖体转译病毒蛋白质，后一种酶能降解mRNA，有的能抑制转录酶，阻止mRNA的形成，还有的能抑制病毒DNA和RNA的合成。因此，可以说IFN是通过AVP间接地抑制病毒复制而达到抗病毒作用的。(2)抗肿瘤作用IFN I、II型都具有抗肿瘤作用，但IFN II型效果更为显著。干扰素抗肿瘤机制有以下几种方式①有些肿瘤的发生与病毒有关，IFN通过抑制了病毒的增殖而抑制肿瘤的发生与成长。②IFN作用于细胞膜，刺激腺苷酸环化酶，使cAMP增加，抑制了 DNA的合成及细胞分裂。③IFN能改变肿瘤细胞表面的性能，诱发新的抗原，从而易被免疫监视细胞识别并加以排斥。④通过免疫调节，增强机体抗肿瘤能力，主要是增强巨噬细胞、NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞的杀伤性。1999年，Plachy等进行了鸡重组IFN防治RSV肿瘤的研究，结果表明高剂量的重组IFN不仅可以抑制肿瘤，还可以使一些鸡的RSV肉瘤完全消失(鸡干扰素研究进展，家禽科学，2010，(5) :46-48)。临床上可用于治疗鸡马立克氏疾病、鸡白血病、网状内皮组织增殖病、火鸡淋巴细胞增殖病等。(3)抗寄生虫作用经研究发现，在宿主对寄生虫感染的免疫应答过程中，干扰素发挥着重要的免疫调节作用。其作用主要通过3种途径①通过激活巨噬细胞，增强呼吸频 率，释放氧自由基，通过氧自由基攻击脂质膜，使寄生虫体被破坏，从而达到杀虫目的。②通过L 一精氨酸途径发挥作用，由活化的巨噬细胞产生的NO，从而抑制靶细胞的DNA合成和线粒体的呼吸作用，导致靶细胞代谢功能障碍。③干扰素可以诱导成纤维细胞和巨噬细胞合成产生吲哚胺_2，3-双氧酶，使色氨酸大量分解，导致虫体色氨酸缺乏，从而抑制虫体在宿主体内的繁殖。禽类干扰素在抗寄生虫的作用方面，不同类型干扰素作用的途径是不相同的，I型干扰素主要是通过第3种途径而发生作用，其中IFN-β抗弓形体的机制则更为复杂；II型干扰素主要是通过以上3种途径发挥作用。鸡INF-Y可激活感染艾美耳球虫的动物的巨噬细胞，活化MHC II类分子，提高淋巴细胞水平，减少卵囊排出量，从而提高鸡体重及对球虫感染的抵抗力。(4)免疫调节作用IFN可增加IgG的Fe受体表达，从而有利于巨噬细胞对抗原的吞嗤，K细胞、NK细胞对靶细胞的杀伤以及T、B淋巴细胞的激活，增强机体免疫应答能力。
I型IFN可增加MHC II类分子的表达，从而增强细胞毒性T细胞对这类靶细胞的杀伤效应，同时增加NK细胞裂解潜能，使机体有效地发挥抗病毒感染和抗肿瘤免疫。禽类IFN- Y可增加细胞表面MHC II类分子的表达，调节巨噬细胞、T细胞、B细胞之间的关系，增强免疫应答能力。(5)免疫佐剂作用细胞因子作为佐剂始于20世纪80年代初。许多实验证明，禽类IFN具有较强的佐剂活性并且对降低副作用也有一定功效。早在1991年，A. ff. Heath等就发现，重组IFN与疫苗混合免疫可以明显提高疫苗对供试小鼠的免疫保护效果，而单纯使用IFN-Y对病原菌无效。目前，IFN-Y已成为一种常规选用的免疫佐剂。研究还发现，IFN必须与抗原置于同一位置才能发挥效应。徐守振等将鸡柔嫩艾美耳球虫3-1E抗原基因与鸡IFN-Y基因进行融合，构建真核双价融合表达质粒，对肉鸡进行免疫，具有增强免疫保护作用，可显著降低粪便中的卵囊排出量。随着近年来全球畜禽养殖业的迅猛发展，我国养禽类已由农村家庭副业发展成了社会一大产业，无论是禽类的品种还是数量都位于世界前列。然而，养禽业还存在很多问题，禽流感、传染性法氏囊病、传染性支气管炎、马立克氏病、新城疫等疾病，每年都会在不同的季节暴发，造成巨大的经济损失。目前禽类传染性疾病的防治主要采用疫苗免疫和药物治疗，由于疫苗免疫的血清型单一，而病毒的血清型复杂，毒株变异快，常导致疫苗免疫失败。一些病毒病目前常无疫苗可用，有些病毒也可能直接危害到人类的健康。药物治疗主要采用抗生素进行治疗，但是近年来由于抗生素的广泛和大量使用，导致一些抗药型细菌的产生，并通过食物链传染给人，给人类健康带来更大的威胁。现在一些国家己明令禁止一些抗生素和抗菌剂在养殖业中的应用。因此，人们迫切需要开发一种新的方法来控制畜禽疾病。

