鸡血藤对Hepcidin的调控及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及鸡血藤(Caulis?Spatholobi)对Hepcidin的调控及其应用。本发明揭示了鸡血藤或其提取物对于防治Hepcidin分泌过多相关疾病具有极其优异的效果；其通过抑制铁调蛋白Hepcidin的表达，从而可避免因Hepcidin过表达导致的缺铁及其它相关疾病。
【专利说明】鸡血藤对Hepcidin的调控及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于药物学领域；更具体地,本发明涉及鸡血藤(Caulis Spatholobi)对Hepcidin的调控及其应用。
【背景技术】
[0002]铁是人体必需微量元素之一，铁代谢平衡紊乱，会导致体内铁缺乏或铁过载。肝脏分泌的铁调素Hepcidin通过控制铁的吸收和再循环利用维持体内铁稳态的平衡。遗传缺陷导致的低水平ifepcidin是原发性血色病发生发展的重要因素[Weiss G.Geneticmechanisms and modifying factors in hereditary hemochromatosis.Nature ReviewsGastroenterology&Hepatology 2009; 7:50-8];而在难治性缺铁性贫血(IRIDA) [DuX, She E,Gelbart T, et al.The serine protease TMPRSS6is required to sense irondeficiency.Science 2008;320:1088 - 92 ；Finberg KE, Heeney MM, Campagna DR, etal.Mutations in TMPRS S6cause iron-refractory iron deficiency anemia (IRIDA).Nat Genet 2008; 40:569-71]和慢性炎症性贫血(ACI) [Roy CN, Andrews NC.Anemia ofinflammation:the Hepcidin link.Curr Opin Hematol 2005;12:107-11]中 Hepcidin 的高表达为疾病的治疗带来一定难度。
[0003]因此,调节Hepcidin表达,对铁代谢紊乱疾病的治疗都具有重要意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供鸡血藤(Caulis Spatholobi)在对Hepcidin的调控及其应用。
[0005]在本发明的第一方面，提供一种鸡血藤(Caulis Spatholobi)的用途,用于制备降低体内Hepcidin水平及升高血清铁含量的组合物。
[0006]在一个优选例中，所述的组合物还用于预防、缓解或治疗缺铁性疾病或由Hepcidin分泌过多为病理特征的疾病。
[0007]在另一优选例中，所述的缺铁性疾病包括:缺铁性贫血(包括:难治性缺铁性贫血(IRIDA))、慢性炎症性贫血(ACI)、肾性贫血。
[0008]在另一优选例中，所述的缺铁性疾病是H印cidin过表达导致的缺铁性疾病。
[0009]在另一优选例中，所述的组合物还用于:
[0010]降低编码H印cidin的基因——HAMP基因的表达；或
[0011]降低Smad蛋白(较佳地为Smadl/5/8蛋白)的磷酸化水平；
[0012]抑制BMP6对H印cidin表达的刺激作用；或
[0013]抑制IL-6对Hepcidin表达的诱导作用。 [0014]在另一优选例中，所述的组合物还用于:
[0015]升高血清铁蛋白含量；或
[0016]提闻血清转铁蛋白饱和度。[0017]在另一优选例中，所述的鸡血藤选自下组:
[0018](a)鸡血藤药材(较佳地为鸡血藤的茎(或称为藤))或其粉碎产物；或
[0019](b)鸡血藤的水或有机溶剂提取物。
[0020]在另一优选例中，所述的鸡血藤药材是Spatholobus suberectus Dunn的莖。
[0021]在另一优选例中，所述的鸡血藤的水提取物如下制备:
[0022]将鸡血藤药材用水浸泡1-10小时，煮沸后煎煮1-5小时，过滤收集药液；收集药洛重复煎煮步骤0-3次；合并药液，减压浓缩。
[0023]在本发明的另一方面，提供一种用于降低体内!fepcidin水平及升高血清铁含量的中药制剂，其通过以下方法制备获得:将鸡血藤药材用水浸泡1-10小时，煮沸后煎煮1-5小时，过滤收集药液；收集药渣重复煎煮步骤0-3次；合并药液，减压浓缩。
[0024]在本发明的另一方面，提供一种降低体内!fepcidin水平及升高血清铁含量的方法，包括步骤:给需要的对 象施用有效量的鸡血藤。
[0025]本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1、鸡血藤水煎液体外抑制HAMP表达。
[0027](A) 16种中草药水煎液对人肝癌细胞系Huh7细胞H印cidin mRNA表达的影响。药物浓度20μ g/mL，作用时间为12小时。其中鸡血藤水煎液抑制HAMP基因的作用最明显，表达量仅为对照组的40%。
