专利名称：一种人卵巢癌多药耐药细胞株的制作方法
技术领域：
本发明属于细胞工程技术领域，涉及一种人类细胞株，具体涉及一种人卵巢癌多药耐药细胞株及其建立方法。
背景技术：
在女性生殖器官恶性肿瘤中，卵巢癌发病率居第3位，病死率居第I位。这是因为大多数卵巢癌发病隐匿，且缺乏有效准确的早期诊断方法，约70% 80%患者一经确诊已属晚期。化学药物是治疗人类恶性肿瘤的重要手段之一，然而由于肿瘤细胞耐药性常常限制了疗效进一步提高，并最终使治疗失败。肿瘤多药耐药(multidrug resistance,MDR)是肿瘤细胞免受药物攻击的重要细胞防御机制，是指肿瘤细胞对一种化疗药物耐药的同时也对与其结构无关、作用机制不同的其他药物产生交叉耐药的现象。克服肿瘤多药耐药性，寻找逆转恶性肿瘤细胞多药耐药的新途径，提高肿瘤细胞对化疗的敏感性是当前肿瘤领域的重要课题之一。成功建立耐药肿瘤细胞模型是开展此研究的前提和基础。瘤细胞耐药株的建立·方法通常有两种，一是逐步增加药物浓度、持续诱导法，二是大剂量冲击法。通过耐药细胞株的建立可以进一步构建体内外肿瘤耐药模型，从而深入研究MDR耐药机制，甚至发现其他新的耐药机制。通过耐药细胞株的建立的体内外肿瘤耐药模型，可以用于抗肿瘤药物的筛选。通过检索发现，目前国内外还没有关于以人卵巢癌细胞株H0-8910为诱导对象，建立人卵巢癌多药耐药细胞株H0-8910/VP16的文献报道。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种人卵巢癌多药耐药细胞株及其建立方法。本发明的细胞株具有典型多药耐药特性，为进一步研究耐药逆转途径提供了实验基础。本发明的目的是这样实现的:本发明采用人卵巢癌细胞株H0-8910为诱导对象，前期诱导采用大剂量冲击法，后期诱导采用持续诱导法，建立了人卵巢癌多药耐药细胞株H0-8910/VP16。该细胞株已经于2012年12月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CGMCC N0.7052。具体地，本发明涉及的人卵巢癌多药耐药细胞株H0-8910/VP16是按照如下方法
建立获得:(I)人卵巢癌细胞株H0-8910用培养液(含10%小牛血清的RPM1-1640培养液)，5% C02，37°C条件下，培养至70% 90%贴壁率时，去上清，加入VP161000ng/ml冲击培养I小时，去VP16100ng/ml培养液，空白RPM1-1640培养液洗涤2次后，更换增殖培养液培养72-96h扩增存活细胞。至存活细胞扩增至70% 90%贴壁率时，再重复用VP161000ng/ml培养液冲击培养I小时9次，即总共完成10次氟尿嘧啶1000ng/ml紫杉醇培养液冲击培养I小时，进一步以此细胞为基础，1000ng/ml持续培养7天。(2)重复上述操作，将筛选条件依次改为VP16200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml培养液。本发明通过细胞形态学观察、生长曲线和群体倍增时间测定、药物敏感试验、细胞内Rh-123研究及细胞周期的测定，评价人卵巢癌多药耐药细胞株H0-8910/VP16的生物学特性，结果成功建立了 H0-8910/VP16耐药株，耐药指数为81.602，对顺钼(cDPP)、紫杉醇(Taxol)、长春新碱(YCR)、氟尿嘧啶(5-FU)和阿霉素(Adr)产生了明显的交叉耐药性。
图1为H0-8910、H0-8910/VP16的细胞生长曲线图。图2为H0-8910细胞株的细胞周期3为H0-8910/VP16细胞株的细胞周期4为罗丹明123在H0-8910细胞内的含量5为罗丹明123在H0-8910/VP16细胞内的含量6为本发明H0-8910/VP16细胞株的显微图。
具体实施例方式下面通过实施例进一步说明本发明。本发明的实施例仅仅是用于说明本发明，而不是对本发明的限制，在本发明的构思前提下对本发明方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。实施例1人卵巢癌多药耐药细胞株H0-8910/VP16的诱导建立采用逐步递增VP16浓度、间歇作用的体外诱导法建立人卵巢癌多药耐药细胞株H0-8910/VP16，具体步骤如下:(I)人卵巢癌细胞株H0-8910用培养液(含10%小牛血清的RPM1-1640培养液)，5% C02，37°C条件下，培养至70% 90%贴壁率时，去上清，加入VP161000ng/ml冲击培养I小时，去VP16100ng/ml培养液，空白RPM1-1640培养液洗涤2次后，更换增殖培养液培养72-96h扩增存活细胞。至存活细胞扩增至70% 90%贴壁率时，再重复用VP16100ng/ml培养液冲击培养I小时9次，即总共完成10次氟尿嘧啶1000ng/ml紫杉醇培养液冲击培养I小时，进一步以此细胞为基础，100ng/ml持续培养7天。(2)重复上述操作，将筛选条件依次改为VP16200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml培养液。(3)敏感细胞逐渐死亡，而耐药细胞继续生长。如此反复诱导、换液、传代，历时约6月，最终得到在800ng / mL VP16中稳定生长增殖的耐药株，命名为H0-8910/VP16。将该细胞冻存2月后复苏，在不含5-FU的培养液中反复传代2月以上仍基本保持原来的耐药性。实施例2耐药株形态学观察取对数生长期的人卵巢癌多药耐药细胞株H0-8910/VP16，于倒置显微镜下观察细胞形态，结果如图6所示:细胞形态变大，核皱缩，细胞易堆积成团。实施例3细胞生长曲线测定