发明内容
本发明的目的是提供一种高效鸡基因工程鸡干扰素α的制备方法。为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是提供一种高效鸡基因工程鸡干扰素α的制备方法，具体步骤如下I)重组表达工程菌 Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 种子制备； 将重组表达工程菌Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α按1%的比例接种菌液于含Amp的LB液体培养基中,振荡培养；将培养液接种至含Amp的LB平板,划线培养,挑取单菌LB中摇瓶培养，当OD600nm = O. 5，按250ul/750ul的比例加入50%的甘油，保存；2)工程菌 E. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 发酵种子液制备将保存的工程菌Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 种子按 O. 05-0. 1% 体积的量接种于2 X YT培养液中培养，作为发酵罐用种子液；3)工程菌 Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 发酵生产菌体培养阶段发酵培养基高温灭菌后，每升培养基加入IOOmg的Amp，按5_10%体积的量接入种子液，通气搅拌培养，培养过程调节PH7. 2 ；碳源饲喂阶段碳源耗完，流加补料培养基，溶氧量维持在30 %，培养过程调节ρΗ7· 2 ；诱导表达阶段继续连续流加补料培养基；加入IPTG，在IPTG终浓度O. 5mM条件下诱导表达目的蛋白，培养过程中调节PH7. 2，溶氧量维持在30 %，诱导4h停罐；4)重组鸡α干扰素的纯化取上述发酵液，5000rpm离心IOmin收集菌体，经PBS缓冲液洗涤后PBS缓冲液重悬，超声30min，IOOOOrpm, 4°C，离心IOmin收集沉淀，PBS缓冲液洗涤沉淀，然后用变性缓冲液溶解沉淀，IOOOOrpm, 4°C，离心lOmin，收集上清液，将上清液缓慢加入复性缓冲液中，4°C静置48h，IOOOOrpm, 4°C，离心20min，收集上清液，即得到含有高效鸡基因工程鸡干扰素α的溶液。所述步骤I)中含Amp的LB培养基中Amp的量为100 μ g/ml。所述步骤I)中的振荡培养条件为30°C，200rpm，培养8_10h。所述步骤I)中的保存条件为-20°C。所述步骤2)中2XYT培养液的组成为蛋白胨10. 0g、酵母膏5. 0g、葡萄糖I. 0g、恥(15.(^、琼脂20.(^、蒸馏水 1000ml、pH 7. 0o所述步骤2)中2XYT培养液中培养条件为30°C，200rpm，培养5_12h。所述步骤3)中通气搅拌培养条件为37°C，培养8-10h。
所述步骤3 )中发酵培养基的组成为蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、KH2P042g/L、K2HP044g/L、Na2HPO4 · 12H20 7g/L、(NH4)2SO4 I. 2g/L、NH4Cl 0. 2g/L、MnSO4 · 5H20 0. 001g/UCoCl2 · 6H20 0. 004g/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 002g/L、ZnCl2 0. 002g/L、CuSO4 · 5H20 0. 001g/UH3BO4 0. 005g/L、FeSO4 · 7H20 0. 02gL、CaCl · 2H20 0. 02g/L、MgSO4 · 7H20 0. 3g/L、消泡剂0.2g/L。所述步骤3)中补料培养基的组成为胰蛋白胨30g/L、酵母粉15g/L、MgSO4. 7H203g/L、NaCl 5g/L、甘油 150ml/L、ρΗ7· 2。所述步骤3)中流加补料培养基的速度由溶氧量控制，设定溶氧量30%，当溶氧量大于30%流加泵打开流加补料培养基，溶氧量逐步下降，当溶氧量下降到30%以下流加泵关闭。本发明的方法制备的鸡基因工程鸡干扰素α具有广谱抗病毒性， 功能作用主要是通过与细胞表面的IFN受体结合，激发细胞合成新的mRNA，产生多种效应蛋白，激活蛋白质激酶(PKI)与病毒因子(eLF-2)结合，使其磷酸化，从而抑制病毒复制。同时可以调节B、T淋巴细胞的功能，激活机体免疫系统，提高机体免疫力，并可强化疫苗免疫效果，减少应激反应等生物学功能。
