一种地龙的dna条形码分子鉴定方法
【专利摘要】本发明公开了一种地龙的DNA条形码分子鉴定方法和其COI序列，使用该方法进行聚合酶链式反应(PCR)扩增出样品COI基因，PCR产物经过琼脂糖胶进行验证后送至生物测序公司进行测序，将测序结果通过手工校对、序列拼接，并与公开序列进行比对，如果与所述基因序列SEQ?ID?NO.1-NO.4的同源性在99％以上，即可判断所述的待测组织即为广地龙或者沪地龙来源。本发明采用可靠的DNA分子鉴定技术，无需对地龙品种进行形态学鉴定，可以快速、准确的鉴定《中华人民共和国药典》规定的地龙品种和非药材地龙品种，此外可以进一步区分广地龙和沪地龙品种，增强了准确性和可靠性，确保地龙作为药材了入药的安全性。
【专利说明】—种地龙的DNA条形码分子鉴定方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及物种鉴定领域，具体涉及地龙的DNA条形码分子鉴定方法。
【背景技术】
[0002]地龙，即蚯蚓，性寒，味微咸，是传统的中药材，而《中华人民共和国药典》2010年版(一部)“地龙”项下收载的仅有环节动物门钜蚓科动物参环毛蚓(Pheretimaaspergillum(E.Perrier))、通俗环毛蝴(Pheretima vulgaris Chen)、威廉环毛虫引(Pheretima.guillelmi (Michaelsen))或木节肓毛虫引(Pheretima pectinifera Michaelsen)的干燥体。前一种习称“广地龙”，后三种习称“沪地龙”。地龙在《神农本草经》被列为下品，具有清热定惊、通络、平喘、利尿的功效。常炒制后用于高热、神昏、惊痫抽搐、关节痹痛、肺热喘咳、尿少水肿、高血压等症。李时珍在《本草纲目》称之为具有通经活络、活血化瘀、预防治疗心脑血管疾病作用。现代研究表明，地龙含有多种药理活性成分，药理作用几乎涉及人体各个系统，主要有抗血栓、溶栓和平喘、抗心律失常、降压、增强免疫、抗溃疡、解热、消炎、镇痛、免疫调节、促进创面愈合、镇静、抗肿瘤等多方面的药理作用，临床应用非常广泛。
[0003]对地龙品种的鉴定是入药的基础，目前中药材地龙的鉴定大多采用的是活体鉴别的方法，主要依据其外部形态和内部构造。但是由于动物类药材大多外部形态相似，组织特征无特异性，而且经过产地粗加工和饮片炮制后，难以看出物种本身的形状和颜色，显微特征也有不同程度的破坏，造成地龙干品鉴别比较困难。因此，亟需寻求一种新的方法，以弥补传统分类方法的缺陷。
[0004]DNA条形码技术(DNA Barcoding)是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析，从而快速、准确地进行物种鉴定的技术。目前在动物中最常用的DNA barcode是细胞色素C氧化酶I号基因(COI)的部分序列。近几年来，DNA条形码技术已被证明是一个行之有效的生物鉴定手段，不仅可对传统鉴定方法作强有力的补充，而且因为其更客观、准确，突破以往对经验的过度依赖，能帮助鉴定物种、发现新种和隐种、重建物种和高级阶元的演化关系等。运用DNA条形码技术，可以很好的对广地龙和沪地龙的品种进行快速、有效的鉴定。
[0005]本发明提供一种地龙的DNA条形码分子鉴定方法，无形态学观察，可以快速准确鉴定《中华人民共和国药典》规定的地龙品种和非药材地龙品种，保证中药原材料的安全性。
【发明内容】
[0006]本发明克服目前以形态学鉴定地龙方法存在的缺陷，提高地龙鉴定结果的准确度，是一种易于操作、灵敏度高的鉴定方法。本发明的技术方案如下:
[0007]首先从采集的地龙样品提取基因组DNA，利用一对引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增出样品一段COI基因，将扩增产物测序，然后进行序列分析比对，建立广地龙和沪地龙的序列标准数据库，在比较数据库DNA的基础上，通过分析聚合酶链式反应的产物结果，根据COI基因序列的差异，从而达到快速、准确鉴定地龙物种的目的。本发明设计的用于《中华人民共和国药典》规定的地龙品种和非药材地龙品种鉴定方法，采用如下步骤:
[0008]1、提取地龙基因组DNA:按常规动物DNA提取方法或者血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒进行DNA提取，并用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到0.1 μ g/μ 1-2 μ g/ μ 10
