专利名称：米黑根毛霉菌株及其在制备β-葡聚糖酶和凝乳酶中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种米黑根毛霉菌株及其在制备β -葡聚糖酶和凝乳酶中的应用。
背景技术：
β-葡聚糖(Glucan)是以葡萄糖为单体形成的高分子聚合多糖，广泛存在于植物和微生物的细胞壁中。葡聚糖酶(Glucanase)是一类重要的水解酶，作用于β-葡聚糖的I，3及I，4糖苷键；该酶可以有效分解麦类和谷类植物胚乳细胞壁中的β -葡聚糖；在饲料中可降低非淀粉多糖(NSP)及其抗营养因子的含量，改善畜禽对营养物质的吸收，提高畜禽的生长速度和饲料转化效率；在啤酒酿造上用于降低麦汁黏度，改善过滤性能，提高麦芽溶出率，防止啤酒浑浊，稳定啤酒质量等。迄今,微生物发酵产β -葡聚糖酶发酵的研究主要集中于木霉(Trichoderma)、曲霉(Aspergillus)和芽孢杆菌(Bacillus),而芽孢杆菌中研究较多的是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)和嗜喊芽抱杆菌(alkalophilic Bacillus sp.),且以枯草芽孢杆菌产酶活性最高。真菌发酵β_葡聚糖酶是以中温菌木霉和黑曲霉为主。嗜热真菌发酵产耐热β_葡聚糖酶的研究报道较少。凝乳酶(chymosin, EC3. 4. 23. 4)是一种从未断奶的小牛皱胃中发现的天门冬氨酸蛋白酶，其主要的生物学功能是有限切断酪蛋白的K-酪蛋白的Phe-Metl06连接的肽键，导致牛奶凝结，被广泛应用于干酪制造业，是食品领域中重要的酶制剂。凝乳酶的传统制备方法是从刚出生的小牛皱胃中提取，传统的提取方法与现代工业发展极不协调。研究者不断寻找新的凝乳酶来源 ，主要包括动物性凝乳酶、植物性凝乳酶及微生物凝乳酶。微生物生产周期短，产量大，生产凝乳酶的成本较低、酶提取方便。目前微生物凝乳酶应用最多的是微小毛霉(Mucor pusillus)产生的凝乳酶。国内外关于天然微生物液体发酵生产凝乳酶的专利申请较少，且产酶量偏低。目前生产凝乳酶水平普遍偏低，生产周期长和发酵成本较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种米黑根毛霉菌株及其在制备β -葡聚糖酶和凝乳酶中的应用。米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)CAU432已于2011年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No. 4967。米黑根毛霉(Rhizomucor miehei) CAU43 2CGMCC No. 4967 简称米黑根毛霉 CAU432。本发明还保护一种用于培养所述米黑根毛霉CAU432的培养基，由碳源、氮源、无机盐和水组成；所述碳源为如下物质中的至少一种甘蔗皮、玉米苞皮、玉米杆、燕麦(优选)、麦麸、甘蔗渣、玉米芯、啤酒酒糟、稻壳、可溶性淀粉、几丁质、高粱杆、白酒酒糟、麸皮、稻草和葡萄糖；所述氮源为如下物质中的至少一种酵母提取物、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏蛋白胨(优选)、豆柏粉、黄豆粉(优选)、脱脂奶粉、蛋白胨、尿素、磷酸氢二铵、硫酸铵、酵母提取物和胰蛋白胨等质量混合得到的酵母蛋白胨混合物、硝酸铵和大豆蛋白胨；所述无机盐为如下物质中的至少一种KH2P04、MgSO4和CaCl2。所述培养基的pH可为自然pH或 pH 5. 0-7. O (如 pH 5. O, pH 6. O 或 pH 7. O)。所述培养基可由所述碳源、所述氮源、KH2PO4, MgSO4, CaCl2和水组成。所述培养基优选为如下(a)至(d)中任一所述的培养基(a)将所述碳源10g_50g(0. 