专利名称：一种重组l-阿拉伯糖异构酶及其基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种重组L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinoseisomerase)及其基因和制备方法，以及利用该酶制备D-塔格糖(D-tagatose)的方法。
背景技术：
塔格糖是一种在自然界中存在较少的单糖，在苔藓、地衣等低等植物以及加热过的牛乳、乳粉、酸乳、干酪等乳制品中有少量存在。塔格糖是一种己酮糖，其甜度为蔗糖的92%，而热量值只有1. 5kcal/g。纯净的塔格糖为白色无水晶体物质，无臭，熔点134°C。塔格糖具有良好的功能特性，如糖尿病人食用后可以抑制和减缓血糖的升高；在加热和烘烤过程中发生美拉德反应，产生良好色泽，可以作为蔗糖的替代品或和其它甜味剂复配使用；进入结肠后，被其中的微生物菌群选择性发酵，促进有益菌增殖，抑制有害菌生长，明显改善肠道菌群，是一种很好的益生素。大量的安全毒理学试验表明，塔格糖安全无毒，因此被美国FDA批准为GRAS (generally regarded as safe),目前被允许作为甜味剂加入食品、饮料、保健品等中。塔格糖的生产方法包括天然提取分离法、化学催化合成法以及生物转化法等。塔格糖是一种较为罕见的单糖，在自然界的含量极低，提取分离成本高，不适宜工业化大生产。化学催化法也存在许多不利的因素，如化学污染物多，副产物多，分离困难等。因此，近年来对塔格糖生产的研究主要集中在生物转化法上。研究发现L-阿拉伯糖异构酶(EC5.3. 1.4, L-arabinose isomerase, L-AI)可以催化D-半乳糖转化生成D-塔格糖,是目前生物法生产D-塔格糖最为有效的途径。D-塔格糖的工业化生产要求L-阿拉伯糖异构酶的最适反应pH最好在5. 0 6. 0之间，最适反应温度最好在60 80°C之间，这有利于提高反应速度，减少非特异性反应 ，避免褐变反应。然而，目前报道的天然L-阿拉伯糖异构酶无法同时在pH和温度等方面满足工业化生产的要求。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对天然L-阿拉伯糖异构酶无法同时在pH和温度等方面满足生物转化法生产D-塔格糖的要求，提供一种重组L-阿拉伯糖异构酶及其基因和制备方法，以及利用该酶制备D-塔格糖的方法。本发明的第一方面是提供一种重组L-阿拉伯糖异构酶，它的氨基酸序列是序列表中SEQ ID No. 2所示。本发明第二方面提供一种重组L-阿拉伯糖异构酶基因，它的核苷酸序列是以下的任何一种I)序列表中SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；2)编码氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示蛋白的核苷酸序列。本发明中，SEQ ID No.1所示核苷酸序列全长1488，编码496个氨基酸，所用密码子有利于该基因在枯草芽孢杆菌(Bacillus subti I is)中表达。
本发明中，氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示的蛋白为L-阿拉伯糖异构酶。所有编码该氨基酸序列的核苷酸序列都在本发明的范围之内。本发明的第三方面是提供含有如上所述的重组L-阿拉伯糖异构酶的重组载体。所述的重组载体所用的载体是本领域的常规载体，包括克隆载体和表达载体。较佳的如克隆载体pUC57。也可以是大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭载体，较佳的如穿梭载体pMA5。本发明的第四方面是提供含有如上所述的重组载体的转化子。所述的转化子的宿主细胞是本领域常规的宿主细胞，如大肠杆菌，优选枯草芽孢杆菌，更优选枯草芽孢杆菌WB600。该转化子较佳的是表达重组L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌，优选枯草芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌WB600。本发明的第五方面提供一种制备表达重组L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌的方法，包括以下步骤I)合成氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示的L-阿拉伯糖异构酶的基因；2)将步骤I)的L-阿拉伯糖异构酶的基因克隆入枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体中构建重组载体，然后将重组载体导入枯草芽孢杆菌表达菌株获得重组枯草芽孢杆菌，即得表达L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌。本发明中，步骤I)所述的合成氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的L-阿拉伯糖异构酶的基因的方法是常规方法，可以人工合成基因。所述的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的L-阿拉伯糖异构酶的基因的核苷酸序列可以是任何编码SEQ ID No. 2所示氨基酸序列的核苷酸序列，较佳的是序列表中SEQID No.1所示的核苷酸序列。所述的枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体优选质粒PMA5。所述的枯草芽孢杆菌表达菌株优选枯草芽孢杆菌WB600。本发明的 一较佳实施例是利用引物扩增获得所述的L-阿拉伯糖异构酶的基因。该方法是本领域的常规方法，以步骤I)所合成的L-阿拉伯糖异构酶基因为模板扩增得到L-阿拉伯糖异构酶基因。所述的引物是上游引物TG_F的序列为Sy-GGAATTCCATATGATGCTGTCATTACGTCC-3’，下游引物 TG_R 的序列为 5’ -GAGGATCCTTACCGCCCCCGCCAGAATACT-3’ ;分别具有Nde I和BamH I酶切位点。本发明所述的将L-阿拉伯糖异构酶基因克隆入枯草芽孢杆菌表达载体的克隆方法是本领域常规方法。较佳的，如上利用引物TG_F和TG_R扩增获得L-阿拉伯糖异构酶基因，通过Xho I和Xba I酶切位点构建含有L-阿拉伯糖异构酶基因的重组载体pMA5-araA，然后用电转化法将其导入枯草芽孢杆菌中，利用卡那霉素抗性筛选重组菌株，最后诱导重组枯草芽孢杆菌表达L-阿拉伯糖异构酶。本发明的第六方面提供一种重组L-阿拉伯糖异构酶的制备方法，包括培养本发明所述的转化子，从发酵产物中分离重组L-阿拉伯糖异构酶。较佳的所述的转化子是枯草芽孢杆菌。本发明的第七方面提供一种生物转化法生产D-塔格糖的方法，包括采用L-阿拉伯糖异构酶催化D-半乳糖转化生成D-塔格糖，其中，所用的L-阿拉伯糖异构酶是氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示的重组L-阿拉伯糖异构酶。该重组L-阿拉伯糖异构酶优选用本发明所述的方法制备而得。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。
相比于现有技术，本发明的有益效果如下本发明提供一种L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinose isomerase, L-AI)及其基因和制备方法，以及利用该酶制备塔格糖的方法。尤其用枯草芽孢杆菌表达L-阿拉伯糖异构酶，获得了具有生物活性的重组L-阿拉伯糖异构酶，该酶更有利于塔格糖的工业化生产。本发明的方法具有简单、高效、周期短的特点。
以下结合
本发明的特征和有益效果。图1为扩增araA基因的琼脂糖凝胶电泳图，其中，1、2、3 araA基因(引物物TG_F 和 TG_R)，M :分子量 Marker DL2000。图2为重组质粒的酶切鉴定电泳图，其中，Ml :分子量Marker DL2000, M2 :分子量Marker DL5000,1 :经 Nde I 酶切的 pMA5-araA, 2 :经 BamHI 酶切的 pMA5-araA, 3 :经 Nde I和BamH I双酶切的pMA5_araA,4 :未酶切的pMA5_araA。图3为重组L-阿拉伯糖异构酶SDS-PAGE检测结果，其中，M :蛋白质分子量标准(宽)，I 9 :重组质粒pMA5-araA转化WB600的重组菌株，10 :宿主菌WB600。图4为pH和温度对L-阿拉伯糖异构酶活性的影响，A pH的影响，B :温度的影响。图5为反应时间对L-阿拉伯糖异构酶转化率的影响。
具体实施方式