[0028](B)鸡血藤水煎液抑制IfepG2细胞H印cidin表达的浓度作用曲线，药物作用时间为12小时。
[0029](C)鸡血藤水煎液抑制IfepG2细胞H印cidin表达的时间作用曲线，药物浓度为200 μ g/mL。
[0030](D)HepG2细胞中，不同浓度鸡血藤水煎液抑制磷酸化Smadl/5/8蛋白Westernblot结果和定量分析。
[0031]图2、鸡血藤水煎液抑制BMP6诱导的HepG2细胞HAMP表达。
[0032]⑷鸡血藤水煎液(20-400 μ g/mL)抑制BMP6 (10ng/mL, 12小时)诱导的H印cidinmRNA表达(O点)。
[0033](B)Western Blot分析磷酸化蛋白Smadl/5/8表达及定量。
[0034]图3、鸡血藤水煎液抑制IL-6诱导的HepG2细胞HAMP表达。
[0035](A) IL-6 (50ng/mL)或 BMP6 (10ng/mL)单独处理 6 小时后，Hepcidin mRNA 表达量分别升高2倍和7倍；与鸡血藤水煎剂(200 μ g/mL)作用12小时后，IL-6处理组H印cidinmRNA表达量下降至正常对照组的0.8倍，BMP6降低至0.25倍。鸡血藤水煎剂对BMP6的抑制作用强于IL-6。
[0036](B)Western blot 分析憐酸化 Smadl/5/8 和憐酸化 Stat3。
[0037](C)定量分析磷酸化Smadl/5/8蛋白表达水平。
[0038](D)定量分析磷酸化Stat3蛋白表达水平。
[0039]图4、鸡血藤水煎液抑制小鼠体内HAMPl基因表达和增加铁动员。[0040](A) C57BL/6小鼠肝脏H印cidin mRNA表达量(鸡血藤给药剂量21.6g/Kg饲料)，服药后第5天，Hepcidin表达量明显降低(P〈0.05), 10-15天逐步恢复至正常。
[0041](B)血清铁含量升高:第5天升高至正常组的2倍，随后呈缓慢下降趋势，与对照组比较仍具有显著性差异(P〈0.05)。
[0042](C)肝组织铁含量降低:给药组每组下降超过10 μ g/g，与对照组比较有统计学意义(Ρ〈0.05)。
[0043](D)脾组织铁含量:未见明显变化趋势。
[0044]图5、鸡血藤水煎剂降低人血清H印cidin水平。
[0045](A)血清H印cidin含量:圆点代表健康志愿者，方框或三角形代表1DA患者。月艮食鸡血藤后第5天，血清H印cidin显著下降(Ρ〈0.01)，随后有上升趋势，但仍低于服药前(Ρ〈0.05)。
[0046](B)血清铁含量。
[0047](C)血清转铁蛋白饱和度。
[0048](D)血清铁蛋白:3名健康志愿者升高明显，而5名IDA患者未见明显变化。【具体实施方式】
[0049]能导致贫血的因素很多，包括营养缺乏、感染、遗传缺陷等等因素。其中，慢性炎症、溶血、造血功能障碍、缺铁、缺乏叶酸/维生素Β12等引发的贫血较为常见。缺铁性贫血是贫血的一类。
[0050]本发明人经过长期而广泛的研究`，通过基于细胞系筛选并通过动物、人体实验发现鸡血藤(Spatholobus suberectus Dunn的莖)(或其提取物)对于防治铁缺乏相关疾病具有极其优异的效果，且没有任何副作用。所述的鸡血藤可抑制铁调蛋白Ifepcidin的表达，从而可避免因Hepcidin过表达导致的缺铁性疾病。基于此完成了本发明。
[0051]鸡血藤(Caulis Spatholobi)或其提取物
[0052]鸡血藤:是双子叶植物纲、豆目、豆科、崖豆藤属的植物。茎皮纤维可作人造棉、造纸和编织的原料；藤供药用，有行气、扶风、活血的效用；根入药，有舒筋活血的功能，也有杀虫的作用。藤与根含酚性成分、氨基酸、糖类、树脂。
[0053]作为本发明的优选方式，所述的鸡血藤是:鸡血藤的茎(或称为藤)。
[0054]术语“本发明的组合物”指含有鸡血藤或其提取物的组合物或基本上由鸡血藤或其提取物组成的组合物。所述的提取物包括但不限于:水提取物或水性有机溶剂；优选地为水提取物。
[0055]如本文所用，所述的“水性有机溶剂”是指常规用于从中药中提取活性成分的水溶性溶剂，其是安全或没有毒性的。例如，所述的“水性有机溶剂”选自醇类或酮类，如乙醇、甲醇、丙酮等。
[0056]作为本发明的优选方式，所述的鸡血藤的水提取物如下制备:将鸡血藤药材用水浸泡1-10小时，煮沸后煎煮1-5小时，过滤收集药液；收集药渣重复煎煮步骤0-3次；合并药液，减压浓缩。
[0057]用途
[0058]为了论证鸡血藤的用途，本发明人筛选了 16种中草药，发现鸡血藤水煎液在体外通过降低pSmadl/5/8信号通路的磷酸化而明显抑制肝癌细胞系Hepcidin的表达。进一步动物试验证实，鸡血藤水煎液抑制肝脏Ifepcidin表达的同时，可以减少肝脏铁含量，增加外周血清铁浓度。在健康志愿者中，鸡血藤水煎液可增加血清铁、血清铁蛋白含量及提高转铁蛋白饱和度，从而改善铁代谢。这些结果，为鸡血藤治疗Ifepcidin升高性疾病提供了理论依据，同时也开创了以Hepcidin为靶点的中草药治疗方法。
