专利名称：一种陆川猪及其肉制品的dna分子鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种利用DNA分子标记技术鉴定猪品种的方法，具体是一种陆川猪及其肉制品的DNA分子鉴定方法。
背景技术：
陆川猪是我国华南地区的优良猪种，因其原产于广西省东南部的陆川县而得名，现主要分布于广西玉林、梧州、钦州等地区。陆川猪与荣昌猪、太湖猪、东北民猪、金华猪、宁乡猪、淮猪以及八眉猪一起并称“中国八大地方优良猪种”。陆川猪属于小型脂肪型猪种，因其皮薄肉嫩、脆而不腻、味道鲜美、营养丰富而久负盛名。其畜产品可加工成香肠、无皮五花腊肉、白切猪脚、脆皮乳猪、扣肉等制品，深受当地消费者的青睐。但因其饲料率低、饲养周期长，养殖行业出现许多杂交品种，如以陆川猪为母本的二元杂猪和三元杂猪。同时，由于市场上的陆川猪肉价格是普通猪肉价格的好几倍，出现了以假乱真的不良现象。另一方面，巴马香猪和环江香猪也是广西名优猪种，以其乳猪制成的烤香猪和腊香猪肉质细嫩、香甜可口、清甜浓香，深受当地人们喜爱，并且远销国内外市场，出现供不应求的情形。有些不法商贩将陆川乳猪假冒巴马香乳猪和环江香乳猪用于生产烤香猪和腊香猪，产品失去了正宗香猪的原汁原味，出现以次充好的情形。目前尚无行之有效的方法对真品陆川猪肉进行鉴伪。传统上是通过测定猪胴体和肉质特征来评价生鲜肉及其肉制品品质，包括瘦肉率、嫩度、PH值、肉色等。但由于饲养条件和猪个体存在差异，测定过程中对供试样品的采集时间和取样部位有要求，给检测人员工作带来干扰和不便，导致获得的指标数据不稳定不可靠。通过对肉质的研究发现，肉质指标大多没有统一的数值范围，个体差异也比较明显，不能作为鉴定猪品种的依据。DNA分子标记(DNA molecular marker)是以生物大分子的多态性为基础的一种遗传标记，直接反映了 DNA水平遗传多样性。该技术直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织及各个发育阶段均可检测，不受取样部位、年龄、生长条件等的限制。DNA分子标记能够检测到无限的基因座位，数量遍及整个基因组且多态性高。这些优势为DNA分子标记技术拥有广泛的应用性奠定了基础，目前已发展多种分子鉴别技术，包括RFLP技术、RAPD技术、AFLP技术、SSR技术和ISSR技术等。其中ISSR技术和PCR技术联合使用具有很高的特异性和灵敏度且准确快速，广泛应用在食品快速检验领域，如检测转基因成分、动植物种类成分、病原微生物等，在食品溯源如鉴别粮食作物、水果品种、蔬菜品种等领域也有涉及。Heaton通过32个SNP标记对美国牛肉进行了品种的鉴定和亲本分析(HEATON M P, HARHAY G P, BENNETT G L, et al.Selection and use of SNP markers foranimal identification and paternity analysis in U.S.beef cattle[J].MammalianGenome, 2002, 13(5):272-281)。陈冬曾在扩增线粒体12S rDNA基因的基础上，成功的鉴别出了市场上的混合牛肉及其制品，并用该方法鉴定了 24个品牌的牦牛肉干制品(陈冬.基于线粒体12S rRNA基因的PCR-RFLP鉴别混合牛肉及制品的牛种来源研究[D].雅安:四川农业大学，2008)。申请号为201210057485.9发明专利公开了利用ISSR分子标记技术鉴定狼尾草属牧草的方法，公开了引物UBC815和UBC835，快速、准确地区分了 7份狼尾草属牧草材料。但未见国内外应用DNA分子技术区分鉴定陆川猪品种的报道。利用DNA分子标记技术具有多位点性、高变异性、简单而稳定的遗传性和体细胞稳定性等优势，建立可用于鉴伪的陆川猪的特异DNA指纹图谱，开发陆川猪及其肉制品的DNA分子鉴定技术，对规范陆川猪市场，引导深加工企业的健康发展以及维护“陆川猪”品牌形象具有重要的意义。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种陆川猪及其肉制品的DNA分子鉴定方法，能够快速、准确的鉴定陆川猪、陆川猪杂交品种、巴马香猪、环江香猪及其肉制品之间的区别。本发明采用以下技术方案解决上述技术问题:一种陆川猪及其肉制品的DNA分子鉴定方法，包括以下步骤:a、提取生鲜肉 及其肉制品的总DNA ；b、利用ISSR-PCR反应扩增生鲜肉及其肉制品的DNA ；C、构建生鲜肉及其肉制品的DNA电泳图谱；d、鉴定陆川猪及其肉制品。所述ISSR-PCR所用的引物为丽14、丽12和丽29，其中核苷酸序列分别为:5，-CTCCTCCTCGC-3， ；5，-CACCACCACGC-3， ；5，-CTCCTCCTCAT-3，。