总状毛霉的新应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及总状毛霉在水解大豆异黄酮产生游离型苷元中的应用。本发明还提供了总状毛霉水解大豆异黄酮产生游离型苷元的方法。本发明提供了总状毛霉在水解大豆异黄酮产生游离型苷元中的新用途，酶解效率高，可用于制备大豆异黄酮的游离型苷元，为游离型苷元的制备开拓了一条新思路，具有广阔的应用前景。
【专利说明】总状毛霉的新应用
【技术领域】
[0001]本发明属于微生物领域，涉及一种总状毛霉的新应用，特别涉及总状毛霉在水解大豆异黄酮产生游离型苷元中的应用。
【背景技术】
[0002]大豆异黄酮具有防癌，防骨质疏松症，改善妇女更年期综合症，防心血管疾病等诸多生理功能，是近年来世界各国科学家研究的热点。大豆中的大豆异黄酮近99%是以β-葡萄糖苷形式存在，只有1%左右为游离型苷元。糖苷型的活性低，很难被人体直接吸收，必须要经过人体微生物的水解作用生成苷元形式才易被吸收。体外实验也表明，大豆异黄酮苷元比大豆异黄酮苷具有更好的雌激素样生物活性。因此，将结合型糖苷水解成游离型苷元是提高大豆异黄酮生理活性一个有效的手段。目前常用水解方法主要有酸水解、碱水解、酶水解。大豆异黄酮苷虽然可在碱性条件下水解成相应的苷元和葡萄糖，但碱水解所得到的大豆异黄酮苷元很不稳定，容易降解。酸水解效率虽高，但工业化生产条件要求严格，增加了基础建设的投资。相对而言酶水解条件比较温和，但单纯通过应用工业酶法生产苷元的成本都很昂贵。β_葡萄糖苷酶是广泛存在于人的消化道、植物和400多种微生物中的一种酶，可以水解异黄酮成为苷元。大豆自身也含有葡萄糖苷酶，但水解活性不强。但利用微生物发酵的方法可以提高大豆自身β_葡萄糖苷酶的活性，发酵不影响总异黄酮含量同时直接产生苷 元，该法可大幅度降低成本，为工业化生产提供便利条件。
[0003]目前报道的可以产生游离苷元的微生物有:浅玫瑰链霉菌、红色糖多孢菌、灰色链霉菌、黑曲霉等。总状毛霉是真核类微生物，可以分泌蛋白酶，目前已经发现总状毛霉可以用于制备腐乳，以及具有转化留体药物中间体的功能，国内外文献中尚未见总状毛霉在大豆异黄酮转化方面的相关报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供了一株总状毛霉的新应用，用于水解大豆异黄酮产生游离型苷元。
[0005]本发明的第二目的是提供总状毛霉水解大豆异黄酮产生游离型苷元的方法。
[0006]本发明通过以下技术方案来实现:
一、一株总状毛霉在水解大豆异黄酮产生游离型苷元中的应用。
[0007]本发明中所采用的总状毛霉CK racemosus) ACCC 0401,由中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物保藏中心(简称ACCC)鉴定。
[0008]二、上述的总状毛霉水解大豆异黄酮产生游离型苷元的方法，该方法包括以下步骤:
(O总状毛霉的发酵；将总状毛霉在无菌的条件下接入斜面培养基，30°c培养72h。种子培养:无菌条件下将斜面菌种接入种子培养基，30°C,摇床160 r.mirT1,培养48h。发酵培养:将液体种子培养基接入发酵培养基中，摇床160 r.min'SOt:培养72h。[0009] (2)发酵后的总状毛霉破碎，45°C水浴浸提1.5h，压滤取滤液，4°C条件下低温离心20min，获得含有β -葡萄糖苷酶的总状毛霉菌体；
(3)加入大豆异黄酮，每100mg大豆异黄酮添加50-250mg的总状毛霉菌体，在pH5.0-6.5，温度30-60 °C的条件下水解2_4 h以产生游离型苷元。
[0010]进一步的，所述的步骤(3)中的水解时间为3.59 h，以期达到更好的水解效果。
[0011]进一步的，所述的步骤(3)中的pH为6.1，以期达到更好的水解效果。
[0012]进一步的，所述的步骤(3)中的总状毛霉菌体的用量为每IOOmg大豆异黄酮添加115mg的总状毛霉菌体，以期达到更好的水解效果。
[0013]进一步的，所述的步骤(3)中的水解温度46 °C，以期达到更好的水解效果。
[0014]进一步的，上述的总状毛霉水解大豆异黄酮产生游离型苷元的方法，该方法包括以下步骤:
(1)总状毛霉的发酵；
(2)发酵后的总状毛霉破碎，45°C水浴浸提1.5h，压滤取滤液，4°C条件下低温离心20min,获得含有β -葡萄糖苷酶的总状毛霉菌体；
(3)加入大豆异黄酮,每IOOmg大豆异黄酮添加115mg的总状毛霉菌体,在pH6.1,温度46 °C的条件下水解3.59 h以产生游离型苷元。
