专利名称：改造重组家蚕核型多角体病毒的基因工程载体的构建方法
技术领域：
本发明涉及基因工程领域中基因工程载体的改造构建，具体涉及对家蚕核型多角体病毒进行基因重组构成基因工程载体的方法。
背景技术：
家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，BmNPV)基因组为共价闭合环状双链DNA，分子量约130kb。该病毒的多角体蛋白基因为病毒复制非必需基因，多角体蛋白基因启动子为外源基因超效表达启动子，可以在该启动子下游插入外源基因构建重组家蚕核型多角体病毒，在家蚕幼虫或蛹体中实现高效表达，因而，该病毒目前已被越来越广泛地用于外源基因的表达。
通常，构建重组家蚕核型多角体病毒要分四步进行。第一步，以核型多角体病毒多角体基因的侧翼序列作为同源臂，构建含有多角体蛋白基因启动子的转移载体；第二步，把外源基因克隆进转移载体，使外源基因在多角体蛋白基因启动子控制之下，构建重组转移载体；第三步，把重组转移载体与家蚕核型多角体病毒基因组DNA一起导入家蚕细胞(共转染)，在细胞内通过同源重组把外源基因插入到病毒基因组中；第四步，通过空斑筛选，获得多角体蛋白基因被外源基因取代的重组家蚕核型多角体病毒。该重组病毒接种家蚕细胞、家蚕(幼虫或蛹)，即可实现外源基因在细胞或虫体中的高效表达。
用上述方法构建的重组病毒不形成多角体，在用家蚕作为生物反应器表达外源基因时，难以通过食下感染蚕体，需花费大量的劳力通过皮下接种；在外源基因表达后期，往往因核型多角体病毒编码的半胱氨酸蛋白酶而导致表达产物的降解，从而影响表达水平；在病毒编码的半胱氨酸蛋白酶和几丁质酶的双重作用下，蚕的体表易破裂，使血淋巴流失，不仅影响表达产物的收获水平，而且会因为细菌的继发性感染，导致表达产物微生物污染的机会增加，影响表达产物的后续加工。
为解决上述问题，使重组家蚕核型多角体病毒更加适合于生产，有必要对常规重组病毒进行改造，考虑到半胱氨酸蛋白酶基因和几丁质酶基因在病毒复制中是非必须的，本发明试图构建使此二基因同时失活并可形成多角体的重组家蚕核型多角体病毒作为基因工程载体，以表达外源基因。
发明内容
本发明目的是提供一种重组家蚕核型多角体病毒的基因工程载体的构建方法，同时提供其在外源基因表达中的应用，以便通过食下感染家蚕，同时提高外源基因的表达水平，减少病毒感染后期由细菌引起的继发感染。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是一种改造重组家蚕核型多角体病毒的基因工程载体的构建方法，包括如下步骤(1)设计引物，采用聚合酶连反应技术分别克隆含家蚕核型多角体病毒的几丁质酶基因编码区片段ChiA和半胱氨酸蛋白酶基因编码区片段CP；(2)将按步骤1获得的ChiA和CP二片段按家蚕核型多角体病毒中几丁质酶基因、半胱氨酸蛋白酶基因在基因组中的组织顺序同时克隆进细菌质粒，构建中间质粒pBmChiA-CP；(3)将带有家蚕核型多角体病毒完整多角体蛋白基因编码区以及启动子的polh片段克隆进按步骤2构建的pBmChiA-CP质粒的ChiA、CP二片段之间，获得改造重组家蚕核型多角体病毒的基因工程载体pBmChiA-polh-CP。
上述技术方案中，所述带有家蚕核型多角体病毒完整多角体蛋白基因编码区以及启动子的polh片段的制备方法是，用限制性内切酶SalI酶切家蚕核型多角体病毒的DNA，回收含有完整多角体蛋白基因编码区以及启动子的1.4kb片段(polh)。
或者，所述带有家蚕核型多角体病毒完整多角体蛋白基因编码区以及启动子的polh片段的制备方法是，通过PCR体外扩增的方法从家蚕核型多角体病毒的DNA中克隆含有完整多角体蛋白基因编码区以及启动子的片段。
上述技术方案中，首先通过PCR技术分别克隆家蚕核型多角体病毒几丁质酶基因、半胱氨酸蛋白酶基因共有启动子区域的侧翼序列，即含有几丁质酶基因编码序列的片段和含有半胱氨酶蛋白酶基因编码序列的片段；从家蚕核型多角体病毒DNA中获得含有完整多角体蛋白基因编码序列及其启动子序列的酶切片段。在此基础上，构建含有几质酶基因编码序列——完整的多角体蛋白基因序列——半胱氨酸蛋白酶基因编码序列结构的基因工程转移载体。