具体实施例方式材料I、工程菌 E. coli BL21 (DE3)/pET22b (+)/ChIFNα 购自中国兽药监察所。2、细胞系、病毒株鸡成纤维细胞(DF-I )，水泡性口炎病毒(VSV)。3、LB 培养基胰蛋白胨10g/L、酵母提取物 5g/L、NaCl 10g/L、pH7.0。4、2 X YT 培养液蛋白胨10. 0g、酵母膏 5. 0g、葡萄糖 I. 0g、NaCl 5. O、琼脂 20. 0g、蒸懼水 1000ml、pH 7. O。5、发酵培养基蛋白胨5g/L、酵母粉 5g/L、KH2P042g/L、K2HP044g/L、Na2HPO4 · 12H20 7g/L、(NH4)2SO4I. 2g/L、NH4Cl 0. 2g/L、MnSO4 · 5H20 0. 001g/L、CoCl2 · 6H20 0. 004g/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 002g/L、ZnCl2 0. 002g/L、CuSO4 · 5H20 0. 001g/L、H3BO4 0. 005g/L、FeSO4 · 7H20 0. 02g/L、CaCl · 2H20 0. 02g/L、MgS04 · 7H20 0. 3g/L、消泡剂 0. 2g/L。6、补料培养基胰蛋白胨30g/L、酵母粉 15g/L、MgSO4 · 7H20 3g/L、NaCl 5g/L、甘油 150ml/L、pH7. 2。7、PBS 缓冲液NaCl 137mmol/L、KCl 2. 7mmol/L、Na2HP044. 3mmol/L、KH2PO4L 4mmol/L、pH 8. 0。8、变性缓冲液6mol/L 盐酸狐，2mmo1 /L 乙二胺四乙酸(EDTA), SOmmoI /L Tris * Cl, IOmmol/L 二硫苏糖醇(DTT)，pH 8.5。
9、复性缓冲液O. 5mol/L 精氛酸,2mmol/L EDTA, 20% 甘油,0. 9mmol/L 氧化型谷胱;甘妝,0. ImoI/LTris · Cl, pH 8. O。实施例I本实施例提供的高效鸡基因工程鸡干扰素α的制备方法，具体步骤如下I、重组表达工程菌 Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 种子制备将重组表达工程菌Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α按1%的比例接种菌液于20mlAmp的量为100 μ g/ml的LB液体培养基中，30°C，200r mp振荡培养8h ;将培养液接种至Amp的量为100 μ g/ml的LB平板，划线培养，挑取10个单菌LB中摇瓶培养，当OD6tltol=O. 5，按250ul/750ul的比例加入50%的甘油，保种数十支，_20°C保存备用。2、工程菌 E. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 发酵种子液制备将_20°C保存的工程菌Ε. coli BL21 (DE3)/pET22b (+) /ChIFNa 种子按 O. 05%体积的量接种于200ml 2 X YT培养液中30°C，200rpm培养12h，作为发酵罐用种子液。3、工程菌 E. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 发酵生产菌体培养阶段发酵培养基高温灭菌后,每升培养基加入100mg/ml的Amp Iml,按10%体积的量接入种子液，37°C通气搅拌培养10h，培养过程中用3M NaOH和10%磷酸调节ρΗ7· 2 ；碳源饲喂阶段碳源耗完，流加补料培养基，流加速度由溶氧量控制；设定溶氧量30%,当溶氧量大于30%流加泵打开流加培养基，溶氧量逐步下降，当溶氧量下降到30%以下流加泵关闭，培养过程中用3Μ NaOH和10%磷酸调节ρΗ7. 2，溶氧量维持在30% ；诱导表达阶段继续连续流加补料培养基；加入IPTG，在IPTG终浓度0. 5mM条件下诱导表达目的蛋白，培养过程中用3M NaOH和10%磷酸调节pH7. 2。溶氧量维持在30%，诱导4h停罐。4、重组鸡干扰素α的纯化取5L上述发酵液，5000rpm离心IOmin收集菌体，经PBS缓冲液洗涤后PBS缓冲液重悬，超声30min使菌体破壁，超声破碎条件为Φ10探头，超声7s间隔5s ；IOOOOrpm, 4°C,离心IOmin收集沉淀，PBS缓冲液洗涤沉淀，然后用变性缓冲液溶解沉淀，lOOOOrpm，4°C，离心lOmin，收集上清液，然后将上清液缓慢加入复性缓冲液中，4°C静置48h，lOOOOrpm, 4°C,离心20min，收集上清液，即得到含有高效鸡基因工程鸡干扰素α的溶液。实施例2本实施例提供的高效鸡基因工程鸡干扰素α的制备方法，具体步骤如下I、重组表达工程菌 Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 种子制备将重组表达工程菌Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α按1%的比例接种菌液于20mlAmp的量为100 μ g/ml的LB液体培养基中，30°C，200rmp振荡培养IOh ;将培养液接种至Amp的量为100 μ g/ml的LB平板，划线培养，挑取8个单菌LB中摇瓶培养，当OD6tltol=0. 5，按250ul/750ul的比例加入50%的甘油，保种数十支，_20°C保存备用。2、工程菌 E. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 发酵种子液制备将_20°C保存的工程菌 E. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 种子按 0. 1% 体积的量接种于200ml 2 X YT培养液中30°C，200rpm培养5h，作为发酵罐用种子液。
3、工程菌 E. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 发酵生产菌体培养阶段发酵培养基高温灭菌后,每升培养基加入100mg/ml的Amp Iml,按5%体积的量接入种子液，37°C通气搅拌培养8h，培养过程中用25%氨水和10%磷酸调节ρΗ7· 2 ；碳源饲喂阶段碳源耗完，流加补料培养基，流加速度由溶氧量控制；设定溶氧量30%,当溶氧量大于30%流加泵打开流加培养基，溶氧量逐步下降，当溶氧量下降到30%以下流加泵关闭，培养过程中用25%氨水和10%磷酸调节ρΗ7. 2，溶氧量维持在30% ；诱导表达阶段继续连续流加补料培养基。加入IPTG，在IPTG终浓度O. 5mM条件下诱导表达目的蛋白，培养过程中用25%氨水和10%磷酸调节pH7. 2。溶氧量维持在30%，诱导4h停罐。4、重组鸡干扰素α的纯化
取5L上述发酵液，5000rpm离心IOmin收集菌体，经PBS缓冲液洗涤后PBS缓冲液重悬，超声30min使菌体破壁，超声破碎条件为Φ10探头，超声7s间隔5s ；lOOOOrpm, 4°C,离心IOmin收集沉淀，PBS缓冲液洗涤沉淀，然后用变性缓冲液溶解沉淀，lOOOOrpm，4°C，离心lOmin，收集上清液，然后将上清液缓慢加入复性缓冲液中，4°C静置48h，lOOOOrpm, 4°C,离心20min，收集上清液，即得到含有高效鸡基因工程鸡干扰素α的溶液。