本发明对已报道的L-阿拉伯糖异构酶的氨基酸序列进行比对、分析和拼接，重构了其氨基酸序列，并对其基因进行了密码子优化，以利于其在枯草芽孢杆菌中的高效表达，从而得到了能够高效表达L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌。枯草芽孢杆菌发酵容易，可以简单、高效、周期短的大量生产L-阿拉伯糖异构酶。本发明获得的L-阿拉伯糖异构酶可以催化D-半乳糖转化生成D-塔格糖，并且在pH5. 0 10. 0，30 80°C的反应条件下均具有较高的催化活性，能够同时满足工业化生产对L-阿拉伯糖异构酶反应pH和温度的要求。下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1重组质粒pMA5_araA的构建I)从NCBI网站获得已报道的L-阿拉伯糖异构酶氨基酸序列，经CluxtalX软件比对分析、拼接和密码子优化，获得了有利于在枯草芽孢杆菌中表达的L-阿拉伯糖异构酶基因，其序列见序列表SEQ ID NO.1所示。对优化后的基因采用化学合成的方法进行全基因合成，把合成的基因连接到克隆载体pUC57(购自上海闪晶)上得克隆载体pUC57-araA，序列测定验证完全正确(委托上海闪晶生物合成)。2)设计用于PCR扩增L-阿拉伯糖异构酶的引物，上游引物TG_F的序列为5’_GGAATTCCATATGATGCTGTCATTACGTCC-3’，下游引物 TG_R 的序列为 5，-GAGGATCCTTACCGCCCCCGCCAGAATACT-3’ ；分别具有Nde I和BamH I酶切位点。3)以含有密码子优化的araA基因的克隆载体pUC57_araA为模板，利用引物TG_F和TG_R在LA Taq (TaKaRa)的催化下进行PCR扩增，获得1. 5kb的L-阿拉伯糖异构酶基因片段。扩增的程序为94°C预变性5min ;94°C变性30s，58。。退火45s，72。。延伸1. 5min，共30个循环；72°C再延伸lOmin。扩增结果如图1所示。
4)用Nde I和BamH I对扩增的araA基因片段和穿梭载体pMA5 (Dartois V, CoppeeJY, Colson C and Baulard A. Genetic analysis and overexpression of lipolyticactivity in Bacillus subtilis. Appl Environ Microb. 1994 ;60 :1670-1673)进行双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收目的片段，利用T4连接酶(TaKaRa)于16°C过夜连接，连接产物转化E. coli DH5 a并涂布于含有I00mg/L氨苄青霉素的LB琼脂平板，37°C培养12 16h。5)挑取抗性平板上生长的单菌落10个接种于5mL含有100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中，200rpm 37°C条件下过夜培养，提取质粒，以Nde I和BamH I进行双酶切鉴定，得到含有araA基因的重组质粒pPMA5_araA，对酶切正确的质粒进行测序，酶切电泳结果如图2所示。实施例2重组枯草芽孢杆菌的构建及L-阿拉伯糖异构酶的诱导表达I)制备WB600感受态细胞，具体步骤包括a.接种WB600(Wu XC,Lee W,Tran L,ffong SL. Engineering a Bacillus subtilisexpression-secretion system with a strain deficient in six extracellularproteases. J Bacteriol. 1991 ; 173 (16) :4952-4958)于 3mL 液体培养基(含 0. 5mol/L 山梨醇的LB)中，200rpm 37°C过夜培养。b.取2mL过夜培养物，接种于含有40mL液体培养基(含0. 5mol/L山梨醇的LB)中，200rpm 37 °C 培养至 0D600 = 0.85 0.95。c.在4°C下，5000g离心5min收集细胞,用50mL预冷的电击缓冲液(0. 5mol/L山梨醇，0. 5mol/L甘露醇，10%葡萄糖)悬浮菌体，如此漂洗4次。d.如上离心，用ImL预冷的电击缓冲液悬浮细胞，按60 ii L/管分装。2)重组质粒pMA5_araA电转化WB600，具体步骤包括a.混合60li L感受态细胞和约50ng重组质粒pMA5_araA并转移至0°C预冷的0.1cm电击杯，冰上静置5min。c.根据BioRad电转化仪操作手册进行电转化，电击参数为电压2. 5KV，电阻200 Q ,电容 20kF。d.电击结束后立刻加入ImL冰冷的复苏培养基(含0. 