45-0. 9mm粒径范围或O. 18-0. 3mm粒径范围的粉末)(如 10g、20g、30g、40g 或 50g)、氮源 10g、KH2PO4 5g、MgSO4 · 7H20 O. 3g 和 CaCl2 0. 3g 溶于水并用水定容至IL得到的培养基；(b)将所述碳源(O. 45-0. 9mm粒径范围或O. 18-0. 3mm粒径范围的粉末)和基础培养液甲混合得到的培养基；所述基础培养液甲的制备方法为将所述氮源log、KH2PO4 5g、MgSO4 ·7Η20 O. 3g和CaCl2 0. 3g溶于水并用水定容至IL得到的培养基；所述培养基的初始含水量为70-90% (质量百分 含量)(如70%、75% (优选)、80%、85%或90% )；(c)将所述碳源(O. 45-0. 9mm粒径范围或O. 18-0. 3mm粒径范围的粉末)、所述氮源和基础培养液乙混合得到的培养基；所述基础培养液乙的制备方法为将CaCl2 O. 3g、KH2PO4 5g、MgSO4 · 7H20 O. 3g和吐温-80 0. 34g溶于水并用水定容至IL ;所述培养基的初始含水量为30-75% (质量百分含量)(如33.3%、50% (优选)、60%、66· 7%、71· 4% )；所述碳源和所述氮源的质量比为5 I ；(d)将所述碳源10g_50g(0. 45-0. 9mm粒径范围或O. 18-0. 3mm粒径范围的粉末)(如 10g、20g、30g、40g、50g)、所述氮源 IOg^KH2PO4 5g、MgS04 ·7Η200· 3g 和 CaCl2 O. 3g 溶于水并用水定容至2. 5L得到的培养基。本发明还保护一种制备β -葡聚糖酶和/或凝乳酶的方法，是采用所述培养基发酵所述米黑根毛霉CAU432，得到β -葡聚糖酶和/或凝乳酶。所述方法具体可为如下⑴至⑷中的任意一种(I)采用(a)所述培养基50°C振荡发酵所述米黑根毛霉CAU432，得到β -葡聚糖酶；所述发酵的时间为I天以上，优选为1-6天，最优选为3-5天；(2)采用(b)所述培养基50°C静置发酵所述米黑根毛霉CAU432，得到β -葡聚糖酶；所述发酵的时间为I天以上，优选为1-6天，最优选为3-5天；(3)采用(C)所述培养基37°C静置发酵所述米黑根毛霉CAU432，得到凝乳酶；所述发酵的时间为I天以上，优选为1-6天，最优选为2天；(4)采用(a)所述培养基37°C振荡发酵所述米黑根毛霉CAU432，得到凝乳酶；所述发酵的时间为I天以上，优选为1-6天，最优选为3-5天；(5)在发酵罐中采用⑷所述培养基发酵所述米黑根毛霉CAU432，得到β _葡聚糖酶；所述发酵的条件为40-55°C (如50°C )、通气量为l-2vvm(如1. 2vvm)、搅拌速率为300-600rpm(如 500rpm)、发酵时间为 IOh 以上(如 10_72h，优选 50h)。所述方法(I)和/或所述方法(5)还包括如下步骤将所述发酵得到的发酵液10000 Xg冷冻离心lOmin，取上清液，即为含有β-葡聚糖酶的溶液。所述方法(2)还包括如下步骤将所述发酵得到的固体发酵物加入50mM pH 6. O柠檬酸缓冲液，室温下200rpm震荡浸提2h，IOOOOXg冷冻离心lOmin，取上清液，即为含有β-葡聚糖酶的溶液。所述方法(3)还包括如下步骤将所述发酵得到的固体发酵物加入去离子水，37°C、200rpm震荡浸提2h，IOOOOrpm冷冻离心lOmin，取上清液，即为含有凝乳酶的溶液。所述方法(4)还包括如下步骤将所述发酵得到的发酵液IOOOOrpm冷冻离心lOmin，取上清液，即为含有凝乳酶的溶液。所述方法(I)和/或所述方法(2)和/或所述方法(5)还包括如下步骤将所述含有β -葡聚糖酶的溶液依次进行硫酸铵沉淀、DEAE52弱阴离子交换层析和QSFF强阴离子交换层析，得到纯化后的葡聚糖酶。