专利名称：美丽鸡血藤est-ssr标记的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种分子标记技术，具体涉及一种美丽鸡血藤EST-SSR遗传标记，适用于美丽鸡血藤的遗传多样性研究，种质鉴定和亲缘关系分析。
背景技术：
微卫星序列(microsatellite DNA)又称为简单序列重复(simple sequencerepeats, SSR)，是指以1_6个核苷酸为基本重复单位的串联重复序列，广泛存在于各类真核生物基因组中。SSR具有丰富的多态性且均匀分布于整个基因组、以孟德尔方式遗传、操作简单、共显性和重复性好，可进行自动化分析，并用于干燥样本的分析等优点。微卫星位点可以提供具高分辨率的遗传信息，这一特点使微卫星既适合于个体水平上的研究，又适合于种群水平上的研究。在个体水平上包括个体识别、交配系统和亲本分析、基因流等研究；在种群水平上微卫星可用于遗传结构、有效种群大小、种群的系统发育重建等研究。毋 庸置疑，SSR标记目前已成为居群遗传学最流行的分子标记，但是，由于SSR标记具有种属特异性，当所研究的目标物种缺乏前期研究基础而无法获得现成的SSR分子标记时，需要对其进行分子标记开发工作。采取实验室手段开发SSR引物费时，耗力，成本高，试验复杂，基于现有转录组数据库信息进行SSR引物开发将是一种既经济又有效的方法。从表达序列标签(expressed sequence tag, EST)中开发SSR标记(EST-SSR)是近年来发展起来的新型分子标记，与基因组SSR相比，它反映了基因组的编码区域，可以直接获得基因表达的信息，有可能对决定重要表型性状的等位基因进行直接鉴定；充分利用了现有测序数据，降低了开发成本；在不同物种间通用性好，具有较高的转移性。自2000年起，已相继水稻、小麦、马铃薯、葡萄、核桃、甜瓜等多种植物上开展了 EST-SSR标记开发，并广泛用于遗传图谱构建、遗传多样性分析、功能基因定位、比较作图等研究。美I 崖豆藤(Callerya speciosa Champ.),为豆科蝶形花亚科鸡血藤属多年生藤状灌木植物，是一种分布于热带和亚热带地区的野生名贵南药，具有悠久的药用历史，以根入药(药材名牛大力)，主治风湿性关节炎、腰肌劳损、慢性支气管炎、慢性肝炎、遗精、白带等，广泛地应用于多种中成药方剂的配制(《全国中草药汇编》编写组，1996)，此外，还可用于熬制靓汤，药食兼用，具有极大的开发利用价值，是一种重要的经济药用植物资源。然而，我国美丽崖豆藤的人工驯化栽培才刚起步，其药材原料主要依赖野生资源，随着市场需求的与日俱增，长期的供不应求带来的掠夺性开发和不合理采挖，已经造成美丽崖豆藤种质资源的极大破坏，广西、广东的野生资源已经濒临枯竭，海南尚有一定的野生资源，但其蕴藏量也十分有限，多呈斑块状零星分布。目前，国内需要的牛大力药材多从越南进口，但产地国开始采取措施保护本国的生态环境和资源，限制了出口量，这将在很大程度上影响我国对牛大力的用药需求。可见对美丽鸡血藤野生资源的保护已迫在眉睫了，但要制定切实有效的保护计划，就必须了解野生种群结构和遗传多样性等方面的信息。现有的通用型分子标记，如RAPD、ISSR等，存在重复性差的严重缺陷，为显性标记且存在共迁移缺点；AFLP虽然具有多态性高，重复性好，稳定可靠和选择中性等优点，但仍为显性标记且操作难度大。相比而言，SSR操作简单，客观明确，选择中性和呈共显性的孟德尔式遗传，能够鉴别杂合体，对隐性性状的选择十分有利，它具有比其它分子标记(如等位酶、RFLP. RAPD等)更多的可检测等位基因，能够提供更细致的基因变化分析范围。但美丽鸡血藤的SSR标记尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种美丽鸡血藤的EST-SSR分子标记，建立美丽鸡血藤微卫星的技术体系并利用这套分子标记进行美丽鸡血藤的遗传多样性研究和亲权关系鉴定。为了实现上述目的，本发明的技术方案为提供一种美丽鸡血藤EST-SSR标记，其特征在于所述的微卫星标记编号为Ndl—001、Ndl—002、Ndl—003、Ndl—004、Ndl—010、Ndl—011、Ndl—013、Ndl—015、Ndl—019、Ndl—020、Ndl—021、Ndl—022、Ndl—028、Ndl—031、Ndl—032、Ndl—033、Ndl—038、Ndl—042、Ndl—043、Ndl—047、Ndl—049、Ndl—050、Ndl—051、Ndl—053 ； 其核苷酸序列分别为Ndl—001 ctcactcgta gccgttccgc tatcctcagc ataagcatct cgacacattc gatctctaga60atcttcttat tatccttctt tatctttcta ctatggcttg ctccaccgtt gtgttgatgc120tagtcgctgc attgttggtg agctccaccg ttgctcaatc tctggcatcg tcgccggctt180cgtctcccac caactcgcct gtggccactc cgccgaagtc ttctcactct ccggcgccgg240tgatttctcc gtccgctagt tcaccggcgg