实施例3本实施例提供的高效鸡基因工程鸡干扰素α的制备方法，具体步骤如下I、重组表达工程菌 Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 种子制备将重组表达工程菌Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α按1%的比例接种菌液于20mlAmp的量为100 μ g/ml的LB液体培养基中，30°C，200rmp振荡培养9h ;将培养液接种至Amp的量为100 μ g/ml的LB平板，划线培养，挑取5个单菌LB中摇瓶培养，当OD6tltol=0. 5，按250ul/750ul的比例加入50%的甘油，保种数十支，_20°C保存备用。2、工程菌 E. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 发酵种子液制备将_20°C保存的工程菌Ε. coli BL21 (DE3)/pET22b (+) /ChIFNa 种子按 0. 08%体积的量接种于200ml 2 X YT培养液中30°C，200rpm培养10h，作为发酵罐用种子液。3、工程菌 E. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 发酵生产菌体培养阶段发酵培养基高温灭菌后，每升培养基加入100mg/ml的Amp Iml,按8%体积的量接入种子液，37°C通气搅拌培养9h，培养过程中用3M NaOH和10%磷酸调节ρΗ7· 2 ；碳源饲喂阶段碳源耗完，流加补料培养基，流加速度由溶氧量控制；设定溶氧量30%,当溶氧量大于30%流加泵打开流加培养基，溶氧量逐步下降，当溶氧量下降到30%以下流加泵关闭，培养过程中用3Μ NaOH和10%磷酸调节ρΗ7. 2，溶氧量维持在30% ；诱导表达阶段继续连续流加补料培养基。加入IPTG，在IPTG终浓度0. 5mM条件下诱导表达目的蛋白，培养过程中用3M NaOH和10%磷酸调节pH7. 2。溶氧量维持在30%，诱导4h停罐。4、重组鸡干扰素α的纯化取5L上述发酵液，5000rpm离心IOmin收集菌体，经PBS缓冲液洗涤后PBS缓冲液重悬，超声30min使菌体破壁，超声破碎条件为Φ10探头，超声7s间隔5s ；lOOOOrpm, 4°C,离心IOmin收集沉淀，PBS缓冲液洗涤沉淀，然后用变性缓冲液溶解沉淀，lOOOOrpm，4°C，离心lOmin，收集上清液，然后将上清液缓慢加入复性缓冲液中，4°C静置48h，lOOOOrpm, 4°C,离心20min，收集上清液，即得到含有高效鸡基因工程鸡干扰素α的溶液。鸡干扰素α的生物学活性测定如下生物学活性测定参照2005年《中华人民共和国药典》三部附录X C细胞活性抑制法，用 MDBK 细胞一水泡性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus, VSV) (ATCCNumber :VR-1238AF)系统，采用CPE (致细胞病变效应)抑制为基础的抑制微量测定法，以每毫升干扰素检品的最高稀释度仍能保护半数细胞(50%)免受病毒攻击的稀释度的倒数为干扰素单位。检测重组干扰素的抗病毒活性，所用细胞系是MDBK细胞，病毒用VSV。测定方法用以细胞病变(CPE)抑制为基础的抑制微量测定法。用含有10%FBS的DMEM细胞培养基将细胞接种于96孔板中，于5%C02，37°C培养至单层。将干扰素样品预稀释1000倍，再按 培养基稀释的103TCID5(l/ml病毒液，同时设置不加干扰素的病毒对照组和不加干扰素及病毒的细胞对照组。待病毒对照组出现90%以上细胞病变时，进行结晶紫染色，用酶标仪(Tekan, Grodig, Austria)在570nm波长读值。结果根据Reed-Muench法计算。结果表明，重组鸡干扰素α的抗病毒活性约为1.5X108U/mg。鸡干扰素α的保存期试验如下物理性状观察本发明制备的鸡基因工程鸡干扰素α在25°C和相对湿度60%土 10%条件下放置6个月和2 8°C放置24个月后，每次抽样检测外观、澄明度和pH值均无变化。无菌检查本发明方法制备的鸡基因工程鸡干扰素α在25°C和相对湿度60%土 10%条件下放置6个月和2 8°C放置24个月后，每次抽样检测无细菌污染。