[0015]采用上述技术方案的积极效果:本发明提供了总状毛霉在水解大豆异黄酮产生游离型苷元中的新用途，酶解效率高，可用于制备大豆异黄酮的游离型苷元，为游离型苷元的制备开拓了一条新思路，具有广阔的应用前景。
【具体实施方式】
[0016]本发明中生物材料的来源说明:
1、总状毛霉(私racemosus)kCCC 0401:总状毛霉对4-烯-3-酮甾体的生物转化研究，葛文中，李楠，单丽红，刘宏民，微生物学报，2007年6月4日第47卷第3期，540-543页，该菌种由黑龙江八一农垦大学生命科技学院葛文中老师赠送给本 申请人:，并由 申请人:保证从本申请日起二十年内向公众发放该生物材料。
[0017]2、黑曲霉ATCC16404、黄绿木霉ACCC30169购于上海复祥生物科技有限公司。
[0018]下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但不应理解为对本发明的限制:
实施例1
本实施例说明总状毛霉菌体的获取。
[0019]将总状毛霉在无菌的条件下接入斜面培养基，30°C培养72h。种子培养:无菌条件下将斜面菌种接入种子培养基，30°C，摇床160 r.min—1，培养48h。发酵培养:将液体种子培养基接入发酵培养基中，摇床160 r.mirT1，30°C培养72h。
[0020]其中，斜面培养基:马铃薯浸粉5g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，121°C灭菌20min。种子培养基:可溶性淀粉2%，葡糖糖1%，磷酸二氢钾0.1%,硫酸镁0.1%,酵母膏0.5%，硝酸钠0.2%，121。。灭菌20min。产酶发酵培养基:脱脂豆柏4%，麸皮2%，蛋白胨0.1%，硫酸铵0.1%，磷酸二氢钾0.1%，醋酸钠0.1%，抗坏血酸0.1%，硫酸镁0.1%，121°C灭菌20mino[0021]将上述发酵后的总状毛霉发酵液连同菌丝磨碎打浆，于45°C水浴浸提1.5h，压滤取滤液，于4°C条件下低温离心20min，获得含有β -葡萄糖苷酶的总状毛霉菌体。
[0022]实施例2
将实施例1制备的含有β-葡萄糖苷酶的总状毛霉菌体稀释成浓度为5mg.mL—1，然后称取IOOmg大豆异黄酮粉，加入含有β -葡萄糖苷酶的总状毛霉菌体IOml,即50mg的总状毛霉菌体，在PH5.5，水解温度50 V的条件下水解2 h，将上述水解液取出煮沸灭酶活，滤纸过滤，用乙酸乙酯萃取两次，然后用旋转蒸发仪蒸发后，加入5ml色谱甲醇，然后将其混合，放入IOml容量瓶中定容。取适量经过滤器过滤，上机检测。色谱柱为kromasilC18column 柱(4.6mmX 150mm, 5um);流动相:甲醇-水(30: 70)，流速为 1.0Oml
?mirT1,检测波长为260nm,柱温为25°C。进样量:10μ1,保留时间为IOmin,对大豆异黄酮苷元进行测定，得到苷元浓度为18.32mg.mL'
[0023]实施例3
将实施例1制备的含有β-葡萄糖苷酶的总状毛霉菌体稀释成浓度为5mg.mL—1，然后称取IOOmg大豆异黄酮粉,加入含有β -葡萄糖苷酶的总状毛霉菌体30ml,即150mg的总状毛霉菌体，在PH6.5，水解温度60 V的条件下水解2.5 h，将上述水解液取出煮沸灭酶活，滤纸过滤，用乙酸乙酯萃取两次，然后用旋转蒸发仪蒸发后，加入5ml色谱甲醇，然后将其混合，放入IOml容量瓶中定容。取适量经过滤器过滤，上机检测。色谱柱为kromasilC18column 柱(4.6mmX 150mm, 5um);流动相:甲醇-水(30: 70),流速为 1.0Oml
?mirT1,检测波长为260nm,柱温为25°C。进样量:10μ1,保留时间为IOmin,对大豆异黄酮苷元进行测定，得到苷元浓度为21.51mg.mL'
[0024]实施例4
将实施例1制备的含有β-葡萄糖苷酶的总状毛霉菌体稀释成浓度为5mg.mL—1，然后称取IOOmg大豆异黄酮粉,加入含有β -葡萄糖苷酶的总状毛霉菌体23ml,即115mg的总状毛霉菌体，在PH6.1，水解温度46 V的条件下水解3.59 h，将上述水解液取出煮沸灭酶活，滤纸过滤，用乙酸乙酯萃取两次，然后用旋转蒸发仪蒸发后，加入5ml色谱甲醇，然后将其混合，放入IOml容量瓶中定容。取适量经过滤器过滤，上机检测。色谱柱为kromasilC18column 柱(4.6mmX 150mm, 5um);流动相:甲醇-水(30: 70)，流速为 1.0Oml
?mirT1,检测波长为260nm,柱温为25°C。进样量:10μ1,保留时间为IOmin,对大豆异黄酮苷元进行测定，得到苷元浓度为24.58 mg.mL'