[0009]2、扩增DNA片段，进行聚合酶链式反应，即用特异的引物进行扩增，引物对序列为
[0010]1X01490:5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'；
[0011 ] HC02198: 5' -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3':
[0012]扩增程序为94°C预变性I分钟，45°C退火1.5分钟，72°C延伸1.5分钟，5个循环94°C变性I分钟，50°C退火1.5分钟，72°C延伸I分钟，35个循环72°C延伸5分钟。
[0013]3、将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，使用DNAmarker检测PCR片段大小。[0014]4、鉴定结果的判断:若出现明显清晰的709bp大小的条带，且无杂带，则可送生物测序公司测序。
[0015]5、将测序结果进行手工校对、序列拼接，如果与所述基因序列SEQ ID N0.1-SEQ IDN0.4，如果与任一序列同源性在99%以上，即可判断所述的待测组织即为上述种属。
[0016]其中，所述的地龙DNA条形码分子鉴定方法采用的是血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒。
[0017]所述引物:
[0018]正向引物为5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'，
[0019]反向引物为5' -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'。
[0020]所使用的DNA聚合酶为pfu高保真酶。
[0021 ] 所述的电泳为I % -2 %的琼脂糖凝胶电泳。
[0022]所述的条带大小需要用DNA maker检测。
[0023]所述的DNA 序列拼接软件包括 CodonCode Aligner、Sequencher> Genious、DNAstar等软件。
[0024]与传统的形态学鉴定方法相比，本发明获得的基因序列有利于实现《中华人民共和国药典》规定的地龙品种和非药材地龙品种的鉴定。
【具体实施方式】
[0025]下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明:
[0026]1、地龙标本的采集与保存:采集的样品来自广西、上海等地。采获的标本经10%酒精麻醉处理约20分钟，再经75%酒精浸泡15分钟处死并保存。
[0027]2、试验样品的前处理:取出保存于75 %酒精中的地龙标本，去内脏，避免内脏内容物的污染，剩余部分用蒸馏水浸泡清洗3次，洗去酒精，取尾部大约20mg解剖剪置入2mlEP管，加入磁珠，震荡粉碎。蛋白酶K56°C温浴I小时，至组织完全溶解。加入350 μ I氯仿:异戊醇(24: I)混匀，10，000Xg室温离心5分钟，小心吸取上清至新的1.5mL EP管中。
[0028]3、DNA模板制备:采用天根生物公司的血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒DNA进行提取，并用灭菌的去离子水将样品的DNA浓度稀释到0.5 μ g/ μ I。
[0029]4、引物合成:本实施例所用引物如下:[0030]正向引物5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'；
[0031]反向引物5' -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'。
[0032]5、PCR扩增本实施例的PCR反应体系如下
[0033]PCR 反应体系为 25μ 1:ddH208.5uL，2XTaq PCR Master Mixl2.5uL，正向引物 /反向引物(2.5umol)各 luL，DNA 模板 2uL2XTaq PCR Master Mix 包含了 Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应的增强剂和优化剂及稳定剂，浓度为2X，且不含染料；扩增程序:反应条件为94°C预变性I分钟，45°C退火1.5分钟，72°C延伸1.5分钟，5个循环94°C变性I分钟，50°C退火1.5分钟，72°C延伸I分钟，35个循环72°C延伸5分钟6、琼脂糖电泳验证PCR结果琼脂糖电泳显示样品扩增良好，条带清晰无杂质，可直接送生物测序公司进行测序。