以上任一所述方法得到的β -葡聚糖酶和/或凝乳酶也属于本发明的保护范围。所述葡聚糖酶作为葡聚糖酶的应用也属于本发明的保护范围。所述应用中，所述应用的反应条件可为40-65°C、pH 4. 0-7. O，优选为pH 5. 5、60°C。所述凝乳酶作为凝乳酶的应用也属于本发明的保护范围。米黑根毛霉CAU432具有很高的产β -葡聚糖酶的能力。摇瓶发酵培养产酶水平为2000-6500U/mL，固体发酵培养产酶水平为50000-55000U/g，5L发酵罐扩大培养50h酶活可达到5500-8000U/mL，是目前相关报道中的最高水平。米黑根毛霉CAU432发酵得到的β -葡聚糖酶，最适pH为5. 5,最适温度为60°C,该酶具有很好的温度稳定性,在70°C下处理30min后酶活力仍能保持80%以上。米黑根毛霉CAU432具有很高的产凝乳酶的能力，产酶水平可达105000U/g。米黑根毛霉CAU432具有产凝乳酶的能力。固体发酵培养产凝乳酶水平为105000U/g干基，液体发酵出产凝乳酶水平为5450U/mL。
本发明所提供的菌株米黑根毛霉CAU432耐热性好，且菌种稳定性好，产酶高，发酵成本低(利用的碳源和氮源易于购买，价格便宜)，生产周期短，适宜应用于工业化生产领域，具有较好的工业化应用前景。
图1为发酵时间对米黑根毛霉CAU432摇瓶液体发酵产β -葡聚糖酶活性的影响。图2为米黑根毛霉CAU4325L发酵罐产β -葡聚糖酶过程曲线。图3为β _甸聚糖酶的纯化过程中的蛋白电泳图；1:粗酶液；2 :粗蛋白；3 :DEAE52弱阴离子交换层析纯化后的蛋白；4和5 =QSFF强阴离子交换层析纯化后的蛋白。图4为β -葡聚糖酶的最适pH。图5为β -葡聚糖酶的pH稳定性。图6为β -葡聚糖酶的最适温度。图7为β -葡聚糖酶的温度稳定性。图8为发酵时间对米黑根毛霉CAU432固体发酵产凝乳酶酶活性的影响。图9为碳源种类对米黑根毛霉CAU432液体发酵产凝乳酶酶活性的影响。图10为氮源种类对米黑根毛霉CAU432液体发酵产凝乳酶酶活性的影响。图11为米黑根毛霉CAU432摇瓶发酵产凝乳酶过程曲线。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。酵母提取物、胰蛋白胨，购自英国Oxoid公司。琼脂、大豆蛋白胨、牛肉膏蛋白胨、酪蛋白、豆柏粉、尿素、可溶性淀粉等购自北京康明威培养基技术有限责任公司。kh2po4、MgSO4 · 7H20、CaCl2、NaOH、苯酚、Na2S03、CuSO4 · 5H20、酒石酸钾、Na2CO3、脱氧胆酸钠、三氯乙酸，均为分析纯，购自北京化工厂。3，5_ 二硝基水杨酸购自上海远帆制剂厂。大麦β-葡聚糖、葡萄糖购自Sigma公司。脱脂奶粉(脱脂粉)购自完达山股份有限公司。几丁质购自青岛海洋奇力生物工程有限公司。蛋白胨购自北京奥博星生物技术有限公司。燕麦、甘蔗皮、稻草、玉米苞皮、麸皮、白酒酒糟、玉米杆、高粱杆、麦麸、甘蔗渣、稻壳、玉米芯和啤酒酒糟均粉碎后过筛，取粉末用作培养基的制备。活化培养基的配制方法燕麦(O. 18-0. 3mm粒径范围的粉末)10g、酵母提取物5g、胰蛋白胨 5g、KH2PO4 5g、MgSO4 · 7H20 O. 3g, CaCl2 0. 3g、琼脂 20g，加水到 1L，自然 pH。种子培养基的配制方法燕麦(O. 18-0. 3mm粒径范围的粉末)10g、酵母提取物5g、胰蛋白胨 5g、KH2PO4 5g、MgSO4 · 7H20 O. 3g、CaCl2 0. 3g，加水到 1L，自然 pH。采用DNS法测定β -葡聚糖酶酶活。反应原理3，5_ 二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和棕红色物的颜色深浅呈一定比例关系，在540nm波长下测定棕红色物质的吸光度值，便可求出样品中还原糖的含量。描述DNS法测定β-葡聚糖酶酶活的参照文献Miller.，et al. 1959. Use ofdinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars. AnalyticalChemistry. 1959，31 :426-428.。