[0059]铁调蛋白H印cidin是一种调节体内铁平衡的激素，它在维持铁稳定平衡方面起着重要作用。Hepcidin由肝脏特异性表达,并且通过与铁转运蛋白(Ferroportin)结合,诱导其发生降解从而降低铁的转运，并最终实现铁在肠道吸收或者肝脏、脾脏以及骨髓中的巨噬细胞铁释放的调节。H印cidin与慢性炎症性贫血(其中H印cidin表达异常升高)、难治性缺铁性贫血(其中H印cidin表达异常升高)、肾性贫血(其中H印cidin表达异常升高)的发生密切相关。
[0060]慢性病贫血是一种由于机体处于长期炎症状态下所引发的铁代谢紊乱疾病。该病的病因是体内的炎症因子上调H印cidin表达。H印cidin被认为是调节铁代谢的激素，它作用于铁转运蛋白(Ferroporlin),使后者内吞降解,减少了小肠细胞内铁向血液循环的转运，进而影响了铁吸收。慢性疾病时的高炎症因子状态会通过JAK2/STAT3途径促进肝细胞高表达Hepcidin，导致慢性病贫血时的铁代谢紊乱。
[0061]本发明提供了鸡血藤、或鸡血藤的提取物的用途，用于制备降低H印cidin的组合物；或者，用于制备预防、缓解或治疗缺铁性疾病的组合物。所述的缺铁性疾病包括:缺铁性贫血(包括:难治性缺铁性贫血(IRIDA))、慢性病性贫血、慢性炎症性贫血(ACI)、肾性贫血。
[0062]组合物
[0063]如本文所用，术语“本发明的组合物”包括药物组合物和饮食补充剂(如保健品组合物)，只要它们含有鸡血藤或其提取物作为提高血清铁含量的活性成分。
`[0064]通常，所述的饮食补充剂含l_60wt%，较佳地为9_30wt%的鸡血藤或其提取物；(b)食品上可接受的载体或赋形剂。
[0065]本发明还提供了一种药物组合物，含有:(a)有效量(如0.0001-50wt%)的鸡血藤或其提取物；以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。
[0066]本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
[0067]本发明中，“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)即有合理的效益/风险比的物质。
[0068]如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体:它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在Remington’ sPharmaceutical Sciences (Mack Pub.C0., N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分描述。在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。
[0069]从易于制备和给药的立场看，优选的药物组合物是固态组合物，尤其是片剂和固体填充或液体填充的胶囊。药物组合物的口服给药是优选的。
[0070]本发明所述的药物组合物的剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物体内的剂型都是可以的。比如可选自:片剂、胶囊、粉末、颗粒、糖浆、溶液、悬浮液、或气雾剂。其中鸡血藤或其提取物可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中。
[0071]本发明的鸡血藤或其提取物也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具中。通常，在本发明的药物组合物中，鸡血藤有效成分占总重量的l_60wt%，较佳地为9-30wt%，其余为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。
[0072]给药方式和剂型
[0073]本发明的药物组合物可以通过常规方法制成任何常规的制剂形式。
[0074]通常，当所述鸡血藤或其提取物用于上述用途时，它们可与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂混合，如溶剂、稀释剂等，而且可以用如下形式口服给药:片剂、胶囊、可分散的粉末、颗粒或悬浮液(含有如约0.05-5%悬浮剂)、糖浆(含有如约10-50%糖)、和酏剂(含有约20-50%乙醇)，或者以无菌可注射溶液或悬浮液形式(在等渗介质中含有约
0.05-5%悬浮剂)进行非肠胃给药。例如，这些药物制剂可含有与载体混合的约l_60wt%，通常约为9-30wt%的活性成分。
[0075]所用的活性成分的有效剂量可随所用的药物、给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化。然而，通常当本发明的鸡血藤或其提取物每天以约0.0001-100mg/kg动物体重的剂量给予时，能得到令人满意的效果，较佳地每天以1-3次分开的剂量给予，或以缓释形式给药。对大部分大型哺乳动物而言，每天的总剂量约为0.01-1OOOmg,较佳地约为l-500mg。适用于内服的剂量形式，包含与固态或液态药学上可接受的载体密切混合的约l-200mg的鸡血藤或其提取物。可调节此剂量方案以提供最佳治疗应答。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。