5mol/L山梨醇和0. 38mol/L甘露醇的LB)至电击杯并转移至离心管中。e.将离心管于37°C 200rpm下温育3h。f.以100-300 u L/平板涂布于含30mg/L卡那霉素的LB平板，37°C培养至单菌落形成。3)利用引物 TGI (5 ’ -ATACTACCTGTCCCTTGCTG-3 ’)和TG2 (5’-GGAAACGGTGTCCTAAGTC-3’)进行菌落PCR鉴定，菌落PCR的模板为经冻融法处理的菌体，扩增条件为94°C预变性5min ;94°C变性30s，58。。退火45s，72。。延伸1. 5min，共30个循环；72°C再延伸lOmin。4)分别挑取PCR鉴定且测序正确的单菌落，接种于2mL含30mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37°C 200rpm振荡培养过夜。按2%的接种量转接于20mL含30mg/L卡那霉素的LB培养基中，200rpm振荡培养24h后将发酵液8000g下离心5min，弃上清，菌体用于SDS-PAGE检测，结果如图3所示。实施例3L-阿拉伯糖异构酶制备塔格糖的条件优化
I) L-阿拉伯糖异构酶活力测定取发酵培养后的菌体，按100mg/ml的浓度悬浮于70mM Tris-HCl (pH7. 6)缓冲液中，加入100mg/ml底物半乳糖，60°C振荡反应lh，12000rpm离心5min收集上清液，适当稀释后利用改进的半胱氨酸-咔唑法测定560nm处的吸光值变化，具体步骤如下a.取0，0. 2，0. 4，0. 6，0. 8mL塔格糖标准液(50mg/L)于具塞试管中，用蒸馏水补足到1. OmL。b.取25mL具塞试管，分别加入1. OmL适当稀释的反应液及对照液，然后每管中加A6. OmL 70% (V/V)的硫酸溶液，0. 2mL 1.5% (W/V)的半胱氨酸盐酸盐溶液，摇匀，立即加A 0. 2mL 0. 12% (W/V)的咔唑酒精溶液，剧烈振荡后于60°C水浴中反应lOmin，立即取出，冰浴冷却5min,用IOmm光径的比色皿在560nm波长下比色。2)反应体系pH对L-阿拉伯糖异构酶制备塔格糖的影响取发酵培养后的菌体，按100mg/ml的浓度分别悬浮于pH3 10的缓冲液中。加A 100mg/ml半乳糖，60°C振荡反应lh, 12000rpm离心5min收集上清液,适当稀释后利用半胱氨酸-咔唑法测定L-阿拉伯糖异构酶的活力，以最大酶活为100%，计算相对酶活力。检测pH3 10的酶活,酶活值最大点的酶活即为最大酶活，以此为100%，计算其他点和最大点的比值得到相对酶活。结果见图4(A)。重组枯草芽孢杆菌表达的L-阿拉伯糖异构酶在pH3 10的范围内均具有活性，其最适反应pH为6. 0，在pH5. 0 10. 0的范围内均具有较高的催化活性。3)温度对L-阿拉伯糖异构酶制备塔格糖的影响取发酵培养后的菌体，按100mg/ml的浓度悬浮于70mM Tris-HCl (pH7. 6)缓冲液中，加入100mg/ml底物半乳糖,分别在30 80°C下振荡反应lh, 12000rpm离心5min收集上清液，适当稀释后利用半胱氨酸-咔唑法测定560nm处的吸光值变化。结果见图4(B)。在30 80°C的反应条件下，重组枯`草芽孢杆菌表达的L-阿拉伯糖异构酶的酶活性随着温度的升高而增大。4)反应时间对L-阿拉伯糖异构酶制备塔格糖的影响取发酵培养后的菌体，按100mg/ml的浓度悬浮于70mM Tris-HCl (pH7. 6)缓冲液中，加入100mg/ml底物半乳糖，分别在70°C下振荡反应，12000rpm离心5min收集2，4，6，8，IOh的上清液，适当稀释后利用半胱氨酸-咔唑法测定560nm处的吸光值变化。结果见图5。在IOh内，重组枯草芽孢杆菌表达的L-阿拉伯糖异构酶对半乳糖的转化率随着时间的增加而增加。应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海医药工业研究院；中国医药工业研究总院 〈120〉一种重组L-阿拉伯糖异构酶及其基因和应用
〈130〉P4-111802C
<160〉2
<170〉PatentIn version 3.4
<210>I
〈211〉1491
<212〉DNA <213〉人工序列
<220〉
<223〉重组L-阿拉伯糖异构酶 〈220〉
<221〉 CDS <222〉(1).. (1491)
<400〉 1
atg ctg tea tta cgtcct tat gaa ttt tggttt gtg aca gga agt cag48
