专利名称：一种呼吸道病原体的实时荧光聚合酶链式反应检测方法
技术领域：
本发明涉及七种呼吸道传染病的病原体实时荧光聚合酶链式反应(PCR)检测方法及其试剂盒。这七种病原体包括A型流感病毒(Influenza.A)，B型流感病毒(Influenza.B)，呼吸道合胞病毒(RSV)，肠道病毒(EV)，肺炎支原体(MP)，肺炎衣原体(CP)，呼吸道腺病毒(ADV)。
背景技术：
呼吸道病原体主要通过呼吸道侵入人体，并随呼吸道分泌物向外传播，侵入另一易感机体引起呼吸道传染性疾病。呼吸道病原体主要通过空气(飞沫、尘埃)传播，而目前尚缺乏有效的大面积空气消毒方法，故其预防重点在于早期发现和在流行前的预防。呼吸道病原体主要包括病毒、致病菌、支原体、衣原体等。主要有Influenza.A，Influenza.B，RSV，EV，M.P，C.P，ADV等。呼吸道传染病的临床表现不特异，上呼吸道感染性疾病的症状主要包括咳嗽、流涕、咽喉不适等呼吸道局部症状和发热、乏力、头痛、肌肉酸痛等全身症状；下呼吸道感染性疾病的初期可见咳嗽、鼻塞等非特异的临床表现。多种病毒性肺炎之间依靠临床症状几乎无法区别，其和衣原体肺炎、支原体肺炎鉴别也比较困难。临床上常用的血液学检查、影像学检查等在相当程度上不能确定所感染的病原体。由于呼吸道传染病的临床表现和常用的辅助检查缺乏明显的特异性，因此存在着在疾病早期病原体诊断不明确的危险因素，从而存在着疾病早期滥用抗生素、生病期延长而增加患者痛苦和经济负担的客观因素。
实时荧光PCR检测方法采用特异性的核酸序列进行呼吸道传染病的病原学诊断，有利于在疾病症状出现的早期就确定引起呼吸道传染病的病原体。有利于在疾病早期针对性进行有效的抗生素治疗，缩短呼吸道传染病的病程，减轻患者的痛苦和经济负担。对呼吸道传染病及时而准确的病原学诊断，有利于对呼吸道传染病的流行病学进行研究，指导在疾病流行的初期进行预防，从而能极大程度的降低呼吸道传染病的流行范围和程度，降低呼吸道传染病对社会的危害。流行性感冒曾发生过多次全球性大流行，第一次世界大战末期(1918～1919)的流行，导致5亿人患病，死者2000万；1946～1947年、1957～1958年与1968～1969年又曾三度流行于全世界，之后由于传染病的预防和控制体制和机构的不断健全，从而极大程度的控制了流感的流行。然而对于一些易感群体(如老人，儿童等)，呼吸道传染病的发病率仍然居高不下，据2004年WHO的报告显示，发展中国家临床肺炎的发病率为0.29次/儿童-年(e/cy)，全球95％以上低龄儿童的临床肺炎发生在发展中国家。
目前临床上常用的呼吸道病原体的检测方法主要是通过检测特异性抗体的方法进行的。由于病原体从进入机体进行复制和抗原刺激到产生抗体需要一定的时间，这种方法仍不能满足早期病原体确诊的需要，从而不能满足早期进行积极治疗的临床需要。荧光实时PCR检测方法通过不同病原体的特异性核酸序列，来对呼吸道传染病进行病原学诊断，在疾病发生发展的早期就可以进行诊断，从而具有显而易见的临床诊断意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种常见呼吸道病原体的早期、有效而简便的检测方法，涉及的病原体包括A型流感病毒(Influenza.A)，B型流感病毒(Influenza.B)，呼吸道合胞病毒(RSV)，肠道病毒(EV)，肺炎支原体(MP)，肺炎衣原体(CP)，腺病毒(ADV)。本发明的另一目的在于提供用于该方法的试剂盒。
本发明在大量分析现有的在GenBank登录的上述七种呼吸道病原体不同型别的基因组全序列的基础上，找出这七种病原体各自所特异的核酸序列，并根据不同病原体的型别，设计了对各自病原体的大多数型别都具有较高灵敏度的特异性引物和探针，提高了临床检测的特异性和灵敏度；这种检测方法同荧光实时PCR相结合，同时发挥了实时荧光PCR检测方法快速简便的性能，实现了本发明的目的。本发明的七种呼吸道病原体的实时荧光PCR检测方法的技术特征在于，对GenBank中的相关序列进行分析，找出特异性和灵敏度都较高的核酸序列，并使用相关软件分析并设计引物和探针，利用引物、探针序列的特异性，结合荧光PCR的方法，从咽拭子中提取出呼吸道病原体的核酸，进行PCR扩增实现临床样本中病原体的检测。