所述步骤b中的ISSR-PCR反应体系及程序为:25yL体系:模版DNAl μ L、引物2μ L,2XTaq PCR Master Mixl2.5 μ UddH2O 补足 25 μ L，其中 2 X Taq PCR Master Mix 包含了 Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应的增强剂和优化剂及稳定剂，浓度为2X，且不含染料；扩增程序:95°C预变性5min，95°C变性30s，36°C退火30s，72°C延伸2min，循环30次，72°C再延伸5min。所述步骤c中用1.5%的琼脂糖凝胶，IXTAE缓冲液为介质电泳检测扩增结果，根据电泳图绘制电泳图谱。所述陆川猪是指原产于广西壮族自治区东南部的陆川县，现主要分布于广西玉林、梧州、钦州地区，属于小型脂肪型猪种。所述肉制品是指以陆)I丨猪为原料加工制备的扣肉和腊肉制品。所述的陆川猪及其肉制品的DNA分子鉴定方法在鉴定陆川猪生鲜肉及其肉制品与其它猪品种生鲜肉及其肉制品中的应用。所述其它猪品种为长陆二元杂、大陆二元杂、杜长大三元杂、大陆长白三元杂、龙宝猪、三元杂猪、巴马香猪和环江香猪。步骤a所述的提取生鲜肉及其肉制品的总DNA的方法为改良后的SDS法。原方法中冷时使用了液氮、蛋白酶K、25:24:l的酚:氯仿:异戊醇、KAC等试剂，且需在50°C 55°C下温育数小时，操作繁琐，用时长；改进后冷却时直接在冰上研磨样品，代替了加入液氮及温育等步骤，并分别使用饱和酚和24:1的氯仿:异戊醇进行两次抽提，节约了时间，简化了步骤，提高了效率，降低了提取成本。所述构建的电泳图谱，选取ISSR-PCR扩增产物多态性好、条带清晰的电泳图谱作为直观鉴定陆川猪及其肉制品的指纹图谱。本发明突出的实质性特点和显著进步在于:利用DNA分子技术对陆川猪和广西其他猪品种进行分子鉴定，有效解决了陆川猪品源的鉴伪难题。DNA分子技术操作简单、快速准确、多态性丰富、模板需要量少，提高了质检人员的检测工作效率和准确度。所构建的陆川猪特异DNA指纹图谱，非常直观显示陆川猪和广西一些猪品种的基因差异，规范了陆川猪发展市场和深加工企业的经营行为，也对维护“陆川猪”品牌形象具
有重要意义。
图1引物丽14扩增出的陆川猪及其杂交品种生鲜肉的电泳图谱；图2引物丽14扩增出的陆川猪及其杂交品种腊肉的电泳图谱；图3引物丽14扩增出的陆川猪及其杂交品种扣肉的电泳图谱；图4引物丽12扩增出的陆川猪与环江香猪生鲜肉的电泳图谱；图5引物丽12扩增出的陆川猪与环江香猪腊肉的电泳图谱；图6引物丽29扩增出的陆川猪与巴马香猪生鲜肉的电泳图谱；图7引物丽29扩增出的陆川猪与巴马香猪扣肉的电泳图谱；图8以 图1为基础绘制的电泳模式图；图9以图4为基础绘制的电泳模式图；图10以图7为基础绘制的电泳模式图。
具体实施例方式以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。本试验ISSR-PCR反应引物均为自行设计的序列，并由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成。实施例1鉴定区分陆川猪及其肉制品与二元杂猪、三元杂猪及其肉制品选取需鉴定陆川猪、二元杂猪、三元杂猪生鲜肉、腊肉和扣肉样品数份，采用改良的SDS法分别提取各样品的DNA。以丽14为引物，经过ISSR-PCR反应，对各组样品的总DNA进行扩增。ISSR-PCR反应体系为254 1^体系:模版0嫩14 1^、引物24 1^、2父139 PCR Master Mixl2.5μ L,ddH209.5 μ L，其中 2XTaq PCR Master Mix 包含了 Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应的增强剂和优化剂及稳定剂，浓度为2X，且不含染料；扩增程序:95°C预变性5min，95°C变性30s，36°C退火30s，72°C延伸2min，循环30次，72°C总延伸5min。其中Marker为IOObp Plus DNA ladder，加入量为5 μ L，样品加入量均为8μ L。用1.5%的琼脂糖凝胶，I XTAE缓冲液为介质电泳检测扩增结果，电泳图谱如图1、