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凝乳酶酶活测定的参考文献Arima(ArimaK，Yu J，Iwasaki S. Milk-clottingenzyme from Mucorpussilus. Methods in Enzymology Academic，1970，19(3) :446-460.。采用Lowry法测定蛋白质含量。描述Lowry法测定蛋白质含量的参考文献Lowry,0. H. Rosebrough, N. J.，Farr, A. L. and Randall，R. J. Protein measurement with thefolin phenol reagent. Biol. Chem.，1951，193 :265_275。实施例1、菌株的分离和鉴定一、菌株的分离本发明提供的米黑根毛霉CAU432是从土壤中筛选得到的。分离培养基的配制方法燕麦(O. 18-0. 3mm粒径范围的粉末)20g,大豆蛋白胨10g、KH2PO4 5g、MgSO4 · 7H20 O. 3g、CaCl2 0. 3g、琼脂 20g、加水到 1L，自然 pH。初筛培养基的配制方法燕麦(O. 18-0. 3mm粒径范围的粉末)20g，大豆蛋白胨IOg^KH2PO4 5g、MgS04.7H20 0. 3g、CaCl2 0. 3g、刚果红 0. 05g、琼脂 20g，加水到 1L，自然 pH。发酵培养基的配制方法燕麦(0. 18-0. 3mm粒径范围的粉末)20g，大豆蛋白胨10g、KH2PO4 5g、MgSO4 · 7H20 0. 3g、CaCl2 0. 3g，加水到 1L，自然 pH。新鲜土样稀释后涂布于分离培养基中，在50°C恒温培养箱中培养。待分离培养基中有菌落长出，将菌株接种到初筛培养基，凡在菌落周围能使刚果红褪色形成透明圈的菌株，接种到发酵培养基；培养条件5(TC、200rpm、36h。发酵结束后取ImL发酵液于1. 5mL离心管中，离心(12000rpm、IOmin)取上清,测定β _葡聚糖酶及凝乳酶酶活。筛选得到一株酶活较高的菌株，将其命名为菌株CAU432。二、菌株的鉴定菌株CAU432的形态特征在麦芽 汁平板培养基上生长良好，最适生长温度为50-550C ;菌丝体呈深灰色，但在光照下培养颜色变浅；在显微镜下观察孢子形态为椭圆形，直径可以高达50 μ m ;在没有硫胺素存在的SMA培养基(标准琼脂培养基)上生长，不会产生孢子。菌株CAU432的18S rDNA测序结果见序列表的序列I。综合形态特征和测序结果，将菌株CAU432鉴定为米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)。米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)CAU432已于2011年6月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCjia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCNo. 4967。米黑根毛霉(Rhizomucor miehei) CAU432CGMCC No. 4967 简称米黑根毛霉 CAU432。实施例2、摇瓶发酵制备β -葡聚糖酶的条件优化—、发酵培养基中碳源的筛选本步骤中的发酵培养基的配制方法碳源IOg(0. 