专利名称：生产奇数200bp梯度DNA分子量标准的超级质粒及制备方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学试剂制备和基因工程应用领域，具体说是一种通 过基因工程手段构建的超级质粒及其制备方法，该超级质粒用于使用限制性 内切酶酶切的方法制备奇数200bp梯度DNA分子量标准。
背景技术：
在DNA合成及各种方式的基因操作过程中，需要对合成的或进行操作的 DNA分子大小变化进行监测，常用的方法是通过将待测DNA分子与一种己知分 子量的DNA混合标准物(分子量标准、DNA marker)同时进行电泳，通过比较 待测DNA分子与DNA分子标准在电泳过程中的迁移距离来判断DNA样品分子的 大小。因此，需要制备一些已知分子量的标准DNA混合物。
现有技术中制备标准DNA的方法已有多种方法
化学合成法通过化学反应的方法将4种不同的脱氧核糖核苦酸腺嘌呤 (dATP)，鸟嘌呤(dGTP)，胞喷啶dCTP),胸腺嘧啶(dTTP)结合在一起， 合成目标大小的DNA片段。该方法操作十分繁琐，效率极低，合成的DNA长度 受到严重的限制， 一般可合成DNA的长度不超过400bp，大分子量的DNA片段 无法直接用化学合成法來合成，成本太高，因而不适用DNA分子量的常规制备。
片段连接法先用PCR或者合成的方法获得小分子量的DNA分子(如 100bp)，再用酶促连接反应将小分子DNA—个一个顺序连接起来，形成不同 大小的DNA分子(100 bp、 200 bp、 300 bp、 400 bp、…)。该方法理论上讲 可以制备各种大小的DNA分子，但操作却十分繁琐，可再现性差，无法实现大 规模制备。
聚合酶链反应法DNA聚合酶链反应已广泛用于基因克隆和DNA片般的制 备。目貼国内外已被广泛用來制备DNA分子量标准物。但是该方法费时费力， 其生产能力有限。
酶切法用一种或两种限制性内切酶组合对噬菌体DNA或人工设计的质粒 进行切割，产生不同大小的DNA片段，以作为DNA分子量标准。该方法的优点 是容易大量制备，产率高。但该方法的缺点也很突出酶切产生的DNA片段大 小受到所用的限制性酶种类的限制，其制约因素是人工构建质粒的设计水平。
长期以来，分子生物学试剂与基因工程应用领域，需要一种高水平的人 工构建的超级质粒设计思路，以克服酶切产生的DNA片段大小受到所用的限制 性酶种类的限制，以快速、精确、大量地生产奇数200bp梯度DNA分子量标准。
发明内容
经过长期的实验室研究，本发明恰恰满足了上述需求，其目的在于提 供一种通过基因工程手段构建的、全新的、能够快速、精确、大量地酶切法 生产200bp奇数梯度DNA分子量标准的超级质粒。
本发明能够的进一歩目的在于提供一种生产200bp奇数梯度DNA分子量标准的超级质粒的制备方法。
为了实现上述目的，本发明釆用了以下技术方案
通过PCR的方法以Lambda DNA为模板分别扩增了 300bp、 500bp、 700bp、 900bp、 1500bp、几条片段，其中1500 bp和900 bp通过pfu DNA聚合酶进行扩 增，而300bp-A、 300bp-B、 500 bp、 700 bp分别用Taq DNA聚合酶进行扩增。 然后利用Taq DNA聚合酶的加尾活性对1500 bp和900 bp两条片段加T。再利 用A/T互补的原理在离心管中建立连接体系，利用T4连接酶使500bp、 700bp、 900bp连接成一个500-700-900的单元，同样300 bp-A、 300 bp-B和1500bp连接 成300A-1500-300B的单元。然后通过T/A克隆试剂盒，把上述两个单元分别克 隆到T载体中形成中间载体T579和T3153。
通过Pst I酶切将300A-1500-300B单元从T3153中切出来，并利用核酸纯 化回收试剂盒进行回收和纯化。同时T579载体也被Pst I酶切完全酶切，并利 用小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)进行载体脱磷处理，以防止载体自连。建立合适 的连接体系，把300-1500-300单元连接进脱磷处理的T579载体所得中间载体命 名为pY07200。
所获得的pY07200是一种全新的超级DNA分子量标准质粒。其中含有300 bp、 500 bp、 700 bp、 900 bp、 1500bp、 3000六条片段，其中300bp为双拷贝， 以增强其观察时的荧光强度。质粒pYO7200经EcoRI酶切后可以获得一个由6 条片段组成的200bp奇数DNA分子量标准梯度。同时各条DNA带的浓度(质
量)之间具有一定的比列关系(6: 5: 7: 9: 15: 30)。
本发明的有益效果在于利用成熟的生产工艺和基因工程构建了一种人工超
级质粒，该质粒是一种全新的DNA分子量标准质粒，对该质粒进行切割制备200bp 奇数梯度DNA分子量标准，克服了传统的酶切法产生的DNA片段大小受到所用的 限制性酶种类的限制，容易大量制备，产率高，实现了本发明的目的。
图1是用于生产奇数200bp梯度DNA分子量标准的超级质粒pYO7200图谱。
具体实施例方式
生产奇数200bp梯度DNA分子量标准的超级质粒制备方法，具体包括如下步
骤