catctcctcc tgctccggtg gagagcggtc300cctctccttc gcctgccgcc gtcaactctc cgccatctcc tcctccggct gcctctgcgt360cgccagctgg cactccttcg gtcactccct cttcgatctc cagtccgcca tctgaagcac420catcaccaag ccaaaacgac gccgctttga acagattcac cgtcgccgga tctgctgctg480ttgtggtttt cgctgcggct ttgctgatgt agagagagag agagagagag agagagacag540agttacttgg agtcaataat tttcttcctt ttttttaatt ctatattcac gaaattatat600ggatcgtgaa cccttgtacc tcatttttgg ttgctcttct cagtgtgacg attcattctt660tcgattattt tctgtattct atttattatt ctatga696Ndl—002 ggaagactcg gagtgattga tggaggcaat gctttcaatc aatttgttgg tgtagagttc60gatagttatg tcaatgggtg ggatccgaat tctgcacata ttggaatcga cgtcaactct120ttgatttcgt tgaagacagt gaaatggaac agggtgagtg ggtcattggt ccaagtgagc180ataatctatg actctctgtc taagacattg agtgttgctg tgactgacaa gaatggtcaa240atttctaccg ttgctcaagt cgttgatttg aaagctgtgc tcccggagaa ggtcaaggtt300ggtctatctg ctgccacatc ttcgggcggc cgtcaaagac acgacatcca ttcatggtct360ttcacttcaa acttggagac ggctacactc agcaccgcgg agaacgcaaa tattgcaagc420tatgcatgat tcctggtccg tcaaatgtgg cttgtgataa ctagtatttc taaataaagg480ccatatatct agtcaatata tatatatata tatatgtgtg tgtgtgtgtt tgagtccatg540catgttgctt aaattttggc tactcaactt atgcaaggtg ggtggttgaa aatggaatta600tgtttgtcct actcgaa617
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权利要求
1.美丽鸡血藤EST-SSR标记，其特征在于所述的微卫星标记编号为Ndl—001、Ndl—002、Ndl—003、Ndl—004、Ndl—010、Ndl—011、Ndl—013、Ndl—015、Ndl—019、Ndl—020、Ndl—021、Ndl—022、Ndl—028、Ndl—031、Ndl—032、Ndl—033、Ndl—038、Ndl—042、Ndl—043、Ndl—047、Ndl—049、Ndl—050、Ndl—051、Ndl—053 ； 其核苷酸序列分别为Ndl—001 ctcactcgta gccgttccgc tatcctcagc ataagcatct cgacacattc gatctctaga60atcttcttat tatccttctt tatctttcta ctatggcttg ctccaccgtt gtgttgatgc120tagtcgctgc attgttggtg agctccaccg ttgctcaatc tctggcatcg tcgccggctt180cgtctcccac caactcgcct gtggccactc cgccgaagtc ttctcactct ccggcgccgg240tgatttctcc gtccgctagt tcaccggcgg catctcctcc tgctccggtg gagagcggtc300cctctccttc gcctgccgcc gtcaactctc cgccatctcc tcctccggct gcctctgcgt360cgccagctgg cactccttcg gtcactccct cttcgatctc cagtccgcca tctgaagcac420catcaccaag ccaaaacgac gccgctttga acagattcac cgtcgccgga tctgctgctg480ttgtggtttt cgctgcggct ttgctgatgt agagagagag agagagagag agagagacag540agttacttgg agtcaataat tttcttcctt ttttttaatt ctatattcac gaaattatat600ggatcgtgaa cccttgtacc tcatttttgg ttgctcttct cagtgtgacg attcattctt660 tcgattattt