Met Leu Ser Leu Arg Pro Tyr Glu Phe Trp Phe Val Thr Gly Ser Gln151015
cac ttg tac gga gaa gaa gcg tta aaa caa gtc gaa gaa cat tea aga96
His Lcu Tyr Gly Glu Glu Ala Leu Lys Gln Val Glu Glu His Ser Arg202530
ate atg gtc aat gaa tgg aat cgc gat tcg gtg ttt ccg ttc cca ttc144
He Met Val Asn Glu Trp Asn Arg Asp Ser Val Phe Pro Phe Pro Phe 354045
gtt ttc aaa tea gtc gtg acg acg cca gag gaa ate egg cgc gtt tgc192
Val Phe Lys Ser Val Val Thr Thr Pro Glu Glu He Arg Arg Val Cys505560
ctt gag gcg aat gcg age gaa caa tgc get ggg gtc ate act tgg atg 240
权利要求
1.一种重组L-阿拉伯糖异构酶，其特征在于，其氨基酸序列是序列表中SEQ ID No. 2所示。
2.一种重组L-阿拉伯糖异构酶基因，其特征在于，其核苷酸序列是以下的任何一种 1)序列表中SEQID No.1所示的核苷酸序列； 2)编码氨基酸序列如序列表中SEQID No. 2所示蛋白的核苷酸序列。
3.含有如权利要求2所述的重组L-阿拉伯糖异构酶基因的重组载体。
4.含有如权利要求3所述的重组载体的转化子。
5.一种制备表达重组L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌的方法，其特征在于，包括以下步骤 1)合成氨基酸序列如序列表中SEQID No. 2所示的L-阿拉伯糖异构酶的基因； 2)将步骤I)的L-阿拉伯糖异构酶的基因克隆入枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体中构建重组载体，然后将重组载体导入枯草芽孢杆菌表达菌株获得重组枯草芽孢杆菌，即得表达L-阿拉伯糖异构酶的基因工程菌。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤I)所述的L-阿拉伯糖异构酶的基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。
7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的枯草芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭载体是质粒pMA5 ;所述的枯草芽孢杆菌表达菌株是枯草芽孢杆菌WB600。
8.—种重组L-阿拉伯糖异构酶的制备方法，其特征在于，包括培养如权利要求4所述的转化子，从发酵产物中分离重组L-阿拉伯糖异构酶。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的转化子是枯草芽孢杆菌。
10.一种生物转化法生产D-塔格糖的方法，包括采用L-阿拉伯糖异构酶催化D-半乳糖转化生成D-塔格糖，其特征在于，所用的L-阿拉伯糖异构酶是氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示的重组L-阿拉伯糖异构酶。
全文摘要
本发明公开了一种重组L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinose isomerase，L-AI)及其基因和制备方法，以及利用该酶制备D-塔格糖(D-tagatose)的方法。尤其用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)表达L-阿拉伯糖异构酶，获得了具有生物活性的重组L-阿拉伯糖异构酶，该酶更有利于塔格糖的工业化生产。本发明的方法具有简单、高效、周期短的特点。
文档编号C12N15/63GK103045575SQ20111031297
公开日2013年4月17日 申请日期2011年10月14日 优先权日2011年10月14日
发明者朱宝泉, 林军, 胡海峰, 胡又佳 申请人:上海医药工业研究院, 中国医药工业研究总院