对于该检测方法所配套的试剂盒，所采用的探针和引物的设计顾及到了几乎所有的型别，探针和引物所选择的是核酸片段具有明显的属特异性。所设计的探针采用荧光素FAM(Carboxyfluorescein，羧基荧光素，吸收波长492nm，发射波长518nm，绿色)作为发光基团，采用MGB(Miner groove binder)或BHQ1(Black Hole Quencher 1)作为淬灭基团，所设计的引物都可以采用相同的退火温度55℃。
所涉及的七种待检病原体的核酸序列片段分别为A型流感病毒(Influenza.A)CTGGGAATGCTGAAATTGAAGATCTCATTTTTCTGGCACGGTCTGCACTAATCCTGAGAGGATCAGTGGCCCACAAGTCCTGCTTGCCTGCTTGTGTGTACGGACTTGCAGTGGCCAGTGGATATGAB型流感病毒(Influenza.B)CCAGGGATTGCAGACATTGAAGATCTAACCCTGCTTGCTCGTAGCATGGTCGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCGAGCAAAGTAGTTCTTCCCATAAGCATTTACGCCAAAATACCTCAACTAGGGTTCAATGTTGAAGAGTACTCTATGGTTGGGTACGAAGCCA呼吸道合胞病毒(RSV)TGAACAACCCAAAAGCATCATTATTATCTTTGACTCAATTTCCTCACTTCTCCAGTGTAGTATTAGGCAATGC肠道病毒(EV)GGCTAATCCTAACTGCGGAGCAGGTACCCACGAGCCAGTGGGCAGCCTGTCGTAATGGGCAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCCATTTACTCTTATACTGGCTGCTTATGGTGACAATCACGGAATTGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATC肺炎支原体(MP)
CCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATTTTTCACAATGAGCGAAAGCTTGATGGAGCAATGCCGCGTGAACGATGAAGG TCTTTAAGATTGT肺炎衣原体(CP)TGAAGTCGGAATTGCTAGTAATGGCGTGTCAGCCATAACGCCGTGAATACGTTCTCGGGCCTTGTACACAC腺病毒(ADV)ATGGCCACCCCATCGATGATGCCCCAATGGGCATACATGCACATCGCCGGACAGGATGCTTCGGAGTACCTGAGTCCGGG所涉及的七种待检病原体的引物和探针的序列分别为A型流感病毒引物1TGGCACGGTCTGCACTCA引物2GTACACACAAGCAGGCAAGCA引物3CTGGGAATGCTGAAATTGAAGATC引物4TCATATCCACTGGCCACGGCAAG探针FAM-CCTGAGAGGATCAGTGGCCCACAAGT-BHQ1B型流感病毒引物1ACCCTGCTTGCTCGTAGCAT引物2ATGCTTATGGGAAGAACTACTTTGC引物3CCAGGGATTGCAGACATTGAAGA引物4TGGCTTCGTACCCAACCATAGAGTACT探针FAM-TCGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCG-BHQ1呼吸道合胞病毒引物1TGAACAACCCAAAAGCATCATT引物2GCATTGCCTAATACTACACTGGAGAA探针FAM-CTTTGACTCAATTTCCT-MGB肠道病毒引物1TCAATTGTCACCATAAGCAGCCA引物2GATGGCCAATCCAATAGCTATATGG引物3GGCTAATCCTAACTGCGGAGCA引物4ACTCTGCAGCGGAACCGACT探针FAM-CTTTGGGTGTCCGTGTTT-MGB腺病毒引物1ATGGCCACCCCTTCGATGA引物2CCCGGACTCAGGTACTCCGA探针FAM-TACATGCACATCGCCGG-MGB