tctgtattct atttattatt ctatga696 Ndl—002 ggaagactcg gagtgattga tggaggcaat gctttcaatc aatttgttgg tgtagagttc60gatagttatg tcaatgggtg ggatccgaat tctgcacata ttggaatcga cgtcaactct120ttgatttcgt tgaagacagt gaaatggaac agggtgagtg ggtcattggt ccaagtgagc180ataatctatg actctctgtc taagacattg agtgttgctg tgactgacaa gaatggtcaa240atttctaccg ttgctcaagt cgttgatttg aaagctgtgc tcccggagaa ggtcaaggtt300ggtctatctg ctgccacatc ttcgggcggc cgtcaaagac acgacatcca ttcatggtct360ttcacttcaa acttggagac ggctacactc agcaccgcgg agaacgcaaa tattgcaagc420tatgcatgat tcctggtccg tcaaatgtgg cttgtgataa ctagtatttc taaataaagg480ccatatatct agtcaatata tatatatata tatatgtgtg tgtgtgtgtt tgagtccatg540catgttgctt aaattttggc tactcaactt atgcaaggtg ggtggttgaa aatggaatta600 tgtttgtcct actcgaa617 Ndl—003 gcacccccca ctcccttccc ctctctctcc tattatcgct tccgtacaac aaatcatgtg60agattactgc ttaccgtctc taatctctac cctctccttg cccagtattt ggtggtgtaa120tcatcgctag ccagctcttc cttcacaatc ctccaaaaaa cacccttccc acttcgacat180ctcttagcta gatttcaaca taaatgaaat tttacttatg cagctgaagg tgtcttccat240accataatat atatatatat atccattata tatcaaaata ttagttttta gggttttaag300ttgtgcacct ttctacgaat ttgaaataat taaaggatta tgctagtagt acctgttgat360tgaagaagct cttgttcagc tgggttagat atagttgagt gagagagttt tgatttctaa420gtggaaaaat taaatggagg aatacaccag taatcacatg agcgaaaaca caagtccaag480tccaagggca aatttgttct actccccggc cggtgattca agcgtaggaa accggcatca540tgactttccc atcaacaact ttcatcttca attgggtgga tcggatcact gctttcaatc600tgatcaagta ccacaccctt ccgtgaaaac cgagtccaac aactcgcagc tccaccctcc660tattttccac tatccgctga tgatgagagg aaatct696Ndl—004 gaatccggca cgaggctttc ccacactctg cagcaacgta actgcttctc ccaaattacc60aaaaaaacaa aagagaaata aatatttagt aagaattagt tacgtgacgt gttattatta120tggcgccgag ggataagacg ggtggcgtta aggtgaacgg caacggtaac ggcggcgtga180aggaggtgca ttttcgggga gtgaggaaga ggccgtgggg gagatacgcc gcggagatca240gagatcccgg caagaagagc cgcgtttggc tcggcacctt tgacacggcg gaagaggcgg300cgcgagccta cgacgccgcc gcacgcgagt tccgcggccc caaggccaaa accaacttcc360ccttcccttc cgacaatgtc aagatccaga gccccagcca gagcagcacc gtcgaatcct420ccagccgcga ccgcgacgcc gccgccgccg ccgccgattc ctccccgctc gacctcaact480tggcccccgc cgccgtcgcc gcccccgttc ggttcccctt ccagcatcag ttcccgccga540tgccgcccgc aaaccaggcg ttttacttcg acgccgtcct acgctccggc atgctgggtt600cccttccgtg