[0025]实施例5
将实施例1制备的含有β-葡萄糖苷酶的总状毛霉菌体稀释成浓度为5mg.mL—1，然后称取IOOmg大豆异黄酮粉，加入含有β -葡萄糖苷酶的总状毛霉菌体50ml,即250mg的总状毛霉菌体，在PH5.0，水解温度40 °C的条件下水解4 h，将上述水解液取出煮沸灭酶活，滤纸过滤，用乙酸乙酯萃取两次，然后用旋转蒸发仪蒸发后，加入5ml色谱甲醇，然后将其混合，放入IOml容量瓶中定容。取适量经过滤器过滤，上机检测。色谱柱为kromasilC18column 柱(4.6mmX 150mm, 5um);流动相:甲醇-水(30: 70)，流速为 1.0Oml
?mirT1,检测波长为260nm,柱温为25°C。进样量:10μ1,保留时间为IOmin,对大豆异黄酮苷元进行测定，得到苷元浓度为22.6 mg.mL'
[0026]实施例6将实施例1制备的含有β-葡萄糖苷酶的总状毛霉菌体稀释成浓度为5mg.mL—1，然后称取IOOmg大豆异黄酮粉，加入含有β -葡萄糖苷酶的总状毛霉菌体40ml,即200mg的总状毛霉菌体，在PH5.5，水解温度30 V的条件下水解3.5h，将上述水解液取出煮沸灭酶活，滤纸过滤，用乙酸乙酯萃取两次，然后用旋转蒸发仪蒸发后，加入5ml色谱甲醇，然后将其混合，放入IOml容量瓶中定容。取适量经过滤器过滤，上机检测。色谱柱为kromasilC18column 柱(4.6mmX 150mm, 5um);流动相:甲醇-水(30: 70)，流速为 1.0Oml
?mirT1,检测波长为260nm,柱温为25°C。进样量:10μ1,保留时间为IOmin,对大豆异黄酮苷元进行测定，得到苷元浓度为21.91 mg.mL'
[0027]由实施例2-6可得,在水解时间3.59 h,pH6.1,每IOOmg大豆异黄酮添加115mg的总状毛霉菌体，水解温度46 °C的条件下，总状毛霉可以很好的水解大豆异黄酮制备游离型苷元。
[0028]对比例
按照上述方法，在水解时间3.59 h,pH6.1,每IOOmg大豆异黄酮添加115mg的菌体,水解温度46 1:的条件下，对黑曲霉ATCC16404、总状毛霉ACCC 0401、黄绿木霉八01:30169三种菌进行对比实验，以总状毛霉ACCC 0401的效果最佳，水解大豆异黄酮制备游离型苷元的产量为黑曲霉ATCC16404或黄绿木霉ACCC30169的4_5倍，该菌种的新应用为游离型苷元的制备开拓了一条新思路。
【权利要求】
1.一株总状毛霉在水解大豆异黄酮产生游离型苷元中的应用。
2.权利要求1所述的总状毛霉水解大豆异黄酮产生游离型苷元的方法，其特征在于:该方法包括以下步骤: (1)总状毛霉的发酵； (2)发酵后的总状毛霉破碎，45°C水浴浸提1.5h，压滤取滤液，4°C条件下低温离心20min,获得含有β -葡萄糖苷酶的总状毛霉菌体； (3)加入大豆异黄酮，每IOOmg大豆异黄酮添加50-250mg的总状毛霉菌体，在pH5.0-6.5，温度30-60 °C的条件下水解2_4 h以产生游离型苷元。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述的步骤(3)中的水解时间为3.59 h。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述的步骤(3)中的pH为6.1。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述的步骤(3)中的总状毛霉菌体的用量为每IOOmg大豆异黄酮添加115mg的总状毛霉菌体。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述的步骤(3)中的水解温度46°C。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:该方法包括以下步骤: (1)总状毛霉的发酵； (2)发酵后的总状毛霉破碎，45°C水浴浸提1.5h，压滤取滤液，4°C条件下低温离心20min,获得含有β -葡萄糖苷酶的总状毛霉菌体； (3)加入大豆异黄酮,每IOOmg大豆异黄酮添加115mg的总状毛霉菌体,在pH6.1,温度46 °C的条件下水解3.59 h以产生游离型苷元。
【文档编号】C12P17/06GK103923956SQ201410162022
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月22日 优先权日:2014年4月22日
【发明者】李丽阳, 吴志军, 葛文中, 阮洪生 申请人:黑龙江八一农垦大学