肺炎支原体引物1GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT引物2ACAATCTTAAAGACCTTCATCGTTCA探针FAM-TTTTTCACAATGAGCGAAAGCTTGATGGA-BHQ1肺炎衣原体引物1TGAAGTCGGAATTGCTAGTAATGG引物2GTGTGTACAAGGCCCGAGAAC探针FAM-TGTCAGCCATAACGCCGTGAAT-BHQ1本发明的荧光PCR反应对不同的呼吸道病原体有一定的差异，对于RSV，EV，Influenza.A和Influenza.B四种病原体所使用的PCR反应程序是RT-PCR一步法。RT-PCR反应体系中含有相应的RT-PCR反应缓冲液(包括1×RT-PCR反应缓冲液，dNTP，特异性探针以及和各个探针所对应的一对或两对PCR引物)和RT-PCR酶(包括Taq DNA聚合酶，反转录酶)。所述的1×RT-PCR反应缓冲液包括50mmol/LTris-HCl，pH 9.2，50mmol/L KCl，4.0mmol/L MgCl2，10mmol/L DTT；dNTP为0.3mmol/L；探针为0.12μmol/L；巢式PCR内引物为0.6μmol/L；巢式PCR外引物为0.06μmol/L。RT-PCR酶中包括TaqDNA聚合酶1U/0.7μl和反转录酶100U/0.7μl。对于四种RNA病原体均可以采用相同的RT-PCR反应条件第一步37℃ 45min，94℃ 1min；第二步94℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 20s，5次循环；第三步94℃5s，55℃ 35s，40次循环；PCR反应的第三步55℃时进行FAM荧光检测。
对于ADV，MP和CP三种病原体，所需的PCR反应体系中含有相应的PCR反应缓冲液(包括1×，dNTP，特异性探针以及和各个探针所对应的一对上、下游引物)和Taq酶。所述的1×PCR反应缓冲液包括10mmol/L Tris-HCl pH 9.2，50mmol/L KCl，2.5mmol/L MgCl2，5％甘油；dNTP终浓度为0.2mmol/L；探针终浓度为0.12μmol/L；一对PCR上、下游引物终浓度都为0.6μmol/L；Taq酶中包括Taq DNA聚合酶1U/0.2μl。对于三种DNA病原体均可以采用相同的PCR反应条件第一步94C 1min；第二步94℃15s，55℃ 15s，72℃ 20s，5次循环；第三步94℃ 5s，55℃ 35s，40次循环；PCR反应的第三步55℃时进行FAM荧光检测。在ASV，EV，Influenza.A或Influenza.B需要和ADV，MP或CP同时检测的情况下，则可以采用前者的RT-PCR反应条件，即对于需要进行同一或不同样本的多种病原体检测，可以同时进行。
本发明所检测的七种呼吸道病原体核酸样本的获得通过咽拭子采样的方法获得，详见具体实施方式
部分。本发明的测定结果判断是正对应的，即针对样本所检测的病原体有阳性扩增就可以判断为此病原体感染。如果同一样本的多种病原体检测有两个或两个以上的扩增则判断为相应病原体的混合感染。