本发明采用下列技术方案来实现外源基因表达中的应用一种改造重组家蚕核型多角体病毒的基因工程载体的应用，将改造重组家蚕核型多角体病毒的基因工程载体与多角体蛋白基因被外源基因取代的重组家蚕核型多角体病毒DNA共转染家蚕细胞，获得几丁酶、半胱氨酸蛋白酶二基因的启动子区域被完整的多角体蛋白基因取代的新的重组病毒，既可通过针刺感染家蚕，也可通过食下感染家蚕，使外源基因在家蚕体内获得高效表达。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点1.用本发明的技术方案构建的基因工程载体与多角体蛋白基因被外源基因取代的重组家蚕核型多角体病毒DNA共转染家蚕细胞，可获得家蚕核型多角体病毒几丁酶、半胱氨酸蛋白酶二基因的启动子区域被完整的多角体蛋白基因取代的新的重组病毒，该新重组病毒同时失活了几丁质酶、半胱氨酸蛋白酶二基因，可形成多角体，明显提高外源基因在细胞和家蚕中的表达水平；新重组病毒感染的蚕体表不易破，有效减少因细菌的继发感染而导致的蚕体腐烂和破皮导致的血淋巴流失，提高外源基因表达产物的收获率。
2.用本发明技术方案构建的新的重组病毒带有多角体，可以通过食下高效感染家蚕，与无多角体重组病毒只能通过皮下接种的方法相比，可大大节省劳动力。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述实施例一改造重组家蚕核型多角体病毒的基因工程载体的构建，包括如下步骤，(1)根据GenBank已公开的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)T3株的核苷酸序列(accession numberL33180)设计引物，它们是ChiA3ATCGGA TCCAAA TAC TGC AG(下划线示BamH I位点)、ChiA5CAG AAT TCA TGTTGT ACA AAT TGT TAA AC(下划线为EcoR I位点)、CP3GCC TCG AGTTAA TAA ATG ACT GCA G(下划线为Xho I位点)、CP5TGA AGC TTGTTG TAA AGA GCG CGG(下划线为HindIII位点)。
(2)以BmNPV DNA为模板，用ChiA3、ChiA5引物进行PCR扩增，将扩增出的几丁质酶基因ChiA片段(约1.7kb)经BamH I、EcoR I双酶切后克隆进pBluescript II SK(+)质粒(Stratagene公司产品)的BamH I、EcoRI位点，从而获得重组质粒pBmChiA；同样，用CP3、CP5引物对BmNPV DNA进行扩增，获得半胱氨酸蛋白酶基因CP片段(约1.0kb)，经HindIII、Xho I双酶切后，克隆进pBmChiA的HindIII、Xho I位点，获中间质粒pBmChiA-CP。
(3)按常规方法，提取BmNPV-DNA，用Sal I酶切后，回收Sal I 1.4kb片段(含有完整的多角体蛋白基因及启动子)，klenow酶补平后，克隆进pBmChiA-CP质粒的EcoR V位点，获得改造重组家蚕核型多角体病毒的基因工程载体pBmChiA-polh-CP-1。
实施例二实施例一获得的基因工程载体的应用将pBmChiA-polh-CP-1载体与多角体蛋白基因被人粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子基因(hGM-CSF)取代的重组家蚕核型多角体病毒(BmNPV-hGM-CSF)DNA共转染家蚕BmN细胞，通过空斑试验，筛选出形成多角体的重组家蚕核型多角体病毒(BmNPV-ChiA--polh+-CP--hGM-CSF+)，在该重组病毒中，多角体蛋白基因取代了BmNPV-hGM-CSF的几丁质酶、半胱氨酸蛋白酶二基因的共同启动子区域，导致几丁质酶、半胱氨酸蛋白酶二基因同时失活，并可形成多角体。
以感染复数为10的BmNPV-ChiA--polh+-CP--hGM-CSF+感染106细胞/mL，一周后用MTT法检测hGM-CSF的表达水平，每mL细胞培养上清中hGM-CSF的生物活性达6.94×105U，而BmNPV-hGM-CSF感染细胞上清中的hGM-CSF的生物活性仪为4.34×104U，表达水平提高了10倍以上，BmNPV-ChiA--polh+-CP--hGM-CSF+感染细胞的存活时间比BmNPV-hGM-CSF的长2天左右。