ccagggcttc gggttcaatt ataaccaccc cgtggcggcg agtgagtttc660acgcgacggc gggagcgcaa agcgactcg689Ndl—010 cggcgacgcc gttactgcgg ggacccaagg agatgaaagc ggggcagcgg acgtagaggt60ggtaacggcc ggagatgaag gcgccaacct tccaacggac cctgccgtca atcttgacgg120tgacgaggac gttaccgttg gactggtcct gagtgaggcc cacgaagttg aagggggcga180cggggacgtc ggtgccgtag acaaacggcg accaaacgtc gacctctttg tggccttggt240aagagggagg gatggcggtg cggtaagtga cctgctggct ccggtaactg acgtaggtgt300cgagacggtc gtagtagact ccgatgtggt cgttggggtt gcgcgaggag agggtgactt360ggaagttgga ggttaagaag tttggtacgg tggcgttgaa ggcgtaaacg gtgacgtctt420ggaggatgaa ggatggcttg gagggtctta ggattgccca tatgagaagg attgctacga480ggacgatgaa gaggaatact atgattcccc agaatatgcg ccggaagatc ctcctcttcc540tccccttgtg gtgctcgcac tccttcaccg acatgattat gcgctcttct tcttcttctt600tattttttaa ggtgaagtga aagtgaagag tgggggcgag tgtgtttagc tgaaactatc660tatgaagaat aattaagata ttgattggga caagagcggg ggactagaag tctagaagtg720aggagcaacg gcagaggaaa ttatagaatg attttgtttg tgaggggaag gaattatggg780gaggtttcg789Ndl—Oil caatctagat tctaaaacca gcgaatgagg cccaagtcca actactatgt acaggaacaa60attaatccca actaactgaa aaaagaggga aaaaaaaaaa actacggagt aattaatttg120gatctgttga ttagtattgg gggattttat ttttggtgac tagtagtggg ggatttcaag180cttgggtatg gtgaaaagac ggggcttctt cgctggatga gggctggaga cctcgtcgtc240cacgaagaac ttgttggaaa agtccggaaa agccgggagg ttgagatcga agtcgcggtg300gtggctgtga gaggaaccaa ctccttccga ggcagtgacg gcgctgttgc cgccaccgcc360
2.根据权利要求I所述的美丽鸡血藤EST-SSR标记，其特征在于所述的Ndl_001、 Ndl_002、Ndl_003、Ndl_004、Ndl_010、Ndl_011、Ndl_013、Ndl_015、Ndl_019、Ndl_020、 Ndl_021、Ndl_022、Ndl_028、Ndl_031、Ndl_032、Ndl_033、Ndl_038、Ndl_042、Ndl_043、 Ndl_047、Ndl_049、Ndl_050、Ndl_051、Ndl_053 24 个位点的引物序列分别为
全文摘要
本发明公开了一种美丽鸡血藤EST-SSR分子标记，主要包括美丽鸡血藤EST序列的获得及预处理、EST序列中SSR位点的筛选、EST-SSR引物的设计、合成与引物筛选。从1573条EST序列中搜索到62条含不同简单序列重复单元的、符合条件的序列；筛选得到24个多态性丰富的EST-SSR分子标记Ndl_001、Ndl_002、Ndl_003、Ndl_004、Ndl_010、Ndl_011、Ndl_013、Ndl_015、Ndl_019、Ndl_020、Ndl_021、Ndl_022、Ndl_028、Ndl_031、Ndl_032、 Ndl_033、Ndl_038、Ndl_042、Ndl_043、Ndl_047、Ndl_049、Ndl_050、Ndl_051、Ndl_053。本发明可应用于美丽鸡血藤及近缘物种的遗传多样性评价，鸡血藤属植物种间和居群间的变异和进化关系的研究、种质鉴定和分子标记辅助育种，重复性好、可靠性高，是一种非常有效的分子标记。
文档编号C12N15/11GK102807986SQ20121031896
公开日2012年12月5日 申请日期2012年9月3日 优先权日2012年9月3日
发明者李丽, 李志英, 徐立, 黄碧兰, 李克烈 申请人:中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所