和现有的呼吸道检测方法相比较，本发明具有明显的优势本发明对临床样本的检测从样本的收集、核酸的抽提、反应体系的配制、程序的运行到得出结果，可以在4个小时内完成，有利于临床标本的快速检测；所选用的引物和探针均顾及到流行的主要型别，并且是各个病原体的特异性核酸片段，因此具有高的灵敏度和特异性，有利于临床上的早期诊断；检测的整个流程主要采用的仪器设备是全自动荧光定量PCR仪、微型离心机以及各种型号的移液器等，主要的试剂均来源于本发明所包括的试剂盒，实验流程少，操作简便易行，消耗费用低；而且本发明的方法从PCR到检测结果的获得采用全封闭式的检测，能有效的避免PCR产物的环境污染。
具体实施例方式
实施例1本发明呼吸道病原体的实时荧光PCR测定方法及其试剂盒。
1试剂盒组成(1)DNA提取试剂包括A液6mol/L异硫氰酸胍，30mmol/L柠檬酸钠，0.58％十二烷基磺酸钠，1mmol/L乙二胺四乙酸二钠，2％糖原；B液异丙醇；C液75％乙醇水溶液；样本稀释液ddH2O。
(2)PCR反应试剂包括每种病原体各自的PCR反应液和酶。
对于RSV，EV，Influenza.A或Influenza.B的PCR反应液(20μl每人份，检测时加入提取的病原体模板5μl，反应液终体积是25μl)组分如下5μl的5×RT反应液(250mmol/L Tris-HCl，pH 9.2，250mmol/L KCl，20mmol/L MgCl2，50mmol/L DTT)；终浓度为0.3mmol/L的dNTP；0.12μmol/L的探针；0.6μmol/L的巢式PCR内引物；0.06μmol/L的巢式PCR外引物；用水填充体积到20μl。酶是RT-PCR酶(Taq DNA聚合酶1U/0.7μl，反转录酶100U/0.7μl)。
对于ADV，M.P或C.P的PCR反应液(20μl每人份，检测时加入提取的病原体模板5μl，反应液终体积是25μl)组分如下2.5μl的1×PCR反应缓冲液(包括10mmol/L Tris-HCl，pH 9.2，50mmol/LKCl，2.5mmol/L MgCl2，5％甘油)；终浓度为0.2mmol/L的dNTP；0.12μmol/L的探针；一对PCR上、下游引物终浓度分别为0.6μmol/L；Taq酶中包括Taq DNA聚合酶1U/0.2μl。
(3)阳性对照和阴性对照试剂盒包括有所涉及的七种呼吸道病原体各自的强阳性对照(Ct＜25)和临界阳性对照(Ct＜30)和阴性对照(Ct＝none)。
2.呼吸道病原体的荧光PCR检测(1)临床标本采集、保存及运输适用于咽拭子标本采集。采集时以清晨为宜。用清水漱口，由检查者用压舌板辅助，将咽拭子越过舌根，到达咽峡部的病变处，反复涂抹数次，取出时避免接触舌及口腔粘膜等处，将取样后的棉拭子放入约1ml的生理盐水中充分洗涤，然后贴壁挤干，丢弃棉拭子。待测标本在4℃保存不应超过24小时，-20℃保存不应超过48小时；-80℃保存不超过三个月。标本运送应采用冰壶或加冰的泡沫箱。
(2)标本处理将待测标本13000rpm离心2分钟后弃上清，留沉淀物及底部溶液共50μl在管内，加抽提A液200μl，盖好盖，用旋涡振荡器充分混匀沉淀物后静止3分钟；开盖加抽提B液250μl，颠倒混匀，台式离心机13000rpm离心10分钟，去上清，尽量吸干或扣干；再加抽提C液200μl，颠倒混匀，13000rpm离心5分钟，吸去上清(用加样枪一次吸干，不要碰到沉淀物)，室温放置5分钟或50℃放置2～5分钟晾干；加入样本稀释液15μl混悬沉淀物，13000rpm离心1分钟，取上清作PCR(因病毒RNA极易降解，请在2小时内进行PCR，如当天不使用，请立即于-80℃保存)。
(3)PCR扩增取出PCR反应液、RT-PCR酶，室温融化后取相应份数(反应液20μl/T，Taq酶0.2μl/T或RT-PCR酶0.7μl/T)混匀，向每个孔内加入混匀的反应液20μl，加入抽提好的模板或对照5μl，盖好盖，将反应管置于全自动荧光PCR检测仪中，参照仪器操作说明设定阴阳性对照、待检样品参数进行PCR反应，记录好样品摆放顺序。反应程序设定第一步94℃ 1min或37℃ 45min，94℃ 1min；第二步94℃ 15sec，55℃ 15sec，72℃ 20sec，5个循环；第三步94℃ 5sec，55℃ 35sec，40个循环。荧光数设定为FAM，反应程序的第三步55℃时开始检测。