生物活性测定由表I实验可知鸡干扰素α注射液成品在2 8°C存放24个月，25°C存放3个月，生物活性无明显变化。鸡干扰素α注射液成品在25°C、相对湿度60%土 10%条件下保存3个月稳定，6个月的效价略有降低，外观色泽、PH值、澄明度、纯度未受影响。本品注射液成品在2 8°C的长期稳定性考查24个月后质量稳定。细胞病变抑制法测定干扰素效价标准操作规程I、目的及适用范围运用细胞病变抑制法测定干扰素效价，该标准操作适用于其他能抑制病毒复制的细胞因子的效价测定。2、主要仪器倒置显微镜、酶标仪、细胞培养箱、微量移液器。3、试剂及配制方法DMEM细胞培养液、小牛血清(FBS)、0. IM PBS、胰酶、染色液、脱色液。4、操作步骤
4. I细胞制备取生长良好的MDBK细胞，按常规方法消化，运用10%FBS DMEM细胞培养液制备细胞悬液；对细胞进行计数，调整细胞浓度为I X 10个/ml的悬液，然后加入到96孔细胞培养板上，100 μ I/孔。37°C，5%C02培养8 IOh使其成为单层细胞。4. 2加入干扰素处理细胞取待测干扰素样本，运用10%FBS DMEM细胞培养液预稀释成终浓度为O. OOlmg/ml，然后运用10%FBS DMEM细胞培养液进行4倍梯度稀释，稀释6 8个梯度；将培养8 10h的单层细胞中的培养液吸出，加入4倍倍比稀释的干扰素稀释液，每孔100μ 1，每个梯度三个重复，同时取6孔分别标为病毒阳性对照和病毒毒阴性对照，并在各孔中加入等量细胞培养液；培养12 15h。4. 3病毒感染
取VSV病毒，运用无血清DMEM细胞培养液稀释成终浓度为103TCID5(l/ml ;在阳性对照和干扰素处理细胞各孔中加入100 μ I病毒稀释液，在阴性对照孔中加入无血清DMEM细胞培养液；培养24h。4. 4结晶紫染色弃细胞培养液，于每孔中加入结晶紫染色液100 μ 1，室温放置30min。4. 5 脱色弃染料，并用自来水或双蒸水冲洗未着色染料，然后在每孔中加入脱色液100 μ 1，室温放置IOmin。4. 6运用酶标仪测定OD57tlnm值并记录。4. 7数据处理，以能抑制50%细胞病变的干扰素含量定义为一个活性单位，运用Reed-Muench法计算干扰素效价，即能抑制50%细胞病变的稀释倍数，方法见表I。表I运用Reed-Muench法计算干扰素效价分别计算阴性对照(无病毒对照)Χ与阳性对照平均值(病毒对照值)Y
权利要求
1.ー种高效鸡基因工程鸡干扰素α的制备方法，其特征在于，具体步骤如下 1)重组表达工程菌Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 种子制备 将重组表达工程菌Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α按1%的比例接种菌液于含Amp的LB液体培养基中，振荡培养；将培养液接种至含Amp的LB平板，划线培养，挑取单菌LB中摇瓶培养，当OD600nm = O. 5，按250ul/750ul的比例加入50%的甘油，保存； 2)工程菌E. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 发酵种子液制备 将保存的工程菌Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α种子按O. 05-0. 1%体积的量接种于2XYT培养液中培养，作为发酵罐用种子液；3)工程菌Ε. coli BL21 (DE3) /pET22b (+) /ChIFN α 发酵生产 菌体培养阶段发酵培养基高温灭菌后，每升培养基加入IOOmg的Amp，按5-10%体积的量接入种子液，通气搅拌培养，培养过程调节PH7. 2 ； 碳源饲喂阶段碳源耗完，流加补料培养基，溶氧量维持在30%，培养过程调节pH7. 2 ； 诱导表达阶段继续连续流加补料培养基；加入IPTG，在IPTG终浓度O. 5mM条件下诱导表达目的蛋白，培养过程中调节PH7. 2，溶氧量维持在30 %，诱导4h停罐； 4)重组鸡α干扰素的纯化 取上述发酵液，5000rpm离心IOmin收集菌体，经PBS缓冲液洗涤后PBS缓冲液重悬，超声30min，10000rpm，4°C，离心IOmin收集沉淀，PBS缓冲液洗涤沉淀，然后用变性缓冲液溶解沉淀，IOOOOrpm, 4°C，离心lOmin，收集上清液，将上清液缓慢加入复性缓冲液中，4°C静置48h，IOOOOrpm, 4°C，离心20min，收集上清液，即得到含有高效鸡基因工程鸡干扰素α的溶液。