[0034]6、测序结果序列拼接:将测序结果用CodonCode Aligner生物软件，将序列导入，将引物剪切后将序列组装，然后分别跟SEQ ID N0.1-4进行比对，Hl样品与跟SEQ ID N0.1同源率100%，为广地龙，参环毛蚓，属于《中华人民共和国药典》规定的地龙品种；H2、H3序列与SEQ ID N0.2同源率100%，为沪地龙通俗环毛蚓，属于《中华人民共和国药典》规定的地龙品种；H5、H6、H7样品与SEQ ID N0.3同源率100%，为沪地龙威廉环毛蚓，属于《中华人民共和国药典》规定的地龙品种；H8、H9与与SEQ ID N0.4同源率100%，为沪地龙栉肓毛蚓，属于《中华人民共和国药典》规定的地龙品种。
[0035]本发明所阐述的实施例并不是对本发明的限定，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，任何本领域技术人员根据常规手段可以预见或者微调的变化和改进，均落入本发明的保护范围内。
【权利要求】
1.一种地龙的DNA条形码分子鉴定方法，其特征在于无需对地龙品种进行形态学鉴定，可以快速、准确的鉴定药用地龙品种。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于可以区分鉴定广地龙和沪地龙品种。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于可以区分鉴定沪地龙，包括通俗环毛蚓、威廉环毛蚓和栉肓毛蚓。
4.根据权利要求1所述的方法为DNA条形码分子鉴定方法，其步骤主要包括: (1)从待测的地龙样品组织中分离提取基因组DNA； (2)以步骤(1)所提取的基因组DNA为模板用一对引物，通过聚合酶链式反应扩增； (3)然后取适量步骤(2)的聚合酶链式反应扩增出DNA产物用琼脂糖电泳分离鉴定扩增产物大小，送生物测序公司测序； (4)将测序结果进行拼接，与所述基因序列SEQID N0.1-SEQ ID N0.4的同源性进行比对，同源性在99%以上，即可判断鉴定地龙品种。
5.根据权利要求4所述的引物，其特征在于引物DNA的序列为:
LC01490:5’ -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3’ ；
HC02198:5’ -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’。
6.根据权利要求4所述聚合酶链式反应，其特征在于扩增条件为94°C预变性I分钟，45°C退火1.5分钟，72°C延伸1.5分钟，5个循环；94°C变性I分钟，50。。退火1.5分钟，72°C延伸I分钟，35个循环；72°C延伸5分钟。
7.根据权利要求4所述扩增产物，其特征在于扩增片段为709bp，用1%-2%琼脂糖电泳检测。
8.根据权利要求4所述的地龙DNA条形码标准检测基因序列，其特征在于所述条形码标准检测基因为COI基因，具有如下所述的广地龙参环毛蚓基因序列SEQ ID N0.1 =AACACT
9.根据权利要求4所述的地龙DNA条形码标准检测基因序列，其特征在于所述条形码标准检测基因为COI基因，具有如下所述的沪地龙通俗环毛蚓基因序列SEQ ID N0.2 =GAAT
10.根据权利要求4所述的地龙DNA条形码标准检测基因序列，其特征在于所述条形码标准检测基因为COI基因，具有如下所述的沪地龙威廉环毛蚓基因序列SEQ ID N0.3 =GAAT
11.根据权利要求4所述的地龙DNA条形码标准检测基因序列，其特征在于所述条形码标准检测基因为COI基因，具有如下所述的沪地龙栉肓毛蚓基因序列SEQ ID N0.4 =GAATAG
【文档编号】C12Q1/68GK103898234SQ201410162028
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年4月21日 优先权日:2014年4月21日
【发明者】李振国, 陈艳明, 务勇圣 申请人:牡丹江友搏药业股份有限公司