(4)结果判定综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值(Threshold)和基线(Baseline)，使仪器给出正确的结果。阴性对照Ct值为none，强阳性对照的Ct值应小于等于30.0，临界阳性对照的Ct值应小于等于30.0。待检样本的Ct值小于等于35.0为阳性，Ct值大于35.0为阴性。
(5)注意事项实验前请仔细阅读本试剂盒说明书，严格按操作步骤执行。
整个实验操作过程以及PCR实验室的软硬件设施应符合卫生部颁布《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》、《临床基因扩增检验实验室工作规范》等法规的要求。
权利要求
1.一种呼吸道病原体的实时荧光聚合酶链式反应检测方法，包括以下步骤a.根据七种病原体的待检靶基因特异性核酸序列设计特异性的引物；b.根据七种病原体的待检靶基因特异性核酸序列位于引物之间的序列设计，合成各自的荧光探针；c.使用步骤a中的引物和步骤b中的探针及其他PCR或RT-PCR成份组成PCR或RT-PCR反应液；d.从待检样本中提取DNA或RNA，加入到PCR主反应液或RT-PCR主反应液中；e.将反应管放在自动荧光PCR仪中进行检测；f.检测程序结束后，综合分析仪器给出的各项数据，设定合理的阈值(Threshold)和基线(Baseline)，使仪器给出正确的结果，进行结果判断。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，这七种呼吸道病原体包括A型流感病毒(Influenza.A)，B型流感病毒(Influenza.B)，呼吸道合胞病毒(RSV)，肠道病毒(EV)，腺病毒(ADV)，肺炎支原体(MP)，肺炎衣原体(CP)。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的引物和步骤b中的探针序列如下引物1TGGCACGGTCTGCACTCA引物2GTACACACAAGCAGGCAAGCA引物3CTGGGAATGCTGAAATTGAAGATC引物4TCATATCCACTGGCCACGGCAAG探针FAM-CCTGAGAGGATCAGTGGCCCACAAGT-BHQ1。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的引物和步骤b中的探针序列如下引物1ACCCTGCTTGCTCGTAGCAT引物2ATGCTTATGGGAAGAACTACTTTGC引物3CCAGGGATTGCAGACATTGAAGA引物4TGGCTTCGTACCCAACCATAGAGTACT探针FAM-TCGTTGTTAGGCCCTCTGTGGCG-BHQ1。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的引物和步骤b中的探针序列如下引物1TGAACAACCCAAAAGCATCATT引物2GCATTGCCTAATACTACACTGGAGAA探针FAM-CTTTGACTCAATTTCCT-MGB。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的引物序列如下引物1TCAATTGTCACCATAAGCAGCCA引物2GATGGCCAATCCAATAGCTATATGG引物4ACTCTGCAGCGGAACCGACT探针FAM-CTTTGGGTGTCCGTGTTT-MGB。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的引物序列如下引物1ATGGCCACCCCTTCGATGA引物2CCCGGACTCAGGTACTCCGA探针FAM-TACATGCACATCGCCGG-MGB。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的引物序列如下引物1GGGAGGCAGCAGTAGGGAAT引物2ACAATCTTAAAGACCTTCATCGTTCA探针FAM-TTTTTCACAATGAGCGAAAGCTTGATGGA-BHQ1。