以106空斑数的BmNPV-ChiA--polh+-CP--hGM-CSF+接种5龄家蚕幼虫，120小时后，取血淋巴测hGM-CSF的活性，每mL血淋巴的表达水平达106U以上，是BmNPV-hGM-CSF的2倍左右。
感染BmNPV-ChiA--polh+-CP--hGM-CSF+的蚕体皮不易破，蚕体不易腐烂，而感染BmNPV-hGM-CSF的蚕破皮泄脓，在感染后期，往往因细菌的继发性感染而导致蚕体腐烂。感染BmNPV-ChiA--polh+-CP--hGM-CSF+的蚕的存活时间比感染BmNPV-hGM-CSF的蚕长1～2天。
以多角体浓度为108/mL的BmNPV-ChiA--polh+-CP--hGM-CSF+涂布桑叶，添食5龄家蚕24小时，有60％以上的蚕可被感染，而BmNPV-hGM-CSF涂布桑叶添食家蚕难以引起感染。
实施例三改造重组家蚕核型多角体病毒的基因工程载体的构建，其中第1、2步骤与实施例1相同，根据GenBank已公开的家蚕核型多角体病毒(BmNPV)T3株的核苷酸序列(accession numberL33180)设计特异性PCR引物对(引物1CGGTATGTACAGGAAGAGG，引物2GGCGGACGTGTTAGTCGAC)，以家蚕核型多角体病毒的DNA为模板，进行PCR扩增，获得含有完整多角体蛋白基因编码区以及启动子的polh片段，克隆进pBmChiA-CP质粒的EcoRV位点，获得改造重组家蚕核型多角体病毒的基因工程载体pBmChiA-polh-CP-2。
权利要求
1.一种改造重组家蚕核型多角体病毒的基因工程载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤(1)设计引物，采用聚合酶连反应技术分别克隆含家蚕核型多角体病毒的几丁质酶基因编码区片段ChiA和半胱氨酸蛋白酶基因编码区片段CP；(2)将按步骤1获得的ChiA和CP二片段按家蚕核型多角体病毒中几丁质酶基因、半胱氨酸蛋白酶基因在基因组中的组织顺序同时克隆进细菌质粒，构建中间质粒pBmChiA-CP；(3)将带有家蚕核型多角体病毒完整多角体蛋白基因编码区以及启动子的polh片段克隆进按步骤2构建的pBmChiA-CP质粒的ChiA、CP二片段之间，获得改造重组家蚕核型多角体病毒的基因工程载体pBmChiA-polh-CP。
2.根据权利要求1所述的改造重组家蚕核型多角体病毒的基因工程载体的构建方法，其特征在于带有家蚕核型多角体病毒完整多角体蛋白基因编码区以及启动子的polh片段的制备方法是，用限制性内切酶SalI酶切家蚕核型多角体病毒的DNA，回收含有完整多角体蛋白基因编码区以及启动子的1.4kb片段(polh)。
3.根据权利要求1所述的改造重组家蚕核型多角体病毒的基因工程载体的构建方法，其特征在于带有家蚕核型多角体病毒完整多角体蛋白基因编码区以及启动子的polh片段的制备方法是，通过PCR体外扩增的方法从家蚕核型多角体病毒的DNA中克隆含有完整多角体蛋白基因编码区以及启动子的片段。
4.一种改造重组家蚕核型多角体病毒的基因工程载体的应用，其特征在于将改造重组家蚕核型多角体病毒的基因工程载体与多角体蛋白基因被外源基因取代的重组家蚕核型多角体病毒DNA共转染家蚕细胞，获得几丁酶、半胱氨酸蛋白酶二基因的启动子区域被完整的多角体蛋白基因取代的新的重组病毒，通过食下感染家蚕，使外源基因在家蚕体内获得高效表达。
全文摘要
本发明公开了一种改造重组家蚕核型多角体病毒的基因工程载体构建方法，其步骤包括PCR分别克隆病毒的ChiA片段和CP片段；将该二片段同时克隆进细菌质粒，构建中间质粒；将带有家蚕核型多角体病毒完整多角体蛋白基因编码区以及启动子的片段克隆进中间质粒内，获得改造的常规重组家蚕核型多角体病毒的基因工程载体。该载体与多角体蛋白基因被外源基因取代的重组家蚕核型多角体病毒DNA共转染家蚕细胞，可获得同时失活了几丁酶、半胱氨酸蛋白酶二基因的、可形成多角体的新重组病毒。新重组病毒在细胞和家蚕中表达外源基因的水平有明显提高，明显减少病毒感染后期由细菌所引起的继发感染，并可通过食下高效感染家蚕。
文档编号C12N15/09GK1673379SQ20051003770
公开日2005年9月28日 申请日期2005年1月25日 优先权日2005年1月25日
发明者贡成良, 曹广力, 薛仁宇, 魏育红, 朱越雄, 沈卫德 申请人:苏州大学