45-0. 9mm粒径范围的粉末)、蛋白胨 IOg^KH2PO4 5g、MgS04 · 7H20 O. 3g、CaCl2 O. 3g，加水到 1L，自然 pH。分别采用如下 15种碳源甘蔗皮、玉米苞皮、玉米杆、燕麦、麦麸、甘蔗渣、玉米芯、啤酒酒糟、稻壳、可溶性淀粉、几丁质、高粱杆、白酒酒糟、麸皮和稻草。1、菌种活化将保存的米黑根毛霉CAU432在活化培养基平板上进行活化。2、种子液制备将活化后的新鲜菌株接种到种子培养基中，50°C恒温空气浴往复式摇床上以200rpm振荡培养24h，得到种子液，种子液的湿重约等于0. lg/mL。3、摇瓶液体发酵产β-葡聚糖酶在250mL三角瓶中装入50mL发酵培养基，然后接种步骤2的种子液，接种量为2% (体积百分比)；在501恒温空气浴往复式摇床上以200rpm振荡培养72h。取发酵液12000 Xg冷冻离心lOmin，取上清液(粗酶液)，进行葡聚糖酶酶活测定。β -葡聚糖酶酶活的具体测定方法取100 μ L待测溶液(或其稀释液)，加入到900 μ L底物溶液(由大麦β -葡聚糖和50mM pH 6. O柠檬酸缓冲液组成；大麦β -葡聚糖的浓度为0. 5g/100mL)中，60°C水浴反应IOmin后加入ImL DNS试剂(将Ig 3,5- 二硝基水杨酸、Ig NaOH,0. 2g苯酚溶于蒸馏水并定容至IOOmL,即为贮存液；使用前在贮存液中加入无水亚硫酸钠，使其浓度为0. 05g/100mL)，煮沸15min后加入ImL饱和酒石酸钾钠溶液，冷却后测定540nm吸光度值。用不同浓度的葡萄糖水溶液制作标准曲线。将每分钟生成I μ mol葡萄糖所需要的酶量定义为I个酶活性单位(U)。根据540nm吸光度值计算待测溶液的酶活力的公式如下Y = (1. 0585*χ-0· 0394)*1000*Ν/180· 16，Y代表酶活性(单位为U)，X代表540nm吸光度值，N代表稀释倍数。采用各个碳源的培养基得到的粗酶液的β -葡聚糖酶酶活见表I。
表I碳源对米黑根毛霉CAU432固体发酵产β -葡聚糖酶活性的影响
权利要求
1.米黑根毛霉(Rhizomucormiehei) CAU432，其保藏编号为 CGMCC No. 4967。
2.用于培养权利要求1所述米黑根毛霉的培养基，由碳源、氮源、无机盐和水组成；所述碳源为如下物质中的至少一种甘蔗皮、玉米苞皮、玉米杆、燕麦、麦麸、甘蔗渣、玉米芯、啤酒酒糟、稻壳、可溶性淀粉、几丁质、高粱杆、白酒酒糟、麸皮、稻草和葡萄糖；所述氮源为如下物质中的至少一种酵母提取物、胰蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉膏蛋白胨、豆柏粉、黄豆粉、脱脂奶粉、蛋白胨、尿素、磷酸氢二铵、硫酸铵、酵母提取物和胰蛋白胨等质量混合得到的酵母蛋白胨混合物、硝酸铵和大豆蛋白胨；所述无机盐为如下物质中的至少一种KH2PO4、MgSO4 和 CaCl2。
3.如权利要求2所述的培养基，其特征在于所述培养基由所述碳源、所述氮源、KH2PO4、MgSO4、CaCl2 和水组成； 所述培养基优选为如下(a)至(d)中任一所述的培养基(a)将所述碳源10g-50g、氮源 IOg^KH2PO4 5g、MgS04.7H20 0. 3g 和 CaCl2 0. 3g 溶于水并用水定容至IL得到的培养基； (b)将所述碳源和基础培养液甲混合得到的培养基；所述基础培养液甲的制备方法为将所述氮源10g、KH2P04 5g、MgS04 *7H20 0. 3g和CaCl2 0. 3g溶于水并用水定容至IL得到的培养基；所述培养基的初始含水量为70-90% ； (c)将所述碳源、所述氮源和基础培养液乙混合得到的培养基；所述基础培养液乙的制备方法为将CaCl2 0. 3g、KH2PO4 5g、MgSO4 7H20 0. 3g和吐温-80 0. 34g溶于水并用水定容至IL ;所述培养基的初始含水量为30-75% ;所述碳源和所述氮源的质量比为5:1;(d)将所述碳源10g-50g、所述氮源 10g、KH2PO4 5g、MgSO4 7H20 0. 3g 和 CaCl2O. 3g 溶于水并用水定容至2. 5L得到的培养基。