9.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤a中所述的引物序列如下引物1TGAAGTCGGAATTGCTAGTAATGG引物2GTGTGTACAAGGCCCGAGAAC探针FAM-TGTCAGCCATAACGCCGTGAAT-BHQ1。
10.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤e中的PCR反应条件是第一步37℃ 45min，94℃ 1min；第二步94℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 20s，5次循环；第三步94℃ 5s，55℃ 35s，40次循环；PCR反应的第三步进行FAM荧光检测。
11.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤e中的PCR反应条件是第一步94℃ 1min；第二步94℃ 15s，55℃ 15s，72℃ 20s，5次循环；第三步94℃ 5s，55℃ 35s，40次循环；PCR反应的第三步进行FAM荧光检测。
12.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤f中的结果判断待检样本的Ct值小于等于35.0为阳性，Ct值大于35.0为阴性。
13.一种用于呼吸道病原体荧光PCR检测的试剂盒，包括以下内容a.这七种呼吸道病原体包括A型流感病毒(Influenza.A)，B型流感病毒(Influenza.B)，呼吸道合胞病毒(RSV)，肠道病毒(EV)，腺病毒(ADV)，肺炎支原体(MP)，肺炎衣原体(CP)；b.每种呼吸道病原体荧光PCR检测试剂盒分别包装，分别命名为A型流感病毒(Influenza.A)荧光PCR检测试剂盒，B型流感病毒(Influenza.B)荧光PCR检测试剂盒，呼吸道合胞病毒(RSV)荧光PCR检测试剂盒，肠道病毒(EV)荧光PCR检测试剂盒，腺病毒(ADV)荧光PCR检测试剂盒，肺炎支原体(MP)荧光PCR检测试剂盒，肺炎衣原体(CP)荧光PCR检测试剂盒；c.每种呼吸道病原体荧光PCR检测试剂盒的成份除都含有核酸提取A液，核酸提取B液，核酸提取C液和样本稀释液，每种呼吸道病原体荧光PCR检测试剂盒还含有各自的PCR或RT-PCR反应液，阳性对照，阴性对照和荧光PCR反应所需的Taq酶或RT-PCR酶。
14.按照权利要求13所述的检测试剂盒，试剂盒提供的PCR反应液的其他组分为50mmol/LTris-HCl，pH 9.2；50mmol/L KCl；4.0mmol/L MgCl2；10mmol/L DTT；0.3mmol/L dNTP。
15.按照权利要求13所述的检测试剂盒，试剂盒提供的PCR反应液的其他组分为10mmol/LTris-HCl，pH 9.2，50mmol/L KCl，2.5mmol/L MgCl2，5％甘油；0.2mmol/L dNTP。
全文摘要
本发明涉及一种呼吸道病原体的实时荧光聚合酶链式反应检测方法及其试剂盒。其方法特征在于，对GenBank中登录的相关的呼吸道病原体(包括A型流感病毒，B型流感病毒，呼吸道合胞病毒，肠道病毒，腺病毒，肺炎支原体，肺炎衣原体)的基因组核酸序列进行分析，根据各种病原体特异性和保守性高的碱基的聚集区域设计引物和探针；使用本发明所提供的试剂盒，从咽拭子样品提取病原体核酸；在引物和探针的存在下，在荧光PCR仪中，对提取的病原体核酸进行PCR扩增或RT－PCR扩增，从而实现呼吸道病原体的检测。
文档编号C12Q1/68GK1746319SQ20051003740
公开日2006年3月15日 申请日期2005年9月22日 优先权日2005年9月22日
发明者周荣, 黄茜华, 王海 申请人:广州华银医药科技有限公司