[0076]所述鸡血藤或其提取物可通过口服以及静脉内、肌内或皮下等途径给药；优选的是口服给药。固态载体包括:淀粉、乳糖、磷酸二钙、微晶纤维素、蔗糖和白陶土，而液态载体包括:无菌水、聚乙二醇、非离子型表面活性剂和食用油(如玉米油、花生油和芝麻油)，只要适合活性成分的特性和所需的特定给药方式。在制备药物组合物中通常使用的佐剂也可有利地被包括，例如调味剂、色素、防腐剂和抗氧化剂如维生素E、维生素C、BHT和BHA。
[0077]所述鸡血藤或其提取物也可肠胃外或腹腔内给药。还可在甘油、液体、聚乙二醇及其在油中的混合物中制备分散液。在常规储存和使用条件下，这些制剂中含有防腐剂以防止微生物的生长。
[0078]适应于注射的药物形式包括:无菌水溶液或分散液和无菌粉(用于临时制备无菌注射溶液或分散液)。在所有情况中，这些形式必须是无菌的且必须是流体以易于注射器排出流体。在制造和储存条件下必须是稳定的，且必须能防止微生物(如细菌和真菌)的污染影响。载体可以是溶剂或分散介质，其中含有如水、醇(如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇)、它们的适当混合物和植物油。
[0079]鸡血藤或其提取物还可与其它活性成分或药物联合给药。
[0080]当两种或两种以上的药物联合给药时，一般具有优于两种药物分别单独给药的效
果O[0081]本发明的主要优点在于:
[0082](I)首次发现了鸡血藤的作用靶点为铁调蛋白Hepcidin，其对于防治铁缺乏相关疾病具有极其优异的效果，且没有任何副作用。鸡血藤药理作用强，具有极好的药用前景。
[0083](2)可以从植物中获取鸡血藤提取物，在毒性低、服用方便的同时，还具有来源丰富，价格低廉，制备工艺简单的优点。
[0084]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
[0085]除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0086]1.材料和方法
[0087]1、中药材水煎剂的制备
[0088]所有中药材均购自上海万仕诚国药制品有限公司(2010)，产地及入药部位详见表1。准确称取各种中药材20g，蒸馏水IL室温浸泡药材2h，大火煮沸后小火煎煮2h，过滤收集药液，在药渣中注入IL蒸馏水，继续煎煮2h，过滤收集药液。将两次收集的药液合并，减压浓缩至40g/L(相当于每毫升含生药0.04克)浓度。使用前经0.22 μ m针孔滤器(Millpore)过滤。
[0089]表1、中药材的名称、产地及`用药部位
【权利要求】
1.一种鸡血藤(Caulis Spatholobi)的用途，其特征在于，用于制备降低体内Hepcidin水平及升高血清铁含量的组合物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于预防、缓解或治疗缺铁性疾病或由H印cidin分泌过多为病理特征的疾病。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的缺铁性疾病包括:缺铁性贫血、慢性炎症性贫血、肾性贫血。
4.如权利要求2或3所述的用途，其特征在于，所述的缺铁性疾病是Hepcidin过表达导致的缺铁性疾病。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于: 降低编码H印cidin的基因——HAMP基因的表达；或 降低Smad蛋白的磷酸化水平； 抑制BMP6对H印cidin表达的刺激作用；或 抑制IL-6对Hepcidin表达的诱导作用。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的组合物还用于: 升高血清铁蛋白含量；或 提高血清转铁蛋白饱和度。
7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的鸡血藤选自下组: (a)鸡血藤药材或其粉碎产物；或 (b)鸡血藤的水或有机溶剂提取物。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的鸡血藤的水提取物如下制备: 将鸡血藤药材用水浸泡1-10小时，煮沸后煎煮1-5小时，过滤收集药液；收集药渣重复煎煮步骤0-3次；合并药液，减压浓缩。
9.一种用于降低体内Ifepcidin水平及升高血清铁含量的中药制剂，其通过以下方法制备获得:将鸡血藤药材用水浸泡1-10小时，煮沸后煎煮1-5小时，过滤收集药液；收集药渣重复煎煮步骤0-3次；合并药液，减压浓缩。
10.一种降低体内Ifepcidin水平及升高血清铁含量的方法，其特征在于，包括步骤--给需要的对象施用有效量的鸡血藤。
【文档编号】A61P5/00GK103720748SQ201210384580
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年10月11日 优先权日:2012年10月11日
【发明者】王福俤, 管宇, 安鹏 申请人:中国科学院上海生命科学研究院