4.一种制备3 -葡聚糖酶和/或凝乳酶的方法，是采用权利要求2或3所述培养基发酵权利要求1所述米黑根毛霉，得到P-葡聚糖酶和/或凝乳酶。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述方法为如下(I)至(5)中的任意一种 (1)采用权利要求3的(a)所述培养基50°C振荡发酵权利要求1所述米黑根毛霉，得到葡聚糖酶；所述发酵的时间为I天以上，优选为1-6天，最优选为3-5天； (2)采用权利要求3的(b)所述培养基50°C静置发酵权利要求1所述米黑根毛霉，得到葡聚糖酶；所述发酵的时间为I天以上，优选为1-6天，最优选为3-5天； (3)采用权利要求3的(c)所述培养基37°C静置发酵权利要求1所述米黑根毛霉，得到凝乳酶；所述发酵的时间为I天以上，优选为1-6天，最优选为2天； (4)采用权利要求3的(a)所述培养基37°C振荡发酵所述米黑根毛霉CAU432，得到凝乳酶；所述发酵的时间为I天以上，优选为1-6天，最优选为3-5天； (5)在发酵罐中采用权利要求2的(d)所述培养基发酵权利要求1所述米黑根毛霉，得到￠-葡聚糖酶；所述发酵的条件为40-55°C、通气量为l-2vvm、搅拌速率为300-600rpm、发酵时间为IOh以上。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于 所述方法⑴和/或所述方法(5)还包括如下步骤将所述发酵得到的发酵液`10000 Xg冷冻离心lOmin，取上清液，即为含有P -葡聚糖酶的溶液； 所述方法(2)还包括如下步骤将所述发酵得到的固体发酵物加入50mM pH 6. 0柠檬酸缓冲液，室温下200rpm震荡浸提2h，10000X g冷冻离心lOmin，取上清液，即为含有^-葡聚糖酶的溶液； 所述方法(3)还包括如下步骤将所述发酵得到的固体发酵物加入去离子水，37°C、200rpm震荡浸提2h，IOOOOrpm冷冻离心lOmin，取上清液，即为含有凝乳酶的溶液； 所述方法(4)还包括如下步骤将所述发酵得到的发酵液IOOOOrpm冷冻离心lOmin，取上清液，即为含有凝乳酶的溶液。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述方法(I)和/或所述方法(2)和/或所述方法(5)还包括如下步骤将所述含有3 -葡聚糖酶的溶液依次进行硫酸铵沉淀、DEAE52弱阴离子交换层析和QSFF强阴离子交换层析，得到纯化后的P -葡聚糖酶。
8.权利要求4至7中任一所述方法得到的P-葡聚糖酶或凝乳酶。
9.权利要求8所述P-葡聚糖酶作为P -葡聚糖酶的应用。
10.权利要求8所述凝乳酶作为凝乳酶的应用。
全文摘要
本发明公开了一种米黑根毛霉菌株及其在制备β-葡聚糖酶和凝乳酶中的应用。本发明提供的米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)CAU432，其保藏编号为CGMCC No.4967。本发明所提供的菌株米黑根毛霉CAU432耐热性好，且菌种稳定性好，产酶高，发酵成本低(利用的碳源和氮源易于购买，价格便宜)，生产周期短，适宜应用于工业化生产领域，具有较好的工业化应用前景。
文档编号C12N1/14GK103045485SQ20111031230
公开日2013年4月17日 申请日期2011年10月14日 优先权日2011年10月14日
发明者江正强, 唐艳斌, 崔健, 闫巧娟, 杨绍青 申请人:中国农业大学