1. 通过PCR的方法以LambdaDNA为模板分别扩增300bp、 500bp、 700bp、 900bp、 1500bp、几条片段，其中1500bp和卯0bp通过pfu DNA聚合酶进行扩 增，而300bp-A、 300bp-B、 500 bp、 700 bp分别用Taq DNA聚合酶进行扩增。
2. 利用Taq DNA聚合酶的加尾活性对1500 bp和900 bp两条片段加T。
3. 利用A/T互补的原理在离心管中建立连接体系，利用T4连接酶使500bp、 700bp、900bp连接成一个500-900-700的单元，同样300 bp-A、300 bp-B和1500bp 连接成300A-1500-300B的单元。
4. 通过T/A克隆试剂盒，把上述的500-900-700、 300A-1500-300B两个单元 分别克隆到T载体中形成中间载体T579和T3153。
5. 通过Pst I酶切将300A-1500-300B单元从T3153中切出来，并利用核酸 纯化回收试剂盒进行回收和纯化。同时T579载体也被Pstl酶切完全酶切，并利 用小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)进行载体脱磷处理，以防止载体自连。6.把300-1500-300单元连接进脱磷处理的T579载体获得质粒，命名为 pYO7200。
所获得的pYO7200是一种全新的超级DNA分子量标准质粒。其中含有300 bp、 500 bp、 700 bp、 900 bp、 1500bp、 3000六条片段，其中300 bp为双拷贝， 以增强其观察时的荧光强度。质粒pYO7200经EcoRI酶切后可以获得一个由6 条片段组成的200bp奇数DNA分子量标准梯度。同时各条DNA带的浓度(质
量)之间具有一定的比列关系(6: 5: 7: 9: 15: 30)。
权利要求
1.生产奇数200bp梯度DNA分子量标准的超级质粒，该质粒是一种全新的超级DNA分子量标准质粒，其特征在于其中含有300bp、500bp、700bp、900bp、1500bp、3000bp六条片段；300bp为双拷贝；经EcoR I酶切后可以获得一个由6条片段组成的200bp奇数DNA分子量标准梯度；同时各条DNA带的浓度(质量)之间具有一定的比列关系(6∶5∶7∶9∶15∶30)。
2. 根据权利要求1所述的生产奇数200bp梯度DNA分子量标准的超级质粒 的制备方法，包括通过PCR的方法以Lambda DNA为模板分别扩增300bp、 500bp、 700bp、 900bp、 1500bp、几条片段，其特征在于(1) 对300bp-A、 300bp-B、 500 bp、 700 bp分别通过聚合酶进行扩增；(2) 对1500bp、 900bp分别通过聚合酶进行扩增；(3) 利用Taq DNA聚合酶的加尾活性对1500 bp和900 bp两条片段加T:(4) 利用A/T互补的原理在离心管中建立连接体系，利用T4连接酶使 500bp、 700bp、卯Obp连接成一个500-900-700的单元，同样300bp-A、 300bp-B 和1500bp连接成300A-1500-300B的单元；(5) 通过T/A克隆试剂盒，把上述的500-900-700、 300A-1500-300B两个 单元分别克隆到T载体中形成中间载体T579和T3153;(6) 通过PstI酶切将300A-1500-300B单元从T3153中切出来，并利用核 酸纯化回收试剂盒进行回收和纯化；同时T579载体也被Pstl酶切完全酶切，并 利用小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)进行载体脱磷处理，以防止载体自连；(7) 把300-1500-300单元连接进脱磷处理的T579载体获得质粒pYO7200。
3. 根据权利要求2所述的生产偶数200bp梯度DNA分子量标准的超级质粒 制备方法，其特征在于所述的300bp-A、 300 bp-B、 500 bp、 700bp分别通过 聚合酶进行扩增，具体是指用Taq DNA聚合酶进行扩增。
4. 根据权利要求2所述的生产偶数200bp梯度DNA分子量标准的超级质粒制 备方法，其特征在于所述的1500 bp、 900 bp分别通过聚合酶进行扩增，具体 是指用pfu DNA聚合酶进行扩增。
全文摘要
利用Taq DNA聚合酶的加尾活性和对连接产物的选择性凝胶回收，构建了一种全新的DNA分子量标准生产用的质粒pYO7200，该发明属于分子生物学常用试剂的制备领域。该质粒含有一系列的奇数片段梯度(300bp、500bp、700bp、900bp、1500bp、3000bp)，通过一种限制性内切酶酶切，实现其中所含片段的释放，从而形成一种200bp的核酸分子量标准梯度(DNA marker)。该200bp标准梯度的制备过程包括，生产菌株的转化和发酵培养、目标质粒的大规模制备和纯化、目标质粒的酶切。本发明的特点是能利用成熟的生产工艺和基因工程质粒快速、精确、大量地制备用于DNA分子量标准的一个200bp的奇数梯度。
文档编号C12P19/34GK101575600SQ200810015778
公开日2009年11月11日 申请日期2008年5月7日 优先权日2008年5月7日
发明者叶春江 申请人:济南大学