细胞消化、计数、配制成浓度为5X103个/mL的细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入100 u L细胞悬液(每孔500个细胞);6孔细胞培养板置于37°C，5%C02培养箱中分别培养2d、4d、6d、8d、IOd ;将96孔板进行MTT染色，入=490nm,测定OD值；每孔加入20 u L MTT(5mg/mL)，在培养箱继续培养4小时；弃去培养基，每孔加入150 u L DMSO溶解，摇床10分钟轻轻地混匀；入=490nm,酶标仪读出每孔的OD值以时间为横坐标、OD值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。H0-8910、H0-8910/VP16的细胞生长曲线见图1。实施例4、PI染色法检测细胞周期用0.25%胰酶消化对数生长期细胞，调节细胞密度为2 X 105/ml，接种于6孔培养板，培养24h ；0.25%胰酶消化，收取细胞；用4°C保存的0.0lM PBS洗涤细胞3次，70%乙醇冰上固定5min, 2000rpm室温离心5min,重悬于冷PBSlml,备用；用流式细胞仪检测,激发波长为488nm，接收波长为575nm。结果显示，H0-8910G1期、S期、G2期细胞分别为58.31%、23.64%、18.05%, H0-8910/VP16G1 期、S 期、G2 期细胞分别为 55.99%,36.51%、14.39%,H0-8910/VP16G1期、G2期细胞减少，S期细胞增多，结果见图2、图3。实施例5流式细胞仪检测罗丹明123蓄积用0.25%胰酶消化对数生长期细胞，调节细胞密度为2 X 105/ml，接种于6孔培养板，培养24h ；0.25%胰酶消化，收取细胞；用4°C保存的0.0lM PBS洗涤细胞3次，收集并调整细胞浓度为1父1071111，每管加入浓度为5呢/1111的罗丹明123500uL，37°C保温30min，500rpm离心2min，去除培养液，再用新培养液洗去细胞外的罗丹明染料，在37 °C保温IOmin,使P-gp糖蛋白功能得以发挥，把药物泵出，再用培养液洗I次，放在冰冷的培养液中待检测，流式细胞仪用488nm的激发光，测试细胞荧光强度。结果见图4、图5。H0-8910细胞荧光强度为7105，H0-8910/VP16细胞荧光强度为105，H0-8910/VP16细胞内的细胞罗丹明123比H0-8910减少。实施例6药物敏感试验细胞消化、计数、 配 制成浓度为I X IO5个/ml的细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入IOOul细胞悬液(每孔IX IO4个细胞)；96孔细胞培养板置于37°C，5%C02培养箱中培养24小时；用完全培养基稀释药物至所需浓度，每孔加入IOOii L相应的含药培养基，(4)96孔细胞培养板置于37°C，5%C02培养箱中培养24小时；将96孔板进行MTT染色，A =490nm,测定OD值；计数各组别抑制率及药物IC50。试验结果参见表I。根据表I的结果可以看出，H0-8910/VP16对依托泊苷、氟尿嘧啶、顺钼、紫杉醇、长春新碱、阿霉素的耐药指数是81.602,5.370,5.746、1.959、16.346、3.153。表I细胞株对各种化疗药物的I C50和耐药指数
权利要求
1.一种人卵巢癌多药耐药`细胞株H0-8910/VP16，保藏号为CGMCC N0.7052。
全文摘要
本发明采用人卵巢癌细胞株HO-8910为诱导对象，采用大剂量冲击法，后采用逐步递增VP16浓度、间歇作用的体外诱导法，建立了人卵巢癌多药耐药细胞株HO-8910/VP16。该细胞株已经于2012年12月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.7052。本发明的细胞株具有典型多药耐药特性，为进一步研究耐药逆转途径提供了实验基础。
文档编号C12N5/09GK103224910SQ201310149009
公开日2013年7月31日 申请日期2013年4月25日 优先权日2013年4月25日
发明者不公告发明人 申请人:南京凯基生物科技发展有限公司