2.根据权利要求I所述的ー种高效鸡基因工程鸡干扰素α的制备方法，其特征在干，所述步骤I)中含Amp的LB培养基中Amp的量为100 μ g/ml。
3.根据权利要求I所述的ー种高效鸡基因工程鸡干扰素α的制备方法，其特征在干，所述步骤I)中的振荡培养条件为30°C，200rpm，培养8_10h。
4.根据权利要求I所述的ー种高效鸡基因工程鸡干扰素α的制备方法，其特征在干，所述步骤I)中的保存条件为-20°C。
5.根据权利要求I所述的ー种高效鸡基因工程鸡干扰素α的制备方法，其特征在干，所述步骤2)中2ΧΥΤ培养液的组成为蛋白胨10. 0g、酵母膏5. 0g、葡萄糖I. 0g、NaCl 5. 0g、琼脂 20. 0g、蒸馏水 1000ml、pH 7. O。
6.根据权利要求I所述的ー种高效鸡基因工程鸡干扰素α的制备方法，其特征在干，所述步骤2)中2ΧΥΤ培养液中培养条件为30°C，200rpm，培养5_12h。
7.根据权利要求I所述的ー种高效鸡基因工程鸡干扰素α的制备方法，其特征在干，所述步骤3)中通气搅拌培养条件为37°C，培养8-10h。
8.根据权利要求I所述的ー种高效鸡基因工程鸡干扰素α的制备方法，其特征在干，所述步骤3)中发酵培养基的组成为蛋白胨5g/L、酵母粉5g/L、KH2P042g/L、K2HP044g/L、Na2HPO4 · 12H20 7g/L、(NH4)2SO4L 2g/L、NH4Cl 0. 2g/L、MnSO4 · 5H20 0. 001g/L、CoCl2 · 6H20.0. 004g/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 002g/L、ZnC120. 002g/L、CuSO4 · 5H20 0. 001g/L、H3BO4O. 005g/L、FeSO4 · 7H20 0. 02gL、CaCl · 2H20 0. 02g/L、MgSO4 · 7H20 0. 3g/L、消泡剂 0. 2g/L。
9.根据权利要求I所述的ー种高效鸡基因工程鸡干扰素α的制备方法，其特征在干，所述步骤3)中补料培养基的组成为胰蛋白胨30g/L、酵母粉15g/L、MgS04. 7H20 3g/L、NaCl5g/L、甘油 150ml/L、pH7. 2。
10.根据权利要求I所述的ー种高效鸡基因工程鸡干扰素α的制备方法，其特征在干，所述步骤3)中流加补料培养基的速度由溶氧量控制，设定溶氧量30%，当溶氧量大于30%流加泵打开流加补料培养基，溶氧量逐步下降，当溶氧量下降到30%以下流加泵关闭。
全文摘要
本发明涉及一种高效鸡基因工程鸡干扰素α的制备方法，具体步骤如下1、制备重组表达工程菌E.coli BL21(DE3)/pET22b(+)/ChIFNα种子；2、将该工程菌种子培养，制备发酵罐用种子液；3、将种子液接入发酵培养基中，通气搅拌培养；4、碳源消耗完补加补料培养基，加入IPTG，诱导表达目的蛋白；5、取发酵液，离心，收集菌体，PBS洗涤后PBS重悬，超声破碎，离心，收集沉淀，变性缓冲液溶解沉淀，离心，收集上清液，加入复性缓冲液，静置后再离心，取上清液，即得含有鸡基因工程鸡干扰素α的溶液。本品具有广谱抗病毒性，可以调节B、T淋巴细胞的功能，激活机体免疫系统，提高机体免疫力，并可强化疫苗免疫效果，减少应激反应等生物学功能。
文档编号C12R1/19GK102851340SQ201210320070
公开日2013年1月2日 申请日期2012年8月30日 优先权日2012年8月30日
发明者吴红云, 李建正, 范超杰 申请人:郑州后羿制药有限公司