2、3，以图1为基础绘制的电泳模式图如图8，如各图中箭头所示，杂交猪品种均产生一条较清晰的条带，而陆川猪中无此条带，多次重复验证实验均能证明，证明引物丽14可以作为区分陆川猪和其它杂交品种的有力证据。其中图1中1-6代表六份不同陆川猪生鲜肉样品，9-10代表四份不同长陆二元杂猪生鲜肉样品，11-14代表四份不同大陆二元杂猪生鲜肉样品，15-18代表一份龙宝猪、两份不同杜长大外三元杂猪和一份大陆长白内三元杂猪生鲜肉样品。图2中1-5代表五份不同陆川猪腊肉样品，6-9代表四份不同长陆二元杂猪腊肉样品，10-12代表三份不同大陆二元杂猪腊肉样品，13-15代表一份外三元杂猪，I份龙宝猪和一份大陆长白内三元杂猪的腊肉样品。图3中1-5代表五份不同陆川猪扣肉样品，6-9代表四份不同长陆二兀杂猪扣肉样品，10-12代表三份不同大陆二元杂猪扣肉样品，13-14代表一份外三元杂猪，I份龙宝猪的腊肉样品。釆用NTSYS-pc2.1Oe软件对可辨别扩增条带进行聚类分析，用SimQual程序对原始矩阵求遗传相似系数(Jaccaixl系数)，参见表1，其中LI L6代表陆川猪；C1 C4代表长陆二元杂猪；D1 D4代表大陆二元杂猪；L代表龙宝猪；W1-W2代表外三元杂猪；N代表内三元杂。结果表明陆川猪间Jaccard系数为0.88 1.00，说明陆川猪样品间亲缘关系较近。陆川猪与长陆二元杂猪之间的Jaccard系数为0.63 0.75 ;陆川猪与大陆二元杂猪之间的Jaccaixl系数为0.63 0.75 ;陆川猪与龙宝猪之间的Jaccaixl系数为0.63 0.75 ;陆川猪与外三元杂猪之间的Jaccard系数为0.50 0.63 ;陆川猪与内三元杂猪之间的的Jaccard系数为0.50 0.63，均表明陆川猪与其他杂猪之间差异性较大，亲缘关系相差较远。本发明可准确区分鉴别陆川猪与其他杂猪品种。表I陆川猪与其杂交猪间Jaccard系数矩阵
权利要求
1.一种陆川猪及其肉制品的DNA分子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤: a、提取生鲜肉及其肉制品的总DNA； b、利用ISSR-PCR反应扩增生鲜肉及其肉制品的DNA； C、构建生鲜肉及其肉制品的DNA电泳图谱； d、鉴定陆川猪及其肉制品。
2.如权利要求1所述的陆川猪及其肉制品的DNA分子鉴定方法，其特征在于，所述ISSR-PCR所用的引物为WM14、WM12和WM29，其中核苷酸序列分别为:5’ -CTCCTCCTCGC-3’ ；5’-CACCACCACGC-3’ ；5’-CTCCTCCTCAT-3’ 。
3.如权利要求1所述的陆川猪及其肉制品的DNA分子鉴定方法，其特征在于，所述步骤b中的ISSR-PCR反应体系及程序为:25yL体系:模版DNAl μ L、引物2 μ L、2XTaqPCRMaster Mixl2.5μ L, ddH20 补足 25 μ L，其中 2XTaq PCR Master Mix 包含了 Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应的增强剂和优化剂及稳定剂，浓度为2X，且不含染料；扩增程序:95°C预变性5min，95°C变性30s，36°C退火30s，72°C延伸2min，循环30次，72°C再延伸5min。
4.如权利要求1所述的陆川猪及其肉制品的DNA分子鉴定方法，其特征在于，所述步骤c中用1.5%的琼脂糖凝胶，IXTAE缓冲液为介质电泳检测扩增结果，根据电泳图绘制电泳图谱。
5.如权利要求1所述的陆川猪及其肉制品的DNA分子鉴定方法，其特征在于，所述陆川猪是指原产于广西壮族自治区东南部的陆川县，主要分布于广西玉林、梧州、钦州地区，属于小型脂肪型猪种。
6.如权利要求1所述的陆川猪及其肉制品的DNA分子鉴定方法，其特征在于，所述肉制品是指以陆川猪为原料加工制备的扣肉和腊肉制品。
7.如权利要求1 7任意一项所述的陆川猪及其肉制品的DNA分子鉴定方法在鉴定陆川猪生鲜肉及其肉制品与其它猪品种生鲜肉及其肉制品中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述其它猪品种为长陆二元杂、大陆二元杂、杜长大三元杂、大陆长白三元杂、龙宝猪三元杂猪、巴马香猪和环江香猪。
全文摘要
一种陆川猪及其肉制品的DNA分子鉴定方法，其中ISSR-PCR所用的引物为WM14、WM12和WM29，其核苷酸序列分别为5'-CTCCTCCTCGC-3'、5'-CACCACCACGC-3'和5'-CTCCTCCTCAT-3'。最终绘制了7张陆川猪及其肉制品的电泳图谱，建立了陆川猪及其肉制品的DNA指纹图谱，可作为区分鉴定陆川猪及其肉制品的依据。本发明采用可靠的DNA分子鉴定技术，快速、准确的鉴定了陆川猪、陆川猪杂交品种、巴马香猪、环江香猪及其肉制品之间的区别，促进了陆川猪优势品牌猪的发展。
文档编号C12Q1/68GK103215365SQ20131014909
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月26日 优先权日2013年4月26日
发明者韦保耀, 王淼, 黄丽, 滕建文, 夏宁, 王勤志, 封毅 申请人:广西大学